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1、目的基因目的基因目的基因需要克隆的需要克隆的DNADNA片片段段建立高效表达系统建立高效表达系统建立高效表达系统建立高效表达系统研究某基因结构和研究某基因结构和研究某基因结构和研究某基因结构和功能的关系功能的关系功能的关系功能的关系研究某基因与研究某基因与研究某基因与研究某基因与疾病的关系疾病的关系疾病的关系疾病的关系确定其表达调控机确定其表达调控机确定其表达调控机确定其表达调控机制和生物学功能制和生物学功能制和生物学功能制和生物学功能目的基因的克隆与基因文库的构建目的基因的克隆与基因文库的构建A PCR法法B 基因文库的构建法基因文库的构建法C 化学合成法化学合成法基因库（基因库（gene
2、poolgene pool） 特定生物体全基因组的集合（天然存在）特定生物体全基因组的集合（天然存在）基因文库（基因文库（gene library or gene bankgene library or gene bank） 从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式存在（人工构建）以克隆的形式存在（人工构建）根据构建方法的不同，基因文库分为：根据构建方法的不同，基因文库分为：基因组文库（含有全部基因）基因组文库（含有全部基因）cDNAcDNA文库（含有全部蛋白质编码的结构基因）文库（含有全部蛋白质编码的结构基因）B.B.B.B.基因文库的构建
3、及目的基因的筛选基因文库的构建及目的基因的筛选基因文库构建的基本战略基因文库构建的基本战略构建基因组文库，材料来自染色体构建基因组文库，材料来自染色体DNADNA构建构建cDNAcDNA文库，材料来自文库，材料来自mRNAmRNA在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段的在不同时段的mRNAmRNA种类不同（即基因的表种类不同（即基因的表达谱不同），因此同种生物体的达谱不同），因此同种生物体的cDNAcDNA文库文库一般还有组织细胞的界定，如肝组织一般还有组织细胞的界定，如肝组织cDNAcDNA文库或胚胎组织文库或胚胎组织cDNAcDNA文库等。很显然
4、，文库等。很显然， cDNAcDNA文库的信息量远小于基因组文库。文库的信息量远小于基因组文库。基因组文库的构建基因组文库的构建基因组基因组DNADNA的制备的制备为了最大限度地保证基因在克隆过程中的完整为了最大限度地保证基因在克隆过程中的完整性，性， 用于基因组文库构建的用于基因组文库构建的DNADNA在分离纯化操在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂。制备的作中应尽量避免过度的断裂。制备的DNADNA分子分子量越大，经切割处理后样品中含有不规则末端量越大，经切割处理后样品中含有不规则末端的的DNADNA片段的比率就越低，重组率和完备性也片段的比率就越低，重组率和完备性也就越高。就越高。鸟枪法
5、克隆目的基因鸟枪法克隆目的基因1. 1. 目的基因组目的基因组DNADNA片断的制备片断的制备超声波处理超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端。片段长度均一，大小可控，平头末端。当染色体当染色体DNADNA上目的基因区域的上目的基因区域的限制性酶切图谱未知限制性酶切图谱未知时，时，采用合适这超声处理强度和时间，可以将切割的采用合适这超声处理强度和时间，可以将切割的DNADNA片段片段控制在一定在大小范围内，其上限是载体的最大装载量，控制在一定在大小范围内，其上限是载体的最大装载量，下限应至少大于目的基因的长度，否则无法在一个重组下限应至少大于目的基因的长度，否则无法在一个重组克隆中获得完
6、整的目的基因。克隆中获得完整的目的基因。一般来说，原核生物的基因长度大都在一般来说，原核生物的基因长度大都在2kb2kb以内，真核生以内，真核生物的基因长度变化很大，最大的基因可达物的基因长度变化很大，最大的基因可达100kb100kb以上，因以上，因而将外源基因片段处理成略小于载体装载量上限的长度而将外源基因片段处理成略小于载体装载量上限的长度始终是正确的，外源始终是正确的，外源DNADNA片段越大，后续筛选的规模越小。片段越大，后续筛选的规模越小。外源外源DNADNA片段很难完整地从重组分子上卸下。片段很难完整地从重组分子上卸下。基因组文库的构建基因组文库的构建鸟枪法克隆目的基因鸟枪法克隆
7、目的基因1. 1. 目的基因组目的基因组DNADNA片断的制备片断的制备全酶切：全酶切：片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开，大小不可控。使目的基因断开，大小不可控。如采用识别序列为如采用识别序列为4 4个碱基对的限制性内切酶（如个碱基对的限制性内切酶（如AluAlu,MboMbo）部分降解染色体）部分降解染色体DNADNA，这些限制性内切酶，这些限制性内切酶的识别顺序在任何生物基因组中频繁出现，因此只要采的识别顺序在任何生物基因组中频繁出现，因此只要采取合适的酶解条件就可能获得大片段的取合适的酶解条件就可能获得大片段的DNADNA
8、分子。分子。DNADNA片段具有粘性末端，可以直接与载体分子拼接。片段具有粘性末端，可以直接与载体分子拼接。基因组文库的构建基因组文库的构建 内切酶识别位点的碱基数内切酶识别位点的碱基数内切酶识别位点的碱基数内切酶识别位点的碱基数影响所切出的产物影响所切出的产物影响所切出的产物影响所切出的产物的长度和随机程度。的长度和随机程度。的长度和随机程度。的长度和随机程度。 4bp4bp的内切酶的内切酶的内切酶的内切酶 平均每平均每平均每平均每4 44 4（256256）bpbp一个切点。一个切点。一个切点。一个切点。 随机程度高。如随机程度高。如随机程度高。如随机程度高。如HaeHae、AluIAlu
9、I、Sau3ASau3A。 6bp6bp的内切酶的内切酶的内切酶的内切酶 平均每平均每平均每平均每4 46 6（40964096）bpbp一个切点。一个切点。一个切点。一个切点。限制性内切酶的选用原则限制性内切酶的选用原则限制性内切酶的选用原则限制性内切酶的选用原则鸟枪法克隆目的基因鸟枪法克隆目的基因1. 1. 目的基因组目的基因组DNADNA片断的制备片断的制备部分酶切：部分酶切：片段长度可控，含有粘性末端，片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整。目的基因完整。如果染色体上如果染色体上DNADNA上目的基因的两侧含有已知的限上目的基因的两侧含有已知的限制性内切酶识别位点，而且两者之间距离不
10、超过制性内切酶识别位点，而且两者之间距离不超过载体装载量的上限，用这一（两）种限制性内切载体装载量的上限，用这一（两）种限制性内切酶全酶解染色体酶全酶解染色体DNADNA片段可能更为有利，所产生的片段可能更为有利，所产生的片段呈非随机化，在某些程度上可以简化后续的片段呈非随机化，在某些程度上可以简化后续的重组和筛选操作。重组和筛选操作。基因组文库的构建基因组文库的构建鸟枪法克隆目的基因鸟枪法克隆目的基因2. 2. 外源外源DNADNA片断的全克隆片断的全克隆根据外源根据外源DNADNA片段的末端性质和大小确定克隆载体，一般片段的末端性质和大小确定克隆载体，一般选择质粒或选择质粒或DNADNA，
11、受体细胞一般选择大肠杆菌。，受体细胞一般选择大肠杆菌。如果如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载体。选，则选择多拷贝克隆载体。如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体，受体细胞选择能使目的基因表达的受体细胞。型载体，受体细胞选择能使目的基因表达的受体细胞。3.重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定抗生素抗性筛选抗生素抗性筛选兰兰-白斑筛选白斑筛选PCR筛选DNA杂交筛选杂交筛选鸟枪法克隆目的基因的局限性鸟枪法克隆目的基因的局限性工作量较大，需要了解目的基因的背
12、景知识工作量较大，需要了解目的基因的背景知识不能获得的最小长度的目的基因不能获得的最小长度的目的基因不能除去真核生物目的基因的内含子结构不能除去真核生物目的基因的内含子结构cDNA文库的构建及目的基因的获得文库的构建及目的基因的获得1、cDNA文库的构建（1）分离提取细胞总RNA（2）mRNA与其他RNA的分离，mRNA仅占总RNA的12%，可利用mRNApoly(A)与其他RNA分开。mRNA与其他RNA的分离(3) 以mRNA为模板反转录合成cDNA的第一条链 mRNA纯化后，加入oligo(dT)作为引物，以提供3-OH引导DNA链的合成， 同时加入逆转录酶和四种dNTP，形成RNA-D
13、NA杂合分子。以以mRNA为模板反转录合成为模板反转录合成cDNA的第一条链的第一条链（4）cDNA第二链的合成第二链的合成 自身引导法自身引导法 获得的双链cDNA 5端会有几对碱基缺失（4） cDNA第二链的合成第二链的合成 置换合成法置换合成法 获得的双链cDNA 5端也会有几对碱基缺失,还会有一小段RNA,但不影响后续的克隆操作。cDNA第二链的合成第二链的合成 引导合成法引导合成法获得的双链cDNA 能保留完整的5端序列cDNA法克隆目的基因的基本战略法克隆目的基因的基本战略（5）双链）双链cDNA的克隆的克隆平头末端直接与载体连接，但插入的片平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法
14、回收段无法回收加装人工接头引入酶切口，以便插入片加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收段回收cDNA法分离目的基因法分离目的基因差异分离差异分离将两种不同组织来源的将两种不同组织来源的mRNAmRNA进行比较，进行比较，用扣除杂交（用扣除杂交（subtractive subtractive hybridization)hybridization)排除相同部分，即共同排除相同部分，即共同表达的那部分表达的那部分mRNAmRNA，选出有差异的、特，选出有差异的、特异表达的异表达的mRNAmRNA，构建成的，构建成的cDNAcDNA文库。文库。因而这种程序较适用于分离克隆新基因，因而这种程序较适用
15、于分离克隆新基因，进而研究其生物学功能。进而研究其生物学功能。对已知序列目的基因的筛选对已知序列目的基因的筛选DNA探针筛选探针筛选：构建的：构建的cDNA文库，每个文库，每个噬菌斑或菌落中含有一个被克隆的噬菌斑或菌落中含有一个被克隆的cDNA片段。然后，利用原位片段。然后，利用原位DNA探针进行筛探针进行筛选目的基因。选目的基因。PCR法筛选法筛选（6）从）从cDNA文库中筛选目的基因文库中筛选目的基因核酸探针筛选核酸探针筛选cDNA文库目的基因文库目的基因未知序列目的基因的筛选未知序列目的基因的筛选（1）从蛋白质寻找基因）从蛋白质寻找基因 早期寻找基因的方法，对特异表达的蛋早期寻找基因的方
16、法，对特异表达的蛋白质进行序列分析，并推测一段核苷酸白质进行序列分析，并推测一段核苷酸序列，合成序列，合成DNA探针，筛选分离相应的探针，筛选分离相应的基因。基因。（2）同源性序列搜索）同源性序列搜索在在Genebank等网站中收录了大量等网站中收录了大量DNA序序列的数据，用同源性比较工具列的数据，用同源性比较工具Blastn软件，软件，搜索基因之间存在着的一些保守序列，搜索基因之间存在着的一些保守序列，可以判断某些新基因的存在。可以判断某些新基因的存在。未知序列目的基因的筛选未知序列目的基因的筛选（3）差示筛选组织特异的）差示筛选组织特异的cDNA是利用一对组织基因表达的差异，筛选是利用一
17、对组织基因表达的差异，筛选出其中一种组织中受某种因素调控表达出其中一种组织中受某种因素调控表达的一种或一组基因。的一种或一组基因。制备两种细胞群体，目的基因在其中一制备两种细胞群体，目的基因在其中一种细胞中表达或高表达，在另一种细胞种细胞中表达或高表达，在另一种细胞中不表达或低表达，然后通过杂交对比中不表达或低表达，然后通过杂交对比找到目的基因。找到目的基因。未知序列目的基因的筛选未知序列目的基因的筛选（4）DNA微列阵技术筛选基因微列阵技术筛选基因把某一生物体内全部已知基因分别点到把某一生物体内全部已知基因分别点到DNA芯芯片上，再用不同发育阶段的片上，再用不同发育阶段的cDNA与之杂交，就
18、与之杂交，就能了解某些基因对特定生长发育阶段的表达情能了解某些基因对特定生长发育阶段的表达情况。况。 建立正常人特定组织、器官的基因芯片，给出建立正常人特定组织、器官的基因芯片，给出 标准杂交信号图。用可疑病人的标准杂交信号图。用可疑病人的cDNA做探针做探针 与之杂交，检查哪些基因的表达受抑制或激活与之杂交，检查哪些基因的表达受抑制或激活 -基因诊断。基因诊断。未知序列目的基因的筛选未知序列目的基因的筛选（5）用抗体筛选目的基因）用抗体筛选目的基因 cDNA应克隆在表达载体中应克隆在表达载体中表达载体有使外源基因表达的必要调控表达载体有使外源基因表达的必要调控部分。如启动子、部分。如启动子、
19、SD序列等。通过表达序列等。通过表达产物与抗体特定的结合来识别和分离目产物与抗体特定的结合来识别和分离目的的cDNA克隆。克隆。未知序列目的基因的筛选未知序列目的基因的筛选用抗体筛选目的用抗体筛选目的cDNA克隆克隆cDNA法克隆目的基因的局限性法克隆目的基因的局限性并非所有的并非所有的mRNAmRNA分子都具有分子都具有polyApolyA结构结构细菌或原核生物的细菌或原核生物的mRNAmRNA半衰期很短半衰期很短mRNAmRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难分离纯化困难仅限于克隆蛋白质编码基因仅限于克隆蛋白质编码基因化学合成法的基本战略化学
20、合成法的基本战略全基因合成全基因合成a.小片段粘接法小片段粘接法根据目的基因全序列，将目的基因分成若干根据目的基因全序列，将目的基因分成若干12-15碱碱基长的小片断，两条互补链分别设计成交错覆盖的基长的小片断，两条互补链分别设计成交错覆盖的两套小片断。两套小片断。容易在退火时发生错配容易在退火时发生错配化学合成法的基本战略化学合成法的基本战略b.补钉延长法补钉延长法将目的基因的一条链分成若干将目的基因的一条链分成若干40-50碱基的片断，碱基的片断，另一条设计成与之交错互补的另一条设计成与之交错互补的20个碱基小片段。个碱基小片段。c.大片段酶促法大片段酶促法根据目的基因的全序列，分别合成根
21、据目的基因的全序列，分别合成40-50碱基长的碱基长的单链单链DNA片段，拼接模块数大幅度减少，适合较片段，拼接模块数大幅度减少，适合较大的基因合成。大的基因合成。化学合成法的基本战略化学合成法的基本战略化学合成法的基本战略化学合成法的基本战略上述三种方法各有上述三种方法各有利弊利弊化学合成化学合成DNA的单片段愈短，收率就愈的单片段愈短，收率就愈高，但由于化学合成的份额较大，成本高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；较高；在大片段酶促法合成目的基因时，虽然在大片段酶促法合成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，化学合成的份额相对较小，成本较低，但大片段化学合成的收率极低。但大片段化学合成的收率极低。DNA化学合成的用途化学合成的用途合成天然基因合成天然基因 如生长激素释放抑制素基因、脑啡肽基如生长激素释放抑制素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素基因等因、胰岛素基因、干扰素基因等修饰改造基因修饰改造基因 如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等原基因等设计新型基因设计新型基因制备探针、引物、接头制备探针、引物、接头
