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1、常用的血细胞分类技术常用的血细胞分类技术1.1.1.1.组织化学或细胞化学染色组织化学或细胞化学染色组织化学或细胞化学染色组织化学或细胞化学染色(histochemical or cytochemic(histochemical or cytochemic staining)staining)2.2.2.2.电子显微镜技术电子显微镜技术电子显微镜技术电子显微镜技术 (electron microscopy)(electron microscopy)3. 3. 流式细胞技术流式细胞技术流式细胞技术流式细胞技术 (flow cytometry)(flow cytometry)4. 4. 单克隆抗体
2、技术单克隆抗体技术单克隆抗体技术单克隆抗体技术 (monoclonal antibody)(monoclonal antibody)5. 5. 免疫探针技术免疫探针技术免疫探针技术免疫探针技术 (immune probe)(immune probe)6. 6.密度梯度离心密度梯度离心密度梯度离心密度梯度离心 (density gradient centrifugation)(density gradient centrifugation)密度梯度离心密度梯度离心n n用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬用一
3、定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，中间或底层，通过重力或离心力场的作用使液或匀浆置于介质的顶部，中间或底层，通过重力或离心力场的作用使液或匀浆置于介质的顶部，中间或底层，通过重力或离心力场的作用使液或匀浆置于介质的顶部，中间或底层，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。细胞分层、分离。细胞分层、分离。细胞分层、分离。n n离心力，离心时间和离子转子因介质和被分离物而已。离心力，离心时间和离子转子因介质和被分离物而已。离心力，离心时间和离子转子因介质和被分离物而已。离心力，离心时间和
4、离子转子因介质和被分离物而已。n n介质介质介质介质( (media)media)的要求：的要求：的要求：的要求： 1.1.能产生密度梯度能产生密度梯度能产生密度梯度能产生密度梯度 2.2.密度高时，粘度不高密度高时，粘度不高密度高时，粘度不高密度高时，粘度不高 3.pH 3.pH 中性或易调为中性中性或易调为中性中性或易调为中性中性或易调为中性 4.4.浓度大时渗透压不大浓度大时渗透压不大浓度大时渗透压不大浓度大时渗透压不大 5.5.对细胞无毒对细胞无毒对细胞无毒对细胞无毒梯度离心常用介质梯度离心常用介质n n蔗糖蔗糖蔗糖蔗糖 ( (Sucrose)Sucrose) 主要的不足表现为：主要的
5、不足表现为：主要的不足表现为：主要的不足表现为： 1. 1. 高渗透压，密度越高渗透压越大，易使被分离物在所在的梯度带因渗高渗透压，密度越高渗透压越大，易使被分离物在所在的梯度带因渗高渗透压，密度越高渗透压越大，易使被分离物在所在的梯度带因渗高渗透压，密度越高渗透压越大，易使被分离物在所在的梯度带因渗 透压不适，而导致被分离物损伤。透压不适，而导致被分离物损伤。透压不适，而导致被分离物损伤。透压不适，而导致被分离物损伤。 2. 2. 分子量过小分子量过小分子量过小分子量过小(342)(342)易使蔗糖渗入到细胞膜进入到细胞质，从而破坏细胞。易使蔗糖渗入到细胞膜进入到细胞质，从而破坏细胞。易使蔗
6、糖渗入到细胞膜进入到细胞质，从而破坏细胞。易使蔗糖渗入到细胞膜进入到细胞质，从而破坏细胞。 3. 3. 高粘性高粘性高粘性高粘性n n盐盐盐盐( (S Saltsalts) ) 常用的有常用的有常用的有常用的有CsCl, K-tartrate CsCl, K-tartrate 和和和和 NaBr, NaBr, 主要不足同蔗糖主要不足同蔗糖主要不足同蔗糖主要不足同蔗糖1 1，2 2。n n多聚蔗糖多聚蔗糖多聚蔗糖多聚蔗糖( (PolysucrosePolysucrose) ) 即所谓的即所谓的即所谓的即所谓的Ficoll, Ficoll, 分子量为分子量为分子量为分子量为400000400000
7、左右，其主要特点为弥补了蔗糖的高渗透压，左右，其主要特点为弥补了蔗糖的高渗透压，左右，其主要特点为弥补了蔗糖的高渗透压，左右，其主要特点为弥补了蔗糖的高渗透压， 但也是密度越高，渗透压越大。最大的弊端是太过粘稠，为蔗糖的好几倍，不但也是密度越高，渗透压越大。最大的弊端是太过粘稠，为蔗糖的好几倍，不但也是密度越高，渗透压越大。最大的弊端是太过粘稠，为蔗糖的好几倍，不但也是密度越高，渗透压越大。最大的弊端是太过粘稠，为蔗糖的好几倍，不 易脱糖。易脱糖。易脱糖。易脱糖。 n n碘化物碘化物碘化物碘化物(Iodinated compounds)(Iodinated compounds) 常用的有：常用
8、的有：常用的有：常用的有：Hypaque(Hypaque(泛影钠泛影钠泛影钠泛影钠) )，Urografin(Urografin(泛影葡胺泛影葡胺泛影葡胺泛影葡胺), Metrizoate(), Metrizoate(甲泛影甲泛影甲泛影甲泛影钠钠钠钠) ) ) )等。等。等。等。n n混合介质混合介质混合介质混合介质(Mixed media)(Mixed media) 常用的有：常用的有：常用的有：常用的有：Ficoll-Paque, Histopaque, Histoprep,LymphoprepFicoll-Paque, Histopaque, Histoprep,Lymphoprep等。
9、等。等。等。n n硅胶硅胶硅胶硅胶( ( ( (Colloidal silicaColloidal silica) ) ) ) 即所谓的即所谓的即所谓的即所谓的percollpercoll，“ “Of all substances tested, none came closer to Of all substances tested, none came closer to providing all the desired characteristics than colloidal silica.”providing all the desired characteristics tha
10、n colloidal silica.” Percoll理化特性理化特性n n平均分子量平均分子量平均分子量平均分子量6106106 6, , 渗透压渗透压渗透压渗透压20 mOsm20 mOsm，密度，密度，密度，密度1.13g/ml.1.13g/ml.n npHpH中性，生理盐水配制的中性，生理盐水配制的中性，生理盐水配制的中性，生理盐水配制的percollpercoll应用液等渗应用液等渗应用液等渗应用液等渗. .n n平均直径平均直径平均直径平均直径10-30nm.10-30nm.n n硅胶经处理后，对细胞无毒性硅胶经处理后，对细胞无毒性硅胶经处理后，对细胞无毒性硅胶经处理后，对细胞无
11、毒性. . （注：硅溶胶对细胞有毒性）（注：硅溶胶对细胞有毒性）（注：硅溶胶对细胞有毒性）（注：硅溶胶对细胞有毒性） 主要是在主要是在主要是在主要是在SiOSiO2 2 coatedcoated一层聚乙烯吡咯烷酮一层聚乙烯吡咯烷酮一层聚乙烯吡咯烷酮一层聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone(polyvinylpyrrolidone，PVP)PVP) A: 0.15M NaCl, 35nmB: 0.25M Sucrose, 30nmPercoll 的使用的使用n n市售原液市售原液市售原液市售原液 1. 100%percoll1. 100%percoll原液原液原液原液 使用时
12、使用时使用时使用时percollpercoll原液原液原液原液:10:10生理盐水生理盐水生理盐水生理盐水=9:1=9:1配制成配制成配制成配制成percollpercoll应用液，再用生应用液，再用生应用液，再用生应用液，再用生理理理理 盐水将盐水将盐水将盐水将percollpercoll应用液调制成各个梯度。应用液调制成各个梯度。应用液调制成各个梯度。应用液调制成各个梯度。 2. 2. 已经用已经用已经用已经用1010生理盐水配制好的生理盐水配制好的生理盐水配制好的生理盐水配制好的percollpercoll应用液应用液应用液应用液 使用时只需用生理盐水将使用时只需用生理盐水将使用时只需用
13、生理盐水将使用时只需用生理盐水将percollpercoll应用液调制成各个梯度即可。应用液调制成各个梯度即可。应用液调制成各个梯度即可。应用液调制成各个梯度即可。n n梯度设置梯度设置梯度设置梯度设置 1. Step gradients(1. Step gradients(不连续梯度不连续梯度不连续梯度不连续梯度) )2. Continuous gradient(2. Continuous gradient(连续梯度连续梯度连续梯度连续梯度) ) (1) (1)高速离心高速离心高速离心高速离心 (2)(2)(2)(2)梯度混合器梯度混合器梯度混合器梯度混合器n n样品的放置样品的放置样品的放
14、置样品的放置 1. 1. 与与与与percollpercoll液混匀液混匀液混匀液混匀 2. 2. 置于梯度顶层置于梯度顶层置于梯度顶层置于梯度顶层 3. 3. 置于梯度底层置于梯度底层置于梯度底层置于梯度底层 需用较大的离心力需用较大的离心力需用较大的离心力需用较大的离心力n n样品的收集样品的收集样品的收集样品的收集Percoll在贝类血细胞分选上的应用在贝类血细胞分选上的应用Separation of European flat oyster, Ostrea edulis, haemocytes Separation of European flat oyster, Ostrea edu
15、lis, haemocytes by density gradient centrifugation and SDS-PAGE by density gradient centrifugation and SDS-PAGE characterisation of separated haemocyte sub-populationscharacterisation of separated haemocyte sub-populations Qing Gang Xue, Renault TristanQing Gang Xue, Renault Tristan Fish & Shellfish
16、 Immunology (2000) 10, 155165 Fish & Shellfish Immunology (2000) 10, 155165n n血细胞样品处理血细胞样品处理血细胞样品处理血细胞样品处理n n上上上上PercollPercoll梯度：梯度：梯度：梯度：10%10%，30%30%，50%50%和和和和70%70% 结果：结果：结果：结果：10/30%10/30%界面处形成一带界面处形成一带界面处形成一带界面处形成一带(P1)(P1)，50/70%50/70%界面处也形成一带界面处也形成一带界面处也形成一带界面处也形成一带(G)(G)。n n上上上上FicollFicoll梯度：梯度：梯度：梯度：5%5%，10%10%，15%15%和和和和20%20% 结果：结果：结果：结果：5/10%5/10%界面处形成一带界面处形成一带界面处形成一带界面处形成一带(F1)(F1)，10/15%10/15%界面处也形成一带界面处也形成一带界面处也形成一带界面处也形成一带(F2)(F2)。n n血细胞染色血细胞染色血细胞染色血细胞染色n nSDS-PageSDS-PageP1GF1 Large hyalinocyteF2 Small hyalinocyte欢迎大家批评和指正！
