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1、植物总DNA的提取及检测制作人：葛杰一一 、实验目的、实验目的 学习提取和纯化高等植物总学习提取和纯化高等植物总DNA的方法，并进行纯度鉴定，的方法，并进行纯度鉴定，理解其原理。理解其原理。n脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸(DNA)(DNA)、核糖核酸、核糖核酸(RNA)(RNA) ，与蛋白质，与蛋白质结合在一起以核蛋白（结合在一起以核蛋白（DNPDNP）的形式存在。在制备）的形式存在。在制备核酸时通常破坏细胞壁及细胞膜来使核蛋白释放出核酸时通常破坏细胞壁及细胞膜来使核蛋白释放出来。来。n植物总植物总DNADNA包括细胞核包括细胞核DNADNA和细胞核外和细胞核外DNA,DNA,前者存在前者存在于细
2、胞核内，后者存在于细胞质中有半自主性复制于细胞核内，后者存在于细胞质中有半自主性复制活性的细胞器内，例如线粒体活性的细胞器内，例如线粒体DNA(mtDNADNA(mtDNA) )和叶绿体和叶绿体DNA(ctDNADNA(ctDNA) )。二、实验原理二、实验原理细胞破碎细胞破碎 抽提去蛋白质抽提去蛋白质 沉淀核酸沉淀核酸基本过程基本过程 机械方法：机械方法： 超声波处理法、超声波处理法、研磨法、研磨法、匀浆法；匀浆法； 化学试剂法：化学试剂法：用用SDSSDS处理细胞；处理细胞； 酶解法：酶解法： 加入溶菌酶或蜗牛酶，破坏细胞壁。加入溶菌酶或蜗牛酶，破坏细胞壁。 细胞破碎细胞破碎 uCTABC
3、TAB法法（十十六六烷烷基基三三甲甲基基溴溴化化铵铵）：是是一一种种阳阳离离子子去去污污剂剂，可可溶溶解解细细胞胞膜膜，它它能能与与核核酸酸形形成成复复合合物物，在在高高盐盐溶溶液液（0.7mol/L NaCl）中中是是可可溶溶的的，当当降降低低溶溶液液盐盐的的浓浓度度到到一一定定程程度度（0.3mol/L NaCl）时时从从溶溶液液中中沉沉淀淀，通通过过离离心心就就可可将将CTAB与与核核酸酸的的复复合合物物同同蛋蛋白白、多多糖糖类类物物质质分分开开，然然后后将将CTAB与与核核酸酸的的复复合合物物沉沉淀淀溶溶解解于于高高盐盐溶溶液液中中，再再加加入入乙乙醇醇使核酸沉淀，使核酸沉淀，CTAB
4、能溶解于乙醇中。能溶解于乙醇中。DNADNA提取提取u蛋白质蛋白质 常用苯酚：氯仿：异戊醇（常用苯酚：氯仿：异戊醇（2525：2424：1 1）或氯仿：异戊醇（或氯仿：异戊醇（2424：1 1）抽提）抽提。uRNA RNA 常选用常选用RNaseRNase消化消化 ，或是用，或是用LiClLiCl来消除大分来消除大分子的子的RNARNA。u酚类物质酚类物质 提取液中加少量巯基乙醇，选取幼嫩提取液中加少量巯基乙醇，选取幼嫩的材料。的材料。DNADNA纯化（去杂质）纯化（去杂质）实验材料实验材料植物叶片植物叶片( (去叶脉去叶脉) )试剂试剂 2 2CTABCTAB抽提液（抽提液（CTABCTAB
5、、TrisTris-HCL-HCL、EDTAEDTA、NaclNacl）TE TE 缓冲液缓冲液(pH=8.0) (pH=8.0) 氯仿：异戊醇氯仿：异戊醇( (24:1)24:1)异丙醇异丙醇70%70%乙醇乙醇 三、材料与试剂三、材料与试剂离心机离心机 水浴锅水浴锅研钵研钵 微量移液器微量移液器仪器用具仪器用具1取取 0.1g 新鲜的植物幼嫩叶片于研钵中，加新鲜的植物幼嫩叶片于研钵中，加 入液氮，迅速研入液氮，迅速研磨。磨。2、加液氮磨成粉末后迅速转入、加液氮磨成粉末后迅速转入1.5ml离心管中。离心管中。3、加入、加入700ul 2%的的CTAB提取液，充分混匀提取液，充分混匀CTAB提
6、取液，置提取液，置于于65水浴中保温水浴中保温 10min，其间颠倒混匀，其间颠倒混匀23次。次。破碎细胞破碎细胞4、冷至室温后加入等体积氯仿：异戊醇（、冷至室温后加入等体积氯仿：异戊醇（24:1）混合液，充分）混合液，充分颠倒混匀，防止成团。颠倒混匀，防止成团。8000r/min，离心，离心 10min，取上清。，取上清。抽抽提去蛋白提去蛋白5、将上清液移入新的、将上清液移入新的1.5mL离心管内，加离心管内，加 等体积异丙醇（预冷等体积异丙醇（预冷-20）。颠倒混匀，可见）。颠倒混匀，可见 DNA 絮状沉淀。絮状沉淀。除酚类、多糖除酚类、多糖四、操作步骤四、操作步骤6、低温放置、低温放置1
7、5分钟，分钟，8000r/min，离心，离心 10min，倒掉，倒掉上清液，上清液，1ml 70%乙醇洗涤沉淀，乙醇洗涤沉淀，7000rpm，5min，弃上清。弃上清。沉淀核酸沉淀核酸7、将离心管倒置，沉淀于室温自然干燥。、将离心管倒置，沉淀于室温自然干燥。 8、将沉淀加、将沉淀加30l 的的TE溶解，获得溶解，获得DNA溶液，待测。溶液，待测。1)选取新鲜材料，研磨迅速彻底，研磨好的材料应与选取新鲜材料，研磨迅速彻底，研磨好的材料应与 CTAB 抽提液充分抽提液充分混匀；混匀；2)若提取产物有颜色，可能是材料中含有较多的多酚类物质，尽可能选若提取产物有颜色，可能是材料中含有较多的多酚类物质，
8、尽可能选取幼嫩的材料；取幼嫩的材料；3）收集）收集 CTAB 与核酸形成的复合物时不要离心过度，否则沉淀再溶解与核酸形成的复合物时不要离心过度，否则沉淀再溶解难；难；4）为了获得具有生物活性的天然核酸，在分离制备过程中必须采用温）为了获得具有生物活性的天然核酸，在分离制备过程中必须采用温和的条件，避免过酸过碱、剧烈地搅拌，防止热变性，同时还要避免和的条件，避免过酸过碱、剧烈地搅拌，防止热变性，同时还要避免核酸降解酶类的降解。核酸降解酶类的降解。五、注意事项五、注意事项DNA 纯度的鉴定纯度的鉴定紫外分光光度紫外分光光度计法检测计法检测DNA一、原理一、原理由于核酸中的碱基都具有共轭双键，所以具
9、有紫外光由于核酸中的碱基都具有共轭双键，所以具有紫外光吸收性质。核酸在紫外光谱区有一条典型的吸收曲线，吸收性质。核酸在紫外光谱区有一条典型的吸收曲线，其吸收高峰在其吸收高峰在260nm处，蛋白质在紫外区的吸收高峰在处，蛋白质在紫外区的吸收高峰在280nm处，所以核酸的紫外吸收光谱数据是鉴定核酸的处，所以核酸的紫外吸收光谱数据是鉴定核酸的重要依据之一。但紫外法不能区分重要依据之一。但紫外法不能区分DNA和和RNA，只能用，只能用来鉴定核酸的纯度和含量。来鉴定核酸的纯度和含量。纯净的核酸溶液纯净的核酸溶液A260/A230的消光值比大于或等于的消光值比大于或等于2.0；A260/A280大于或等于
10、大于或等于1.80。A260/A280值过小，说明蛋值过小，说明蛋白未脱净；白未脱净；A260/A230过小，说明有杂质（一般为多酚过小，说明有杂质（一般为多酚类或色素）。类或色素）。二、实验原理二、实验原理一、原理一、原理由于核酸中的碱基都具有共轭双键，所以具有紫外光由于核酸中的碱基都具有共轭双键，所以具有紫外光吸收性质。核酸在紫外光谱区有一条典型的吸收曲线，吸收性质。核酸在紫外光谱区有一条典型的吸收曲线，其吸收高峰在其吸收高峰在260nm处，蛋白质在紫外区的吸收高峰在处，蛋白质在紫外区的吸收高峰在280nm处，所以核酸的紫外吸收光谱数据是鉴定核酸的处，所以核酸的紫外吸收光谱数据是鉴定核酸的
11、重要依据之一。但紫外法不能区分重要依据之一。但紫外法不能区分DNA和和RNA，只能用，只能用来鉴定核酸的纯度和含量。来鉴定核酸的纯度和含量。纯净的核酸溶液纯净的核酸溶液A260/A230的消光值比大于或等于的消光值比大于或等于2.0；A260/A280大于或等于大于或等于1.80。A260/A280值过小，说明蛋值过小，说明蛋白未脱净；白未脱净；A260/A230过小，说明有杂质（一般为多酚过小，说明有杂质（一般为多酚类或色素）。类或色素）。三、材料与试剂三、材料与试剂1、材料、材料 植物植物DNA2、器材：紫外分光光度计、移液管、试管、器材：紫外分光光度计、移液管、试管3、试剂：、试剂：TE溶液（溶液（pH8.0）（见前述）（见前述）四、操作步骤四、操作步骤1、将纯化的、将纯化的DNA溶液用溶液用TE（pH8.0）稀释至每）稀释至每毫升含毫升含5-50g DNA浓度范围，用浓度范围，用TE（pH8.0）作）作空白对照。空白对照。2、于紫外分光光度计上测定、于紫外分光光度计上测定260nm、280nm吸吸收值，计算收值，计算A260/A280的比值，并换算出核酸的的比值，并换算出核酸的含量。含量。五、实验结果与分析五、实验结果与分析作作业业：为为了了获获得得高高质质量量的的植植物物总总DNA，在在分分离离提取过程中应注意那些问题？提取过程中应注意那些问题？
