细胞工程第五章

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1、第五章第五章 细胞融合与单克细胞融合与单克隆抗体技术隆抗体技术第一节 细胞融合一、细胞融合的发展简史二、细胞融合的基本技术三、融合细胞的筛选四、细胞融合的应用五、融合细胞的克隆化 细胞融合细胞融合是指在离体条件下用人工方法是指在离体条件下用人工方法将不同种生物或同种生物的不同类型的细将不同种生物或同种生物的不同类型的细胞通过无性方式融合成一个细胞的技术。胞通过无性方式融合成一个细胞的技术。 一、细胞融合的发展简史一、细胞融合的发展简史18381838年年MullerMuller第一个描述了脊椎动物肿瘤细胞融合成第一个描述了脊椎动物肿瘤细胞融合成多核细胞的现象。多核细胞的现象。 18731873

2、年，年，LuginbuhlLuginbuhl 在天花脓瘪周围组织中观察到在天花脓瘪周围组织中观察到多核细胞。多核细胞。 19071907年，体外组织培养技术成功之后，人们观察到年，体外组织培养技术成功之后，人们观察到体外培养的细胞也能融合而形成多核巨细胞。体外培养的细胞也能融合而形成多核巨细胞。 19581958年，日本冈田善雄年，日本冈田善雄(Okada)(Okada)用高浓度的仙台病用高浓度的仙台病毒毒(Sendai Virus)(Sendai Virus)在体外成功地融合了小鼠艾氏腹水在体外成功地融合了小鼠艾氏腹水癌细胞后，细胞融合技术，得到迅速发展。癌细胞后，细胞融合技术，得到迅速发展

3、。19601960年，法国的年，法国的BarskiBarski等首先发现不同类等首先发现不同类型的细胞在混合培养过程中自发融合的现象。型的细胞在混合培养过程中自发融合的现象。 19661966年，年，YerganianYerganian进一步用仙台病毒获得进一步用仙台病毒获得了能够增殖的杂种细胞。了能够增殖的杂种细胞。 7070年代，童第周在我国率先开展了这方年代，童第周在我国率先开展了这方面研究，将正常细胞与肿瘤细胞融合，证明面研究，将正常细胞与肿瘤细胞融合，证明正常细胞具有抗肿瘤效应。正常细胞具有抗肿瘤效应。二、细胞融合的基本技术二、细胞融合的基本技术 细胞虽在体外培养条件下会自发融合，细

4、胞虽在体外培养条件下会自发融合，但频率极低，故一般均须添加具有诱导细胞但频率极低，故一般均须添加具有诱导细胞融合效应的生物或化学因子融合效应的生物或化学因子( (融合剂融合剂) )，或采，或采用电融合技术，人为地促进细胞融合。用电融合技术，人为地促进细胞融合。 人们把这种可以促进细胞融合，提高融人们把这种可以促进细胞融合，提高融合率而加入的生物试剂或化学试剂叫作合率而加入的生物试剂或化学试剂叫作细胞细胞融合剂。融合剂。细胞融合示意图细胞融合示意图1 1、细胞融合的机理、细胞融合的机理n细胞融合实际上包含多个过程：细胞融合实际上包含多个过程：n首先是两个亲本细胞并列，细胞膜接触，首先是两个亲本细

5、胞并列，细胞膜接触，以后膜组织局部破坏，最终形成包围融以后膜组织局部破坏，最终形成包围融合细胞的连续胞膜。合细胞的连续胞膜。n融合细胞表面的特征性变化，有膜成分融合细胞表面的特征性变化，有膜成分和胞质成分交流以及细胞内电导率的连和胞质成分交流以及细胞内电导率的连续性。续性。病毒融合剂病毒融合剂(p82)(p82)： 最早被采用病毒融合剂有最早被采用病毒融合剂有疱疹病毒、疱疹病毒、天花病毒和副粘液病毒天花病毒和副粘液病毒等在内的病毒类等在内的病毒类融合剂。融合剂。 灭活仙台病毒灭活仙台病毒介导细胞融合过程可以大介导细胞融合过程可以大大提高融合频率。它在病毒类融合剂中大提高融合频率。它在病毒类融合

6、剂中最为有效，使用最广。最为有效，使用最广。使用仙台病毒诱导细胞融合步骤使用仙台病毒诱导细胞融合步骤1.1.制备细胞悬液制备细胞悬液2.2.紫外线灭活紫外线灭活2 2分钟（使仙台病毒失去致病分钟（使仙台病毒失去致病性，仅起融合因子的作用）性，仅起融合因子的作用）3.3.混合亲本细胞（高混合亲本细胞（高pHpH高高CaCa2+2+，加入灭活病，加入灭活病毒毒8-108-10分钟）分钟）4.4.杂种细胞的筛选杂种细胞的筛选化学融合剂：化学融合剂： 常用常用PEGPEG 优点：优点：融合成本低，不需特殊设备；融融合成本低，不需特殊设备；融子合产生的异核率较高，融合过程不受子合产生的异核率较高，融合过

7、程不受物种限制物种限制 缺点：缺点：可能会对细胞造成伤害可能会对细胞造成伤害-+-+-桥梁桥梁+-PEG被洗掉被洗掉+-电荷重排电荷重排+-膜接触膜接触+-融合融合示意图示意图 PEGPEG诱导细胞融合的效果：诱导细胞融合的效果：n同其同其分子量大小及浓度高低分子量大小及浓度高低相关。常用分子量为相关。常用分子量为1000100060006000，浓度为浓度为30305050n须严格掌握须严格掌握PEGPEG的的处理时间处理时间。 悬浮法悬浮法，处理，处理1 12 2分钟为宜。分钟为宜。 离心法离心法，先将细胞混合物悬于，先将细胞混合物悬于30304040的的PEGPEG中，再中，再通过离心进

8、行融合，可适当延长接触时间，以通过离心进行融合，可适当延长接触时间，以5 58 8分钟分钟为宜。随后，均须立即加液稀释，以及时终止为宜。随后，均须立即加液稀释，以及时终止PEGPEG作用。作用。n PEGPEG溶液的溶液的pHpH7.47.48.08.0电融合技术：电融合技术：常用：细胞融合仪常用：细胞融合仪 电融合技术的原理：电融合技术的原理： 1 1）细胞膜的接触（交流电）细胞膜的接触（交流电） 2 2）细胞膜的击穿（直流电）细胞膜的击穿（直流电）电电融合法原理融合法原理交流电场交流电场使细胞膜表面电荷偶极化，使细胞膜表面电荷偶极化，沿着电极排列，形成沿着电极排列，形成串珠。串珠。+-+-

9、+-+-+-+-负极负极正极正极+-+-+-+-+-施加施加直流电场直流电场后，形成串珠的细胞在后，形成串珠的细胞在质质膜接触处发生穿孔膜接触处发生穿孔，开始遗传物质的交流。，开始遗传物质的交流。+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-电融合技术的优点电融合技术的优点 不存在对细胞的毒害问题不存在对细胞的毒害问题 融合效率高融合效率高 融合技术操作简便融合技术操作简便三、融合细胞的筛选三、融合细胞的筛选n融合细胞的类型融合细胞的类型n1)1)两个完态细胞的融合两个完态细胞的融合: :同核体、异核体同核体、异核体n2 2）两个非完态细胞的融合：核质杂种、）两个非完态细胞的融合

10、：核质杂种、胞质杂种胞质杂种1 1药物抗性突变型的筛选药物抗性突变型的筛选 药物抗性突变型：药物抗性突变型：细胞突变后对某一种药物的细胞突变后对某一种药物的抗性显著增加而形成的一种突变型。抗性显著增加而形成的一种突变型。 当把正常的野生型细胞培养在含有这一当把正常的野生型细胞培养在含有这一药物的培养基上，逐渐增加药物浓度，便可得到药物的培养基上，逐渐增加药物浓度，便可得到一条存活曲线（一条存活曲线（surivalsurival curve curve）。但是存在一）。但是存在一些自发突变，这一细胞在药物的致死浓度中仍能些自发突变，这一细胞在药物的致死浓度中仍能生长。生长。 0.010.1110

11、100细细胞胞活活存存率率（ log比比例例）野生型野生型抗性突变型抗性突变型增加药物浓度增加药物浓度A 糖糖 + +氨基酸氨基酸核核 苷苷从头合成途径从头合成途径（能被氨基碟呤阻断）（能被氨基碟呤阻断）“补救补救”途径途径（包含（包含HGPRT和和TK酶）酶）DNADNADNA合成途径合成途径培养基中加入嘌呤类似物培养基中加入嘌呤类似物 （N-鸟嘌呤）鸟嘌呤）细胞正常生长细胞正常生长（HGPRT-HGPRT-）细胞死亡细胞死亡（HGPRT+HGPRT+）可通过嘌呤类似物来筛选可通过嘌呤类似物来筛选HGPRT-HGPRT-细胞细胞正向选择正向选择从头合成途径从头合成途径 HATHAT选择培养基

12、含选择培养基含: : 次黄嘌呤次黄嘌呤(hypoxanthine)(hypoxanthine) 氨基蝶呤（氨基蝶呤（aminopterinaminopterin） 胸腺嘧啶（胸腺嘧啶（thymidinethymidine） 氨基蝶呤氨基蝶呤可阻止从头合成途径的过程，所以细胞可阻止从头合成途径的过程，所以细胞内内HGPRTHGPRT活性必须恢复，细胞才能存活。对于这活性必须恢复，细胞才能存活。对于这类回复突变型的选择称为类回复突变型的选择称为反向选择反向选择(reverse (reverse selection)selection) 补救途径补救途径HAT培养基培养基细胞正常生长细胞正常生长（H

13、GPRT+HGPRT+）细胞死亡细胞死亡（HGPRT-HGPRT-） 从头合成途径从头合成途径培养基中含培养基中含BrdU细胞正常生长细胞正常生长（TK-TK-）细胞死亡细胞死亡（TK+TK+）TK也可作为一种选择性标记2 2营养缺陷突变型的筛选营养缺陷突变型的筛选 营养缺陷突变型营养缺陷突变型是培养细胞突变型中的另一是培养细胞突变型中的另一种重要突变类型。这些突变型种重要突变类型。这些突变型表现表现在合成低分在合成低分子量代谢物子量代谢物( (如氨基酸，嘌呤、嘧啶等）的能如氨基酸，嘌呤、嘧啶等）的能力发生了改变，以致这些细胞所产生的生物量力发生了改变，以致这些细胞所产生的生物量不能满足正常生

14、长的需要。不能满足正常生长的需要。 n营养缺陷型细胞营养缺陷型细胞是指，在一些营养物是指，在一些营养物( (如如氨基酸、碳水化合物、嘌呤、嘧啶或其氨基酸、碳水化合物、嘌呤、嘧啶或其他代谢产物他代谢产物) )的合成能力上出现缺陷，而的合成能力上出现缺陷，而难以在缺乏这些营养物的培养基中存活难以在缺乏这些营养物的培养基中存活的变异型细胞。的变异型细胞。例：缺乏甘氨酸和脯氨酸的培养基上甘氨酸营养缺陷型细胞脯氨酸营养缺陷型细胞融合细胞死亡死亡存活培养3 3温度敏感突变型的筛选温度敏感突变型的筛选较高温度生长的细胞较高温度生长的细胞较低温度生长的细胞较低温度生长的细胞两种温度存活两种温度存活4.4.荧光

15、激活细胞分选仪（荧光激活细胞分选仪（FACSFACS）筛选）筛选不同荧光标记的脂质染料分别标记两亲本细胞，融合细胞因发两种荧光而被筛选出来。四、细胞融合的应用四、细胞融合的应用1 1淋巴细胞杂交瘤淋巴细胞杂交瘤2 2基因定位基因定位3 3遗传基因的缺陷互补遗传基因的缺陷互补4 4分化功能的表达调控研究分化功能的表达调控研究5. 5. 体细胞杂种的致癌性分析体细胞杂种的致癌性分析6. 6. 制作疫苗制作疫苗7. 7. 核移植和动物克隆核移植和动物克隆五、融合细胞的克隆化五、融合细胞的克隆化1 1、克隆化的目的、克隆化的目的1 1） 是细胞建株的必经过程，以得到遗传是细胞建株的必经过程，以得到遗传

16、特征相同的细胞；特征相同的细胞；2 2） 就杂交瘤而言，可从中筛选出稳定而就杂交瘤而言，可从中筛选出稳定而同源的杂种细胞系，淘汰遗传不稳定同源的杂种细胞系，淘汰遗传不稳定的杂交瘤细胞。的杂交瘤细胞。3 3） 减少非分泌型无关细胞生长过快。减少非分泌型无关细胞生长过快。2 2、饲养细胞的种类、饲养细胞的种类 对于培养小鼠细胞来说，主要有下列各种细胞对于培养小鼠细胞来说，主要有下列各种细胞可供作为其饲养细胞：可供作为其饲养细胞：胸腺细胞；胸腺细胞；正常的脾细胞；正常的脾细胞；传代培养中的大鼠胚胎成纤维细胞；传代培养中的大鼠胚胎成纤维细胞；腹腔细胞腹腔细胞，是使用得最普遍的饲养细胞。，是使用得最普遍

17、的饲养细胞。3 3、克隆化培养方法：、克隆化培养方法： 按其分离单细胞的方法不同，大致可分按其分离单细胞的方法不同，大致可分为为有限稀释法、软琼脂平板法、显微操有限稀释法、软琼脂平板法、显微操作法及荧光激活细胞分类器法作法及荧光激活细胞分类器法等数种等数种 。1 1）、有限稀释法）、有限稀释法 有限稀释法有限稀释法原理原理是从理论上将细胞稀释是从理论上将细胞稀释到到1010个个/ml/ml，然后装成每小孔然后装成每小孔(96(96孔板孔板) ) 0.1ml0.1ml，使每孔理论上含有单个细胞使每孔理论上含有单个细胞，经过培养后即可获得单个细胞形成集落经过培养后即可获得单个细胞形成集落 。2 2

18、）软琼脂培养法：）软琼脂培养法： 利用单个细胞在软琼脂培养基上的局利用单个细胞在软琼脂培养基上的局限化生长，待细胞集落长到肉眼可见后，限化生长，待细胞集落长到肉眼可见后，用巴氏吸管从琼脂上挑出来用巴氏吸管从琼脂上挑出来( (一般一般810810天后天后) )，再移到液体培养基中，进行生长，再移到液体培养基中，进行生长繁殖，并检测培养上清液的活性。繁殖，并检测培养上清液的活性。 3 3）显微镜操作法）显微镜操作法 在倒置在倒置( (或解剖或解剖) )显微镜下，借助于毛细显微镜下，借助于毛细吸管将单个细胞个别吸出，分别放入已吸管将单个细胞个别吸出，分别放入已加饲养细胞的加饲养细胞的9696孔培养孔

19、内，根据原理孔培养孔内，根据原理不同，又分为不同，又分为普通法普通法和和玫瑰花结玫瑰花结两种方两种方法。法。普通显微镜操作法普通显微镜操作法于于6cm6cm平皿中加入约平皿中加入约10103 3个细胞，个细胞，COCO2 2培养基箱中静置培养基箱中静置1 1小时左右小时左右无菌条件，在倒置显微镜下去平皿盖无菌条件，在倒置显微镜下去平皿盖用直角转头滴管，吸出单个细胞用直角转头滴管，吸出单个细胞 移至预先加有饲养细胞的移至预先加有饲养细胞的9696孔板内孔板内直至直至9696孔均分装有细胞，加盖，孔均分装有细胞，加盖，于于COCO2 2培养箱内培养培养箱内培养观察与更换培养方法同有限稀释法观察与更

20、换培养方法同有限稀释法 原理：原理：分泌抗体细胞在其表面含有抗原分泌抗体细胞在其表面含有抗原受体，在受体，在定的条件下常可与特异性抗定的条件下常可与特异性抗原致敏的绵羊红细胞（原致敏的绵羊红细胞（SRBC）形成玫瑰形成玫瑰花结。花结。玫瑰花结玫瑰花结10106 6个个/ / mLmL杂交瘤细胞杂交瘤细胞1 1致敏的致敏的SRBC 100mLSRBC 100mL在显微镜下可见玫瑰花结形成细胞在显微镜下可见玫瑰花结形成细胞挑玫瑰花结细胞入挑玫瑰花结细胞入9696孔板培养孔板培养细胞生长集落细胞生长集落酶联免疫吸附（酶联免疫吸附（ELISAELISA）鉴定）鉴定4 4）盖片分离法）盖片分离法 用钉锤

21、于洁净的橡胶上砸干净盖片用钉锤于洁净的橡胶上砸干净盖片选择碎块、大小形态适用的选出选择碎块、大小形态适用的选出加培养液及进行细胞培养加培养液及进行细胞培养倒置镜下选细胞，挑出单细胞玻片倒置镜下选细胞，挑出单细胞玻片进行单个细胞培养进行单个细胞培养 5 5）荧光激活细胞分离器法）荧光激活细胞分离器法(FACS) (FACS) 原理是将悬液中的细胞引入一种液流的中原理是将悬液中的细胞引入一种液流的中央，使其一个接一个地通过聚焦的高能激央，使其一个接一个地通过聚焦的高能激光束，根据荧光和光放射的性质快速分析光束，根据荧光和光放射的性质快速分析和分离细胞。和分离细胞。 荧光染料：荧光染料： Hoech

22、est33258Hoechest33258第二节第二节 单克隆抗体单克隆抗体 一、单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程二、单克隆抗体的特性、单克隆抗体的特性 三三、 单克隆抗体的应用单克隆抗体的应用一、单克隆抗体的制备过程一、单克隆抗体的制备过程（一）原理（一）原理（二）制备过程（二）制备过程（三）融合细胞的早期观察（三）融合细胞的早期观察（一）、原理（一）、原理 正常的可产生抗体的正常的可产生抗体的B B淋巴细胞与骨髓瘤淋巴细胞与骨髓瘤细胞在融合剂的作用下产生融合，杂交细胞在融合剂的作用下产生融合，杂交的细胞在的细胞在HATHAT选择培养基中进行培养，得选择培养基中进行培养，得到的为杂交瘤细

23、胞，到的为杂交瘤细胞，该细胞既具有可分该细胞既具有可分泌抗体的功能又可在体外大量增殖。泌抗体的功能又可在体外大量增殖。（二）、制备过程（二）、制备过程1 1细胞培养材料的准备细胞培养材料的准备2 2亲本选择亲本选择3 3细胞融合细胞融合4 4杂交细胞的筛选杂交细胞的筛选5. 5. 杂交瘤细胞的克隆培养杂交瘤细胞的克隆培养6.6.单抗的生产单抗的生产 1 1细胞培养材料的准备细胞培养材料的准备(p79)(p79)1 1）培养基：）培养基：DMEMDMEM；RPMI-1640RPMI-1640培养基培养基2 2）血清：胎牛血清最好，一定选用）血清：胎牛血清最好，一定选用同一批次同一批次的血清，用前

24、要灭活并做细菌学监测。的血清，用前要灭活并做细菌学监测。3 3）抗生素：防止污染）抗生素：防止污染2 2亲本选择亲本选择 一般选用与骨髓瘤细胞供体细胞来源一般选用与骨髓瘤细胞供体细胞来源同一品系的动物进行免疫，常采用同一品系的动物进行免疫，常采用BALB /cBALB /c小小鼠。鼠。 免疫动物的数量要多于用量。免疫动物的数量要多于用量。2 2亲本选择亲本选择1 1）瘤细胞）瘤细胞(p81)(p81)选择原则：选择原则：a a）：丧失自身合成免疫球蛋白的能力）：丧失自身合成免疫球蛋白的能力b b）：对选择剂敏感（易从选择性培养基上除去）：对选择剂敏感（易从选择性培养基上除去）c c）：处于对数

25、生长期（若用冻存细胞，应在融合前）：处于对数生长期（若用冻存细胞，应在融合前一周复苏）一周复苏）2 2亲本选择亲本选择1 1）瘤细胞）瘤细胞常用：常用：小鼠的小鼠的HGPRTHGPRT- -骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞在应用前用在应用前用8-AG8-AG处理，确保处理，确保HGPRTHGPRT- -；杀死回复；杀死回复突变物突变物HGPRTHGPRT+ +2 2亲本选择亲本选择2 2）抗体生成细胞（）抗体生成细胞（B B淋巴细胞）淋巴细胞）(p81)(p81)取取8-128-12周小鼠周小鼠 初次免疫（抗原注入体内，初次免疫（抗原注入体内，隔几天一次，隔几天一次，2-32-3次）次） 2-32-3周后

26、，加强免疫周后，加强免疫（抗原量加倍），使生成的（抗原量加倍），使生成的B B淋巴细胞增多淋巴细胞增多 3-43-4天后杀死小鼠（颈椎脱臼法），取脾脏天后杀死小鼠（颈椎脱臼法），取脾脏 剪碎，滤网过滤剪碎，滤网过滤 淋巴细胞，红细胞淋巴细胞，红细胞（Tris-NH4ClTris-NH4Cl） 收集淋巴细胞收集淋巴细胞2 2亲本选择亲本选择3 3）饲养层细胞）饲养层细胞处死小鼠（处死小鼠（2-32-3只，颈椎脱臼法）只，颈椎脱臼法） 消毒浸泡，消毒浸泡，打开腹腔打开腹腔 注入基础培养液或注入基础培养液或PBSPBS液液 收集腹腔冲洗液收集腹腔冲洗液 离心，去上清离心，去上清 HATHAT培养液稀

27、释离心沉淀细胞培养液稀释离心沉淀细胞 调细胞密度调细胞密度1 1105个个/ml 0.1ml/孔加入孔加入96孔板，培养过夜，备用孔板，培养过夜，备用常用同系的小鼠腹腔巨噬细胞常用同系的小鼠腹腔巨噬细胞3 3细胞融合细胞融合PEG法法脾细胞，骨髓瘤细胞融合（脾细胞，骨髓瘤细胞融合（1010：1-21-2） 离心，离心，去上清，轻轻敲匀去上清，轻轻敲匀 用用1ml451ml45PEG逐滴逐滴加入加入 加培养液加培养液 离心，去上清离心，去上清 HAT培养培养基悬浮细胞基悬浮细胞 96孔板培养孔板培养 一般一般3-63-6天可形成克隆天可形成克隆4 4杂交瘤细胞的筛选杂交瘤细胞的筛选 HATHAT

28、选择培养基选择培养基细胞类型细胞类型 正常正常 HAT 5BudR 8Aza 培养基培养基* 培养基培养基* 培养基培养基 培养基培养基 正常培养细胞正常培养细胞 + + - -TK缺乏细胞缺乏细胞 + - + -HGPRT缺陷细胞缺陷细胞 + - - + 杂交瘤细胞杂交瘤细胞 + + - -（TKHGPRT）选择培养基的作用原理选择培养基的作用原理为生长，为死亡。为生长，为死亡。*为为PRMI1640，加入加入10小牛血清。小牛血清。*为正常培养基中，加入次黄嘌呤为正常培养基中，加入次黄嘌呤104M，胸腺嘧啶胸腺嘧啶4107M，氨基喋呤氨基喋呤1.616-15 M为正常培养基中分别加入为正常

29、培养基中分别加入20微克微克/毫升的毫升的5溴脱氧尿嘧啶核苷或溴脱氧尿嘧啶核苷或8氮杂鸟嘌呤。氮杂鸟嘌呤。n一般在杂交瘤细胞布满孔底一般在杂交瘤细胞布满孔底1/101/10时，开始检测时，开始检测特异性抗体，筛选出所需杂交瘤细胞系。特异性抗体，筛选出所需杂交瘤细胞系。n常用方法有放射免疫测定法，酶联免疫吸附测常用方法有放射免疫测定法，酶联免疫吸附测定法，免疫荧光测定法，免疫组织化学监测法定法，免疫荧光测定法，免疫组织化学监测法等。一般等。一般以方法快速、简便、特异、灵敏为选以方法快速、简便、特异、灵敏为选择原则择原则。可靠的筛选方法须在融合前建立，避。可靠的筛选方法须在融合前建立，避免由于方法

30、不当贻误筛选时机。免由于方法不当贻误筛选时机。5杂交瘤细胞的克隆培养杂交瘤细胞的克隆培养n是确保杂交瘤细胞所分泌的抗体具有单克隆性和是确保杂交瘤细胞所分泌的抗体具有单克隆性和具有稳定性表达的关键一步。具有稳定性表达的关键一步。n目的目的：将抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、特异：将抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、特异性抗体分泌细胞和无关抗体分泌细胞分开。性抗体分泌细胞和无关抗体分泌细胞分开。n克隆化的原则克隆化的原则：尽早进行，反复：尽早进行，反复4-54-5次次n克隆化方法：有限稀释法、软琼脂平板法、显微克隆化方法：有限稀释法、软琼脂平板法、显微克隆法克隆法n阳性杂交瘤细胞应及时冻存，防染色体丢失

31、、变阳性杂交瘤细胞应及时冻存，防染色体丢失、变异及污染异及污染6、单克隆抗体的生产、单克隆抗体的生产1 1）. .体外使用体外使用旋转培养管旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，大量培养杂交瘤细胞，从上清中获取单克隆抗体。但此方法产量低，一般从上清中获取单克隆抗体。但此方法产量低，一般培养液含量为培养液含量为101060g60gmlml，如果大量生产，费，如果大量生产，费用较高（需大量血清增加了成本）。用较高（需大量血清增加了成本）。 6、单克隆抗体的生产、单克隆抗体的生产2 2）. .体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。实体瘤法实体瘤法对数生长期的杂交瘤细胞按对数

32、生长期的杂交瘤细胞按1 13103107 7mlml接种于小鼠背部皮下，每处注射接种于小鼠背部皮下，每处注射0.2 0.2 ml, ml, 共共2 24 4点。待肿瘤达到一定大小后点。待肿瘤达到一定大小后( (一般一般10102020天天) )则可采血，从血清中获得单克隆抗体含量可则可采血，从血清中获得单克隆抗体含量可达到达到1-10mg1-10mgmlml。但采血量有限。但采血量有限。6、单克隆抗体的生产、单克隆抗体的生产腹水的制备腹水的制备常规是先腹腔注射常规是先腹腔注射0.5ml0.5ml降植烷或降植烷或液体石腊于液体石腊于BALBBALBc c鼠，鼠，1 12 2周后腹腔注射周后腹腔注

33、射1101106 6个杂交瘤细胞，接种细胞个杂交瘤细胞，接种细胞7 71010天后可产生腹水，天后可产生腹水，待腹水尽可能多，而小鼠濒于死亡之前，处死小鼠，待腹水尽可能多，而小鼠濒于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获1 110ml10ml腹水。腹水。 缺点：缺点：因需大量活的小鼠而不适合大规模生产。因需大量活的小鼠而不适合大规模生产。同时腹水中可能含其他抗体，给抗体纯化和临床应同时腹水中可能含其他抗体，给抗体纯化和临床应用造成困难。用造成困难。二、杂交瘤技术制备单克隆抗体流程动物免疫分离脾细胞制备骨髓瘤细胞细胞融合HAT培养基选

34、择杂交瘤细胞阳性孔克隆化并扩大培养再次克隆克隆扩大培养扩大培养收集上清液动物接种收集腹水单克隆抗体纯化保存ELISA测血清细胞冻存（三）、融合细胞的观察（三）、融合细胞的观察1 1融合后细胞的早期观察与管理融合后细胞的早期观察与管理2 2无分泌特异性抗体杂交瘤原因分析无分泌特异性抗体杂交瘤原因分析3 3转种与扩大培养过程中杂交瘤细胞停止生长转种与扩大培养过程中杂交瘤细胞停止生长 原因分析原因分析4 4不出现杂交瘤的原因分折不出现杂交瘤的原因分折1 1融合后的细胞早期观察与管理：融合后的细胞早期观察与管理： 及时观察、正确判断融合后的细胞生长情况及时观察、正确判断融合后的细胞生长情况是十分重要的

35、，是十分重要的，3 36 6天可以用肉眼或在倒置显天可以用肉眼或在倒置显微镜下见到杂交瘤细胞的克隆或集落，新出现微镜下见到杂交瘤细胞的克隆或集落，新出现的杂交瘤细胞与其周围细胞相比较，要的杂交瘤细胞与其周围细胞相比较，要大而明大而明 亮，立体感强，每集落细胞数增殖明显亮，立体感强，每集落细胞数增殖明显。2 2无分泌特异性抗体杂交瘤原因分析无分泌特异性抗体杂交瘤原因分析 融合后经融合后经HATHAT选择有细胞克隆出现，但不选择有细胞克隆出现，但不能筛选出产生特异抗体的杂交瘤，常见原因能筛选出产生特异抗体的杂交瘤，常见原因是：是： 抗体检测法不够敏感抗体检测法不够敏感 HATHAT选择失败选择失败

36、 染染色体丢失和克隆竞争色体丢失和克隆竞争 动物免疫不成功动物免疫不成功抗体检测法不够敏感抗体检测法不够敏感 杂交瘤细胞培养上清液中，抗体含量很杂交瘤细胞培养上清液中，抗体含量很少，一般多在少，一般多在10ug/ml10ug/ml以下，检测方法不以下，检测方法不敏感就不能检出。敏感就不能检出。HATHAT选择失败选择失败 因因HATHAT选择失败生长的细胞是骨髓瘤细胞，不是选择失败生长的细胞是骨髓瘤细胞，不是杂交瘤细胞。其原因是：杂交瘤细胞。其原因是： 1 1、骨髓瘤细胞系发生回复突变，由、骨髓瘤细胞系发生回复突变，由HGPRTHGPRT变为变为HGPRTHGPRT，不再对氨基喋呤不再对氨基喋

37、呤(A)(A)敏感为避免回复敏感为避免回复突变，骨髓瘤细胞应定期通过突变，骨髓瘤细胞应定期通过8 8AGAG传代。传代。 2 2、氨基喋呤对光敏感，保存不当便会失效。、氨基喋呤对光敏感，保存不当便会失效。染色体丢失和克隆竞争染色体丢失和克隆竞争 培养物中有多克隆杂交瘤时就会有培养物中有多克隆杂交瘤时就会有“克隆竞争克隆竞争”，结果往往是不产生抗体的，结果往往是不产生抗体的杂交瘤繁殖起来，产生抗体的杂交瘤逐杂交瘤繁殖起来，产生抗体的杂交瘤逐渐减少消失，这是阳性杂交瘤停止产生渐减少消失，这是阳性杂交瘤停止产生抗体的主要原因。抗体的主要原因。早期反复克隆化是防早期反复克隆化是防止因克隆竞争丧失分泌抗

38、体能力的主要止因克隆竞争丧失分泌抗体能力的主要措施。措施。动物免疫不成功动物免疫不成功 为得到特异性杂交瘤，正确的免疫方法为得到特异性杂交瘤，正确的免疫方法很重要。一般说，细胞颗粒性抗原（如很重要。一般说，细胞颗粒性抗原（如病毒、细菌等）免疫原性好，可不用佐病毒、细菌等）免疫原性好，可不用佐剂；可溶性抗原（如蛋白质、核酸等）剂；可溶性抗原（如蛋白质、核酸等）要使用佐剂。要使用佐剂。3 3转种与扩大培养过程中杂交瘤细胞停止生转种与扩大培养过程中杂交瘤细胞停止生长原因的分析长原因的分析骨髓瘤细胞系污染支原体骨髓瘤细胞系污染支原体 这种情况有时尚可融合成功，得到杂交这种情况有时尚可融合成功，得到杂交

39、瘤，但这种杂交瘤生活力低、转种后往瘤，但这种杂交瘤生活力低、转种后往往死去。往死去。早期杂交瘤不能耐受稀释或机械刺激早期杂交瘤不能耐受稀释或机械刺激 在转种过程中，吹打动作粗暴或把细胞稀释太在转种过程中，吹打动作粗暴或把细胞稀释太多，就会发生转种后死亡。多，就会发生转种后死亡。转种前杂交瘤生长状态不良转种前杂交瘤生长状态不良转种所用的培养瓶、培养板对杂交瘤有毒，或转种所用的培养瓶、培养板对杂交瘤有毒，或培养液内含有毒成分也会使转种失败。培养液内含有毒成分也会使转种失败。4 4不出现杂交瘤的原因分析：不出现杂交瘤的原因分析：用于杂交的免疫小鼠与骨髓细胞在亲缘用于杂交的免疫小鼠与骨髓细胞在亲缘关系

40、上不一致或者有距离或由于其中一关系上不一致或者有距离或由于其中一方发生变异；方发生变异；骨髓瘤细胞生长状况不好；骨髓瘤细胞生长状况不好；小牛血清的质量有问题，小牛血清的质量有问题，PEGPEG毒性太大或毒性太大或作用时间太长。作用时间太长。配制培养基的蒸馏水出现质量问题，或配制培养基的蒸馏水出现质量问题，或培养板或其他用具不洁净而影响细胞的培养板或其他用具不洁净而影响细胞的正常生长。不易发观的支原体污染也是正常生长。不易发观的支原体污染也是常见因素之一。常见因素之一。高度均一性：高度均一性： 纯度很高的均一性抗体纯度很高的均一性抗体 高度专一性：高度专一性： 只对抗原分子上某一抗原决定簇起反应

41、只对抗原分子上某一抗原决定簇起反应 大量产生及稳定性：大量产生及稳定性： 杂交瘤细胞能在体内外无限繁殖并传代杂交瘤细胞能在体内外无限繁殖并传代 三、单克隆抗体的特性三、单克隆抗体的特性1 1、基因诊断、基因诊断2 2、基因治疗、基因治疗3 3、抗癌药物、抗癌药物四、单克隆抗体的应用四、单克隆抗体的应用五、人单抗的制备五、人单抗的制备对人源化抗体的研究，历经了对人源化抗体的研究，历经了人人鼠嵌合鼠嵌合抗体抗体、人源化单克隆抗体人源化单克隆抗体及及人源性单克隆抗人源性单克隆抗体三个发展阶段体三个发展阶段1 人一鼠嵌合抗体(Chimeric Antibodies) 人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区

42、与人抗体的恒人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的恒定区融合而得到的抗体。定区融合而得到的抗体。人一鼠嵌合抗体与鼠单抗相比，人一鼠嵌合抗体与鼠单抗相比，免疫原性大大免疫原性大大降低，利于在人体内应用，降低，利于在人体内应用，所以目前已制备出所以目前已制备出上百种抗各种抗原上百种抗各种抗原( (包括肿瘤相关抗原包括肿瘤相关抗原) )的嵌合的嵌合抗体。抗体。 现在已有5种嵌合抗体进入市场，用于治疗癌症、风湿性关节炎、心肌梗塞和移植排斥。为减少鼠源成分,人们进一步用人的替代鼠,形成更为完全的人源化抗体,即除了3个互补决定区()是鼠源的外,其余全部是人源结构,又称移植抗体或改型抗体 2 人源化单

43、克隆抗体 经过经过CDRCDR移植，移植，抗体的免疫原性极低，而其抗原抗体的免疫原性极低，而其抗原结合能力保持不变结合能力保持不变，结合半抗原及全抗原，结合半抗原及全抗原( (如细胞表面如细胞表面受体、病毒等受体、病毒等) )的改形抗体都已有报道，到现在已有数的改形抗体都已有报道，到现在已有数百种人源化抗体。（美国正式上市的百种人源化抗体。（美国正式上市的1111种治疗性单抗中种治疗性单抗中多数是改型抗体）多数是改型抗体）3 人源性单克隆抗体 抗体库技术抗体库技术是用基因工程方法把人或其他动物是用基因工程方法把人或其他动物的全部抗体的轻、重链可变区基因克隆出来，在原的全部抗体的轻、重链可变区基

44、因克隆出来，在原核载体上表达，然后筛选出所需的特异基因和抗体。核载体上表达，然后筛选出所需的特异基因和抗体。 优点：优点：优点：优点：用细菌克隆取代用细菌克隆取代B B细胞克隆表达抗体，不经细胞克隆表达抗体，不经细胞融合，甚至不经免疫，就可制备针对任何抗原细胞融合，甚至不经免疫，就可制备针对任何抗原的单克隆抗体的单克隆抗体 用用抗体文库技术抗体文库技术制备人源性单克隆抗体。改变制备人源性单克隆抗体。改变了单抗制备的思路。了单抗制备的思路。 另外还兼有许多另外还兼有许多优点优点：如可绕过杂交瘤技术，：如可绕过杂交瘤技术，不需要复杂的基因工程技术不需要复杂的基因工程技术; ; 抗体基因筛选的范抗体

45、基因筛选的范围广围广; ; 技术稳定、可靠、生产周期短技术稳定、可靠、生产周期短; ;可规模化生可规模化生产产; ;适用范围广，既可用于抗体制备，也适用于其适用范围广，既可用于抗体制备，也适用于其它蛋白如激素、酶、药物、随机多肽等的生产。它蛋白如激素、酶、药物、随机多肽等的生产。n融合率低、建株难、不稳定、产量低、人体不能随意免疫n基因工程抗体：用基因工程技术改造现有优良的鼠单抗基因，着眼点在于尽量减少抗体中的鼠源成分，但又尽量保留原有的抗体特异性。n抗体库技术：用细菌克隆取代B细胞克隆表达抗体，不经细胞融合，甚至不经免疫，制备针对任何抗原的单克隆抗体。人杂交瘤技术未获真正突破原因人杂交瘤技术

46、未获真正突破原因六、六、 国内有关研制抗体动向国内有关研制抗体动向 1. 1. 军科院沈倍奋院士实验室军科院沈倍奋院士实验室正处于各种单抗的实验室阶段。正处于各种单抗的实验室阶段。抗破伤风抗体（军科院），用于预防破伤风抗破伤风抗体（军科院），用于预防破伤风2 2医科院肿瘤研究所杨治华实验室医科院肿瘤研究所杨治华实验室正处于人源化单抗的实验室阶段。正处于人源化单抗的实验室阶段。3 3医科院医生所医科院医生所抗抗FabC1027FabC1027用于治疗肝癌用于治疗肝癌 4 4 云大单克隆抗体工程技术有限公司云大单克隆抗体工程技术有限公司运用中空纤维反应器技术、抗体纯化技术、免疫层析运用中空纤维反应

47、器技术、抗体纯化技术、免疫层析胶体金显色技术、试纸膜材纸材筛选搭配技术等成功胶体金显色技术、试纸膜材纸材筛选搭配技术等成功地突破了多个技术地突破了多个技术“瓶颈瓶颈”，近期将主要开发前列腺，近期将主要开发前列腺癌、乙肝、丙肝、性病、艾滋病、重大胎儿缺陷等疾癌、乙肝、丙肝、性病、艾滋病、重大胎儿缺陷等疾病的快速诊断试纸。病的快速诊断试纸。5 5 中科院遗传所中科院遗传所抗乙型脑炎单抗用于乙型脑炎抗乙型脑炎单抗用于乙型脑炎 6 6 北京赛科药业北京赛科药业抗抗CEACEA嵌合抗体用于治疗结肠癌嵌合抗体用于治疗结肠癌7 7 第四军医大学基础部第四军医大学基础部第四军医大学基础部的国家一类新药碘第四军

48、医大学基础部的国家一类新药碘131I131I肝癌单肝癌单抗放免诊断剂和治疗剂，用于原发性肝癌的体内定向诊抗放免诊断剂和治疗剂，用于原发性肝癌的体内定向诊断及体内导向治疗，也处于临床研究中。断及体内导向治疗，也处于临床研究中。8 8 上海华晨治癌药业有限公司上海华晨治癌药业有限公司上海华晨治癌药业有限公司与美国南加大合作开发的碘上海华晨治癌药业有限公司与美国南加大合作开发的碘131I131I人鼠嵌合型肿瘤细胞核单克隆抗体注射液人鼠嵌合型肿瘤细胞核单克隆抗体注射液（131I-chTNT131I-chTNT），用于多种实体瘤，该药物为国家一类），用于多种实体瘤，该药物为国家一类新药。新药。n9 9

49、武汉生物制品研究所武汉生物制品研究所武汉生物制品研究所抗肾移植单抗武汉生物制品研究所抗肾移植单抗OKT3OKT3（注射用鼠源（注射用鼠源性抗人性抗人T T淋巴细胞淋巴细胞CD3CD3抗原单克隆抗体）最早批准上市，抗原单克隆抗体）最早批准上市，具有免疫抑制作用，可逆转对移植器官的排斥反应。具有免疫抑制作用，可逆转对移植器官的排斥反应。该所也正在进行该单抗的人源化。该所也正在进行该单抗的人源化。1010 中国科学院中国科学院研制的单克隆抗体是针对肝癌的。原发性肝癌是一种研制的单克隆抗体是针对肝癌的。原发性肝癌是一种非常凶险的疾病，未经治疗的病人平均生存期仅非常凶险的疾病，未经治疗的病人平均生存期仅4 4个月个月左右，经过生化细胞所与集团科技人员的努力，拥有左右，经过生化细胞所与集团科技人员的努力，拥有自主知识产权的国家一类抗肝癌药物，俗称生物导弹自主知识产权的国家一类抗肝癌药物，俗称生物导弹的肝癌单克隆抗体的研究取得了重大进展。的肝癌单克隆抗体的研究取得了重大进展。 作业1 1、简述用杂交瘤技术生产单克隆抗体、简述用杂交瘤技术生产单克隆抗体的原理和主要过程？的原理和主要过程？2 2、HATHAT选择性培养基的选择原理？选择性培养基的选择原理？