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1、基因工程克隆方案设计基因工程克隆方案设计基因工程实验设计q1、目的基因的序列分析q2、载体的选择和分析q3、克隆策略的设计q4、引物的设计目的基因的序列分析qq1 1、分析、分析ORFORF：找到需要克隆的核酸序列找到需要克隆的核酸序列qq2 2、分析酶切位点：、分析酶切位点：（1 1）酶切位点为）酶切位点为0 0的酶；可通过引物加入，方的酶；可通过引物加入，方便克隆；便克隆；（2 2）酶切位点为）酶切位点为1 1和和2 2的酶：用于酶切克隆或的酶：用于酶切克隆或基因和重组质粒的酶切分析。基因和重组质粒的酶切分析。载体的选择和分析q1、根据目的选择合适的载体质粒：克隆、表达或其它用途。q2、M
2、CS(多克隆位点）是否有合适酶切位点（一般是基因上没有或1个的酶切位点)q3、表达载体，要注意表达框架配对。q4、载体的酶切位点，用于重组鉴定。克隆策略的设计q1、平端克隆；q2、粘端克隆（1 1）TATA克隆克隆（2 2） 单酶切不定向克隆单酶切不定向克隆（3 3）双酶切定向克隆双酶切定向克隆双酶切定向克隆双酶切定向克隆平端克隆q机械打断，化学合成，EcoRV酶切，或其它酶切位点末端改造（klenow酶补平，S1处理）产生平端；q克隆效率较低，ligase要加大量；q载体需脱磷；q方向可正可反。TA克隆qq1 1、普通、普通TaqTaq酶扩增的酶扩增的PCRPCR产物产物33末端会多加一个末
3、端会多加一个A;A;qq2 2、公司提供的、公司提供的T-vectorT-vector的的55末端有一个粘性的末端有一个粘性的T;T;用途用途: : (1)PCR (1)PCR产物快速克隆：产物快速克隆： （2 2）基因测序（可正可反）；）基因测序（可正可反）； （3 3）利用）利用T-vectorT-vector上的上的MCS, MCS, 为下一步克隆调整酶切位点为下一步克隆调整酶切位点单酶切不定向克隆q载体需要脱磷（否则，自连效率极高，外源基因无法插入）；q基因插入可正可反，需要筛选。双酶切定向克隆qq类型类型类型类型： （1 1）粘粘- -粘连接粘连接：最有效、最快捷：最有效、最快捷 （
4、2 2）粘粘- -平连接平连接：适用于外源基因仅与载体有一个相同：适用于外源基因仅与载体有一个相同酶切位点，可将另一末端补平酶切位点，可将另一末端补平qq特点特点特点特点: :(1)(1)基因和载体都用两种酶切割；基因和载体都用两种酶切割；(2)(2)连接效率高；连接效率高；(3)(3)外源基因插入方向固定，不用鉴定。外源基因插入方向固定，不用鉴定。定向克隆的注意点：（1）两个同尾酶切出的末端一样，相当于单酶切不定向克隆；（2)载体MCS中的两个酶切位点要远一点，防止一端没切透；（可选用中间插入其它基因片断的载体酶切回收制备）。引物的设计qq常规设计原则常规设计原则qq特殊用途设计技巧特殊用途
5、设计技巧引物常规设计原则1.1.长度：长度：7nt,7nt,一般一般ntnt左右左右;(;(仅仅binding,binding,不含接头不含接头) )2.G+C2.G+C含量含量3.3.避免聚嘌呤或聚嘧啶或有回文对称结构；避免聚嘌呤或聚嘧啶或有回文对称结构；4.4.引物自身不能互补（引物自身不能互补（33个）个）5.5.引物之间不能互补（引物之间不能互补（55个）个）6.6.引物端不能错配引物端不能错配, ,不能修饰，尽量不用不能修饰，尽量不用A,A,不能超过个连续的不能超过个连续的G G或或C C；7.7.端可变化修饰，附加酶切位点；端可变化修饰，附加酶切位点；8.8.两引物的两引物的TmT
6、m值应比较接近；值应比较接近；9.9.正链引物：正链引物：mRNAmRNA序列照抄；序列照抄；负链引物：先写出负链引物：先写出mRNAmRNA序列的互补序列，然后翻转重写。序列的互补序列，然后翻转重写。解链温度解链温度Tm=4(G+C)+2(A+T)=20ntTm=4(G+C)+2(A+T)=20ntTm=81.5+0.41*(GC%)-600/L20ntTmTm一般一般最佳最佳PCRPCR反应中结合温度（反应中结合温度（anneaningtemperatureanneaningtemperature）T=Tm-5T=Tm-5特殊用途引物设计技巧1.5附加酶切位点(定向克隆):2.引入点突变3
7、.有不确定序列4.PCR产物直接测序5附加酶切位点(定向克隆)1、不同酶的保护碱基序列不同；NEB catalog提供相关资料。2、有些酶的保护碱基包含其它酶切位点，注意双酶切的先后顺序: Nde1 Eco R1引入点突变1. 一条引物最多引入3个点突变,可延长引物长度.2. 突变位点要靠近5端.3.要注意密码子的偏好性, 简并性有不确定序列（34种） 5 ATG GGC ICC AIA ICT TCT ACC 3说明：1、次黄嘌呤核苷酸I可与四种碱基配对； 2、可用于PCR产物直接测序。有不确定序列（2种）5 ATG GGC A CC ATA GCT TCT A(A/C)C 3说明： 1,表示该位点有两种可能的序列A或C;2. 合成引物时只要一条引物的money; 实际得到的是两条引物等比例的混合物： 5 ATG GGC A CC ATA GCT TCT AAC 3 5 ATG GGC A CC ATA GCT TCT ACC 33、设计时可靠近、设计时可靠近 3 端端4、不能用于、不能用于PCR产物直接测序产物直接测序
