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1、实验目的掌握细胞骨架的显示方法掌握荧光显微镜的使用方法了解荧光显微镜下细胞骨架的基本形态结构背景知识细胞参量细胞参量荧光探针荧光探针 吸收吸收/发射发射 nm特性特性DNA和和RNAPropidum iodide(PI) 535/617 红色荧光红色荧光 嵌入核酸双链间嵌入核酸双链间,只能标记死细胞只能标记死细胞.用于用于 染色染色体体,细胞观察细胞观察,分辨死活细胞和细胞周期研究分辨死活细胞和细胞周期研究Ethidium bromide(EB)518/605红色荧光红色荧光嵌入核酸双链间嵌入核酸双链间,只能标记死细胞只能标记死细胞.用于电泳用于电泳分析分析,染色体观察染色体观察DAPI 35
2、8/461 蓝色荧光蓝色荧光半通透细胞半通透细胞,结合于结合于DNA的的AT碱基对碱基对.用于细用于细胞周期的研究胞周期的研究,染色体和细胞核的观察染色体和细胞核的观察Hoechst33342 350/461 蓝蓝色荧光色荧光结合于结合于DNA的的AT碱基对碱基对,可进入活细胞可进入活细胞,用于用于细胞周期的研究细胞周期的研究,染色体和细胞核的观察染色体和细胞核的观察蛋白和抗体的蛋白和抗体的耦联探针耦联探针FITC 494/518 绿色荧光绿色荧光染死细胞染死细胞,对对PH值变化不敏感值变化不敏感Texas red 595/615 红色荧红色荧光光多参量细胞标记多参量细胞标记溶酶体溶酶体Neu
3、tral red 541/640 红色红色荧光荧光探针微偏碱性探针微偏碱性,可标记溶酶体等酸性细可标记溶酶体等酸性细胞器胞器线粒体线粒体Rhodamine 123 507/529 黄绿色荧光黄绿色荧光可进入活细胞可进入活细胞,阳离子性阳离子性,摄入快摄入快,淬灭淬灭快快,无毒性无毒性常用荧光探针介绍狭义的细胞骨架指细胞质骨架，包括微丝、微管和中间纤维。广义的细胞骨架包括细胞核骨架、细胞质骨架、细胞膜骨架和细胞外基质。细胞骨架2024/8/25微管2024/8/25微丝2024/8/25中间纤维背景知识 S.D.PoneS.D.Pone用用考考马马斯斯亮亮蓝蓝染染人人皮皮肤肤成成纤纤维维细细胞胞
4、的的细细胞胞骨骨架架获获得得成成功功。19821982年年上上海海植植物物生生理理所所陈陈梓梓卿卿采采用用植植物物细细胞为材料也获成功。实践证明这是一种简单易行的方法。胞为材料也获成功。实践证明这是一种简单易行的方法。 当当细细胞胞用用适适当当浓浓度度的的triton triton X X -100-100溶溶液液（聚聚乙乙二二醇醇辛辛基基苯苯基基醚醚，一一种种非非离离子子去去垢垢剂剂）处处理理，能能够够溶溶解解质质膜膜结结构构中中及及细细胞胞内内许许多多蛋蛋白白质质，而而微微丝丝束束结结合合得得比比较较紧紧密密，不不容容易易被被去去除除 ，经经固固定定和和染染色色后后，可可在在光光镜镜下下观
5、观察察到到由由微微丝丝组成的纤维束。组成的纤维束。细胞骨架研究中常用药物药物名称药物名称作用作用细胞松弛素细胞松弛素B B (cytochalasin B, CB)(cytochalasin B, CB)结合在微丝的正端，阻抑其聚合，结合在微丝的正端，阻抑其聚合，同时提高临界浓度，最终导致微同时提高临界浓度，最终导致微丝的解聚丝的解聚鬼笔环肽鬼笔环肽 (phalloidine)(phalloidine)强烈亲和微丝，结合在微丝中强烈亲和微丝，结合在微丝中actinactin亚单位之间，稳定微丝、促亚单位之间，稳定微丝、促进微丝聚合进微丝聚合秋水仙素（秋水仙素（colchicinecolchic
6、ine）阻断微管蛋白组装成微管阻断微管蛋白组装成微管紫杉醇（紫杉醇（taxoltaxol）促进微管的装配，稳定已形成的促进微管的装配，稳定已形成的微管微管实验原理鬼笔环肽鬼笔环肽(phalloidin) (phalloidin) 是从一种毒性菇类中分离的剧毒生是从一种毒性菇类中分离的剧毒生物碱，它同细胞松弛素的作用相反物碱，它同细胞松弛素的作用相反, , 只与聚合的微丝结合只与聚合的微丝结合, , 而不与肌动蛋白单体分子结合。它而不与肌动蛋白单体分子结合。它同聚合的微丝结合后同聚合的微丝结合后, , 抑制了微丝的解体抑制了微丝的解体, , 因而破坏了微丝的聚合和解聚的动态因而破坏了微丝的聚合和
7、解聚的动态平衡。平衡。由于鬼笔环肽非常特异地结合并稳定聚合态肌动蛋白由于鬼笔环肽非常特异地结合并稳定聚合态肌动蛋白, , 因因而对肌动蛋白的动态平衡造成严重影响而对肌动蛋白的动态平衡造成严重影响. . 此外此外, , 较高浓度较高浓度的鬼笔环肽对细胞有毒害作用的鬼笔环肽对细胞有毒害作用. . 因此因此, , 用鬼笔环肽标记微用鬼笔环肽标记微丝并不是用于研究活体细胞的理想方法丝并不是用于研究活体细胞的理想方法. . G-actinF-actinATP、 Mg2+、高、高K+、Na+Ca2+、低、低Na+、K+实验步骤材料：材料： CHO（中国仓鼠卵巢细胞）、鸡胚成纤维细胞试剂：试剂： 1.1.P
8、EM：50mM pipes (pH6.9), 5mM EGTA, 5mM MgSO4, 0.225M 山梨醇 2.0.5% Triton X-100溶于PEM缓冲液中。 3.4%多聚甲醛溶于PEM缓冲液中。 取出盖片，于小平皿中取出盖片，于小平皿中37预温预温 PEM洗洗3次次(每次每次 1mL)1mL)Triton X-100处理约10min(1mL)37预温 PEM洗3次(每次 1mL)37预温 4%多聚甲醛固定细胞15min (1mL)37预温 PEM洗3次55nM Alex -phalloidin 10L湿盒中室温染色30min。37预温 PEM洗数3次 滴加10L Ho.33342复染色 用小砂轮切去用小砂轮切去长方形盖玻片的长方形盖玻片的一角作为标记以一角作为标记以便识别细胞面。便识别细胞面。细胞密度60-80%注意盖玻片的正反面切勿产生气泡！在parafilm 膜上加PEM ，待盖玻片被冲起后，再轻轻揭下盖玻片。避光操作 荧光镜下观察注意事项注意不要弄碎盖片，分清细胞所在面；注意不要弄碎盖片，分清细胞所在面；各步洗细胞要轻，勿使细胞脱落；各步洗细胞要轻，勿使细胞脱落；荧光观察注意避光操作荧光观察注意避光操作节约试剂。节约试剂。思考题思考题PEM缓冲液的作用是什么？0.5%Triton X-100处理细胞的作用是什么？鬼笔环肽用于细胞骨架研究的优缺点是什么？
