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1、流式细胞术流式细胞术-原理、操作及原理、操作及应用应用主要内容主要内容一、流式细胞仪结构和原理一、流式细胞仪结构和原理流式细胞术简介流式细胞术简介流式细胞仪的光信号检测流式细胞仪的光信号检测流式细胞仪的结构组成流式细胞仪的结构组成荧光抗体的选择荧光抗体的选择流式细胞术数据的存贮、显示与分析流式细胞术数据的存贮、显示与分析二、流式细胞术操作与技巧二、流式细胞术操作与技巧三、流式细胞术在生物医学中的应用三、流式细胞术在生物医学中的应用1.1 流式细胞术简介流式细胞术简介流式细胞术（流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞(或生物学颗粒
2、)的理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。流式细胞仪（流式细胞仪（Flow Cytometer ）是集细胞与分子生物学、流体力学、激光技术、光电子技术、计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。流式细胞术的特点流式细胞术的特点检测对象：单细胞悬液或生物颗粒；检测对象：单细胞悬液或生物颗粒；检测参数：多参数；检测参数：多参数；检测特点：单细胞水平分析；检测特点：单细胞水平分析；检测速度：高速，最高达上万个细胞检测速度：高速，最高达上万个细胞/秒；秒；检测结果：精度高、准确性好；检测结果：精度高、准确性好；可对目标细胞进行分选；可对目标细胞进行分选；流式细胞仪的分类
3、流式细胞仪的分类分析型分析型流式细胞仪流式细胞仪细胞样本分析后最终进入废液桶，不能回收利用。细胞样本分析后最终进入废液桶，不能回收利用。分选型分选型流式细胞仪流式细胞仪既能流式分析，还能对分析的目的细胞进行分选；既能流式分析，还能对分析的目的细胞进行分选；进样管道较长，还需要保持无菌状态，所以分选型流进样管道较长，还需要保持无菌状态，所以分选型流式细胞仪一般只用于分选。式细胞仪一般只用于分选。流式细胞仪的发展及商品化流式细胞仪的发展及商品化1934 Moldavanl: First try (固定式细胞分析固定式细胞分析-流动式流动式)；1953 Crosland-Taylor: 鞘流系统鞘流
4、系统(解决难题解决难题)；1956 Coulter原理原理(血细胞计数器血细胞计数器)；1965 Kamentsky: 分光光度计定量细胞成分和散射光应用；分光光度计定量细胞成分和散射光应用；1967 Kamentsky等设计了细胞分选的装置；等设计了细胞分选的装置；1969 Vandilla等等: 第一台荧光检测细胞计第一台荧光检测细胞计(鞘流聚焦、激光鞘流聚焦、激光)；1972 斯坦福大学斯坦福大学: 研制出荧光激活细胞分选仪研制出荧光激活细胞分选仪(FACS)；1973 BD公司与斯坦福大学合作，研制生产第一台商用流公司与斯坦福大学合作，研制生产第一台商用流 式细胞仪式细胞仪-FACS
5、。1975 Kohler和和Milstein: 单克隆抗体技术单克隆抗体技术(促进流式发展促进流式发展)。BD公司分析型流式细胞仪公司分析型流式细胞仪FACS Calibur 双激光四色，市场覆盖率最高LSR II 双激光六色，三激光八色，四激光十色，分析型最高配FACS Canto II 双激光六色，三激光八色FACS Verse双激光六色，三激光八色BD公司分选型流式细胞仪公司分选型流式细胞仪FACSVantage SEFACSAria IIIInflux1.2 流式细胞术光信号检测流式细胞术光信号检测 光信号的类型光信号的类型散射光信号：散射光信号：与标记荧光素无关，与标记荧光素无关，
6、是细胞的固有参数。是细胞的固有参数。前向散射光前向散射光(forward scatter, FSC);侧向散射光侧向散射光(side scatter, SSC).荧光信号荧光信号自发荧光自发荧光 (细胞色素因子、核黄素细胞色素因子、核黄素)：微弱：微弱特异荧光：标记的荧光素分子发出特异荧光：标记的荧光素分子发出 的荧光，比自发荧光强很多倍。的荧光，比自发荧光强很多倍。1.2.1 散射光信号散射光信号（一）前向散射光（一）前向散射光FSC FSC信号方向与激光束平行，偏离度一般在信号方向与激光束平行，偏离度一般在1 -6度范围内，度范围内，亦称小角度散射光，主要反映被测细胞的亦称小角度散射光，主
7、要反映被测细胞的体积大小和活力体积大小和活力。（二）侧向散射光（二）侧向散射光SSCSSC方向与激光束和液流形成的平面相垂直，亦称方向与激光束和液流形成的平面相垂直，亦称90度散度散射光，其信号强度反映射光，其信号强度反映细胞内部颗粒度和精细结构的变化细胞内部颗粒度和精细结构的变化。（三）散射光的作用（三）散射光的作用实验中，常利用实验中，常利用FSC和和SSC这两种参数的组合，区分不同的这两种参数的组合，区分不同的细胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。细胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。粒细胞粒细胞单核细胞单核细胞淋巴细胞淋巴细胞红细胞、死细胞和碎片红细胞、死细胞和碎片死细胞死
8、细胞或碎片或碎片粘连粘连细胞细胞肿瘤细胞株肿瘤细胞株FSC/SSC散点图散点图死细胞死细胞加药处理后加药处理后FSC/SSC散点图散点图通过通过FSC/SSC散点图，散点图，gate出目标细胞进行分析。出目标细胞进行分析。1.2.2 荧光信号荧光信号（一）荧光：（一）荧光： 物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光。为高能状态，再回到低能状态时释放出的光。发射波长发射波长(荧光波长荧光波长)Emission wavelength激发波长激发波长Excitation wavelength（二）常用荧光素（二）常用荧光素49
9、9nm 蓝色荧光（蓝色荧光（Blue）； 500-549nm，绿色色荧光（光（Green）；550-584nm，黄色，黄色荧光（光（Yellow）； 585-615nm，橙色，橙色荧光（光（Orange）；616-700nm，红色色荧光（光（Red）； 700nm，远红外外荧光（光（Far-Red）。标记抗体的荧光素标记抗体的荧光素荧光素分子光素分子激激发光波光波长（nm）发射光波射光波长（nm）中文名中文名FITC490520异硫异硫氰酸酸荧光素光素PE488575藻藻红蛋白蛋白PerCP490675多甲藻叶多甲藻叶绿素蛋白素蛋白APC650660别藻青蛋白藻青蛋白PE-Cy5496/546
10、670藻藻红蛋白蛋白-花青素花青素5PE-Cy7496/546767藻藻红蛋白蛋白-花青素花青素7Alexa Flour 488495519Alexa Flour 647650665核酸荧光染料核酸荧光染料PI（碘化丙（碘化丙啶 535, 623） 可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中。常用可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中。常用于于DNA分析，需要用分析，需要用RNase处理细胞排除处理细胞排除RNA对对DNA荧光定量的影响；荧光定量的影响；PI不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。7-AAD（7-氨基放氨基放线菌素菌素D 545, 647 ） 以插入的方式与以插
11、入的方式与DNA链的链的G-C碱碱基对结合，不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。基对结合，不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。DAPI（4,4,6-二脒基二苯基吲哚二脒基二苯基吲哚 358, 456） 可以非嵌入方式与可以非嵌入方式与DNA链链上的上的A-T碱基对特异性结合。变异系数明显小于其他染料，一种理想碱基对特异性结合。变异系数明显小于其他染料，一种理想的的DNA定量染料。定量染料。Hoechst（343, 450）常见为常见为Hoechst33342和和Hoechst33258，非嵌入的，非嵌入的方式与方式与DNA链上的链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞碱基对结合。能对
12、活细胞染色，用于活细胞DNA定量分析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。定量分析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。PY（派若宁（派若宁 560, 573） RNA染料，能进入活细胞。染料，能进入活细胞。AO（吖啶橙橙 509, 525） DNA、RNA染料，染色后染料，染色后DNA呈黄绿色荧光，呈黄绿色荧光，RNA呈橙黄色荧光，可进行呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。双参数分析。1.3 流式细胞仪的结构组成流式细胞仪的结构组成液流系统液流系统流动室流动室液流驱动系统液流驱动系统光学系统光学系统激发光源激发光源光束收集系统光束收集系统电子系统电子系统光电转换器光电转换器数据处理系统
13、数据处理系统细胞分选系统细胞分选系统喷嘴喷嘴电偏转板电偏转板样本收集器样本收集器1.3.1 液流系统液流系统鞘流技术：根据层流原理发鞘流技术：根据层流原理发展起来的技术，可以实现两展起来的技术，可以实现两种液体的同轴流动，样本细种液体的同轴流动，样本细胞流位于轴心稳定流动，外胞流位于轴心稳定流动，外面包裹有鞘液面包裹有鞘液(sheath)。流体动力学聚焦：稳定的液流体动力学聚焦：稳定的液流从截面积较大的部分流入流从截面积较大的部分流入截面积较小的部分后，有一截面积较小的部分后，有一个聚焦收缩作用，细胞流直个聚焦收缩作用，细胞流直径被约束在径被约束在10-20um，避免，避免了多个细胞重叠进入检
14、测区。了多个细胞重叠进入检测区。鞘液鞘液鞘液鞘液细胞流细胞流激光照射点激光照射点流体动力学聚焦示意图流体动力学聚焦示意图1.3.2 光学系统光学系统（一）（一）激发光源激发光源 ：激光器：激光器气体激光器：氩离子气体激光器：氩离子(488nm、355nm)、氦氖、氦氖(633nm)、氪离子、氪离子 (647nm)、氪氩、氪氩(568nm)；染料激光器：如氩离子激光泵浦的染料激光器：如氩离子激光泵浦的Rhodomin 6G水溶液染料激水溶液染料激 光器，发出光器，发出550-650nm可变波长可变波长激发光；激发光；半导体激光器：价格低、结构简单、寿命长。半导体激光器：价格低、结构简单、寿命长。
15、BD的的FACS Calibur 已采用已采用635nm半导体激光器。半导体激光器。激光特点：单波长、高能量、小发射角、高稳定性光照。激光特点：单波长、高能量、小发射角、高稳定性光照。现在仪器常配有仪器选配现在仪器常配有仪器选配2-4根激光器，波长多为根激光器，波长多为488nm、633nm和和355nm、405nmUV；（二）光收集系统（二）光收集系统滤光片滤光片的组成的组成长通滤片长通滤片(LP)：只允许特定波长以上的光束通过；：只允许特定波长以上的光束通过；短通滤片短通滤片(SP)：只允许特定波长以下的光束通过；：只允许特定波长以下的光束通过；带通滤片带通滤片(BP)：只允许一定波长范围
16、内的光束通过。：只允许一定波长范围内的光束通过。Long pass Short pass Band pass460 500 540SP 500SP 500LP 500LP 500BP500/50BP500/50460 500 540460 500 540全反射光路全反射光路FACS Aria流式细胞仪器信号检测系统流式细胞仪器信号检测系统PE-Cy7PerCP-Cy5.5PE-TexasRedPEFITCSSC1.3.3 电子系统电子系统光电检测器光电检测器将光信号转换成电子信号。将光信号转换成电子信号。前置放大电路前置放大电路将信号等比例放大，输出电脉冲信号。将信号等比例放大，输出电脉冲信号
17、。模数转换器模数转换器将模拟的电脉冲信号转换成数字信号。将模拟的电脉冲信号转换成数字信号。数据处理系统数据处理系统计算机系统数据采集、分析。计算机系统数据采集、分析。（一）（一）光电检测器光电检测器(photodetector)光电二极管光电二极管(photodiode)光灵敏度低，测定强信号（光灵敏度低，测定强信号（FSC）；）；光电倍增管光电倍增管(photomultiplier, PMT)光灵敏度高，测定弱信号（光灵敏度高，测定弱信号（SSC, FL1, FL2, FL3, FL4)。PMT前向散射光前向散射光光电二极管光电二极管（二）（二）电信号两种放大方式电信号两种放大方式由于光信号
18、比较弱，需将其等比例放大，方便计算机分析由于光信号比较弱，需将其等比例放大，方便计算机分析处理，一般信号的放大可以使用处理，一般信号的放大可以使用线性线性或或对数对数两种方式。两种方式。 线性线性(linear; lin) 对数对数(logarithmic; log)一般一般FSC和和SSC变异范围较小，故使用线性放大；荧光信号变异范围较小，故使用线性放大；荧光信号变异范围较大，多使用对数放大。变异范围较大，多使用对数放大。（三）（三）荧光信号的面积荧光信号的面积A、宽度、宽度W和高度和高度H细胞通过激光检测区域时，产生的荧光信号被光电倍增管接收，形成脉冲信号。荧光信号脉冲形成示意图荧光信号脉
19、冲形成示意图TimeVoltsPulse AreaPulse HeightPulse Width0荧光信号脉冲的面积、高度和宽度荧光信号脉冲的面积、高度和宽度Width = Area/Height一个信号脉冲有高度、面积和宽度。 光信号电信号数字光信号电信号数字信号信号通道通道(channel) 一个光电检测器就是一个通道，有多少个光电二极管一个光电检测器就是一个通道，有多少个光电二极管/倍增管，就有多少个通道：倍增管，就有多少个通道：散射光通道散射光通道: FSC通道和通道和SSC通道；通道；荧光通道荧光通道通道命名方式：通道命名方式：以以FL(fluorescence)加数字命名，如加数字
20、命名，如FL1、FL2、FL3等。等。以该通道接收的主要荧光素命名，如以该通道接收的主要荧光素命名，如FITC通道、通道、PE通道、通道、APC通道等。通道等。For example：FACSCalibur有有488nm和和633nm两根激光器，两根激光器，488nm能检测能检测FSC、SSC、FL1(FITC)、 FL2(PE)、 FL3(PerCP)，635能检测能检测FL4(APC)，代表，代表Calibur有有6个通道，最多能同个通道，最多能同时检测时检测4个荧光，个荧光，6种参数。种参数。1.3.4 流式分选流式分选 电荷式电荷式分选分选超声振动器超声振动器(15-100kHz)液流
21、充电系统液流充电系统高压偏转板高压偏转板收集装置收集装置(流式管、培养板流式管、培养板)lasers断裂点断裂点(充电充电)高压偏转板高压偏转板四路分选原理四路分选原理电荷式分选装置电荷式分选装置分选指标分选指标分选时间由三方面决定：进样速度、目标细胞所占比例、分选时间由三方面决定：进样速度、目标细胞所占比例、需要收集的细胞数。需要收集的细胞数。需要细胞数目标细胞所占比例(%)15501041.7 min20 s2 s10516.8 min3.4 min20 s1062.8 h3.4 min3.4 min1071.2 天5.6 h34 min分选时间表分选时间表(机器流速机器流速10000个个
22、/s时时)分选速度、分选纯度和分选收获率，相互影响。分选速度、分选纯度和分选收获率，相互影响。分选纯度分选纯度指被分选出来的细胞所占的百分比，一般能达指被分选出来的细胞所占的百分比，一般能达99%以上。以上。分选收获率分选收获率是指被分选出的细胞与原来总细胞的百分比。是指被分选出的细胞与原来总细胞的百分比。分选纯度和收获率永远是相互矛盾的，纯度提高，收获率分选纯度和收获率永远是相互矛盾的，纯度提高，收获率降低，反之亦然。降低，反之亦然。富集模式富集模式(enrich mode)纯化模式纯化模式(purify mode)单细胞模式单细胞模式(single cell mode)1.4 荧光抗体的选
23、择荧光抗体的选择A 根据流式细胞仪选择抗体根据流式细胞仪选择抗体流式细胞仪能检测的通道数流式细胞仪能检测的通道数(由激光器种类、数量和使用由激光器种类、数量和使用的光学滤片决定的光学滤片决定)。如。如FACSCalibur：多色标记荧光素搭配原则：每个通道只能选择一种荧光素；多色标记荧光素搭配原则：每个通道只能选择一种荧光素；各个通道之间的荧光素可以随意搭配。各个通道之间的荧光素可以随意搭配。 FACSCalibur常用四色搭配：常用四色搭配：FITC、PE、PerCP、APC。488FL1BP 530/30515-545FITC、AF488FL2BP 585/42564-606PEFL367
24、0 LP670PE-Cy5、PerCP、PE-Cy7635FL4BP 661/16653-669APC、AF647B 根据抗原表达强弱合理选择根据抗原表达强弱合理选择抗体抗体不同的荧光素强度有所不同；不同的荧光素强度有所不同；高表达的抗原可用不太高表达的抗原可用不太“亮亮”的染料，更的染料，更“亮亮”的荧光素分的荧光素分配给表达低的抗原：配给表达低的抗原： CD4-FITC、CD25-APC、Foxp3-PEC 选择荧光波谱间光谱重叠较小的荧光染料进行组合，选择荧光波谱间光谱重叠较小的荧光染料进行组合，同时需要正确的调节补偿。同时需要正确的调节补偿。CD51.5 FCM数据存储、显示与分析数据
25、存储、显示与分析标准的标准的FCM数据采用数据采用列表模式（列表模式（list mode），记录了每个，记录了每个细胞的所有参数的信息。细胞的所有参数的信息。每个细胞检测每个细胞检测5个参数，那么获取个参数，那么获取10000个细胞，容量为个细胞，容量为510000（字或双字）。（字或双字）。Event #FSCSSCFL1 FITCFL2 PEFL3APC110050010650421105057007006390480720670104954901572015FCM数据显示方式数据显示方式单参数直方图单参数直方图(Histogram)双参数数据显示：双参数数据显示：散点图散点图(Dot P
26、lot)伪彩图伪彩图(Pseudo-color Plot)等高线图等高线图(Contour Plot)密度图密度图(Density Plot)假三维图假三维图(Pseudo 3D Plot)三维图三维图(3D Plot)常用分析软件常用分析软件CellQuestDivaFlowJOWinMDIFCS Express直方图直方图Histogram细胞的某一单参数数据的统计分布图，横坐标表示荧光信细胞的某一单参数数据的统计分布图，横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度的值，单位是道数，纵坐标一般号或散射光信号相对强度的值，单位是道数，纵坐标一般是细胞数。是细胞数。Event #FL1 FITC11
27、0270037204150101001000CountsFITC荧荧光强度光强度横坐标既可以是线性的，也可以是对数的。横坐标既可以是线性的，也可以是对数的。DNA倍体分析倍体分析抗原表达分析抗原表达分析Overlay图图散点图散点图散点图中每个点代表一个细胞，散点图中每个点代表一个细胞，X轴与轴与Y轴分别代表一种参轴分别代表一种参数，优点是比直方图直观。数，优点是比直方图直观。FL1FL2散点图和伪彩图散点图和伪彩图等高图和密度图等高图和密度图等高图：类似于地图中的等高线，同一条线上的细胞数目等高图：类似于地图中的等高线，同一条线上的细胞数目相等，越在里面的曲线代表细胞数目越多。相等，越在里面
28、的曲线代表细胞数目越多。密度图：点密度越大的地方细胞越多，点密度越小的地方密度图：点密度越大的地方细胞越多，点密度越小的地方细胞少。细胞少。假三维图和三维图假三维图和三维图SSC-HeightFSC-HeightCountsSSC CD45 CD14 设门与数据分析设门与数据分析门门(Gate，简写，简写G)是流式细胞术中的一个重要术语，是流式细胞术中的一个重要术语，FCM数数据分析过程实际上就是选门和设门的过程。据分析过程实际上就是选门和设门的过程。椭圆形椭圆形圆形圆形矩形矩形任意形状任意形状R(Region，区域，区域)。门可以是单一区域。门可以是单一区域(G=R1)，也可以是几，也可以是
29、几个区域组合在一起：个区域组合在一起：G=R1 and R2; G=R1 or R2; G=R1 not R2。十字门十字门线性门线性门二、流式细胞术操作与技巧二、流式细胞术操作与技巧流式流式细胞胞术操作流程操作流程：培养细胞血液骨髓新鲜组织石蜡包埋单细胞悬液制备荧光染色上机检测表型测定细胞分选继续培养FISHPCR统计学分析2.1 单细胞悬液制备单细胞悬液制备2.2 免疫荧光标记免疫荧光标记2.3 对照的设置对照的设置2.4 光谱重叠与补偿光谱重叠与补偿2.1 单细胞悬液制备单细胞悬液制备2.1.1 新鲜实体组织的样本制备新鲜实体组织的样本制备 对于不同组织来源的实体组织和实体瘤标本，应该根
30、据对于不同组织来源的实体组织和实体瘤标本，应该根据各自特点选择不同的分散细胞方法，以期达到单细胞各自特点选择不同的分散细胞方法，以期达到单细胞产量产量高高、损伤小损伤小的目的。常用方法有：的目的。常用方法有：酶消化法酶消化法机械法机械法化学试剂处理法化学试剂处理法酶消化法酶消化法：根据分散组织类型来确定使用的酶类：根据分散组织类型来确定使用的酶类：胰蛋白酶胰蛋白酶水解酯键、肽键；水解酯键、肽键；胶原酶胶原酶降解几种分子类型的胶原；降解几种分子类型的胶原；溶菌酶溶菌酶水解糖蛋白、肽的糖苷键；水解糖蛋白、肽的糖苷键；弹性蛋白酶弹性蛋白酶消化糖蛋白、弹性蛋白的纤维。消化糖蛋白、弹性蛋白的纤维。1.1
31、.将新鲜组织置于离心管中，加入将新鲜组织置于离心管中，加入1-2ml酶消化酶消化20-30min（恒温（恒温37或室温），间断振荡或吹打；或室温），间断振荡或吹打；2.2.终止消化，收集细胞悬液，终止消化，收集细胞悬液，300目尼龙网过滤，除去目尼龙网过滤，除去细胞团块，低速离心除去细胞碎片；细胞团块，低速离心除去细胞碎片；3.3.将制备好的单细胞悬液进行荧光标记或保存备用。将制备好的单细胞悬液进行荧光标记或保存备用。 注意注意：酶的使用浓度、温度、消化时间、酶活性的酶的使用浓度、温度、消化时间、酶活性的pH值。值。机械法特点机械法特点：易造成细胞碎片和团块，实际操作时，应注意碎：易造成细胞碎
32、片和团块，实际操作时，应注意碎片和团块的去除，常与其他方法（如酶消化法）配合使用片和团块的去除，常与其他方法（如酶消化法）配合使用。组织解离器机械法机械法：有有剪碎法剪碎法、网搓法网搓法、研研磨法磨法等。等。利用机械方法、物理方利用机械方法、物理方法给予组织交大的压力，法给予组织交大的压力，使细胞从组织间分散开使细胞从组织间分散开来。来。化学处理法化学处理法：作用原理：将组织细胞间起黏着作用的钙、镁离子置作用原理：将组织细胞间起黏着作用的钙、镁离子置换出来，从而使细胞分散开来，常用试剂有换出来，从而使细胞分散开来，常用试剂有EDTA、EGTA、TPB等。等。EDTA是一种螯合剂，可以和组织间的
33、钙、镁离子形成是一种螯合剂，可以和组织间的钙、镁离子形成螯合物，实际运用中常采用螯合物加酶法（主要是胰蛋白螯合物，实际运用中常采用螯合物加酶法（主要是胰蛋白酶）。酶）。特点特点：用化学法细胞存活率低、细胞产额低，细胞碎片和：用化学法细胞存活率低、细胞产额低，细胞碎片和聚集量不稳定。聚集量不稳定。机械法往往造成严重的细胞损伤，而结果却是较低的细胞机械法往往造成严重的细胞损伤，而结果却是较低的细胞产量，注意去除细胞碎片和团块以免影响产量，注意去除细胞碎片和团块以免影响FCM结果，如低结果，如低速离心去碎片、尼龙网过滤团块等。速离心去碎片、尼龙网过滤团块等。酶消化法、化学试剂处理法对实体组织的分散效
34、果较理想，酶消化法、化学试剂处理法对实体组织的分散效果较理想，但会造成所测化学成分的不良影响。但会造成所测化学成分的不良影响。根据实验目的去选择合适的单细胞悬液制备方法，最终要根据实验目的去选择合适的单细胞悬液制备方法，最终要求细胞呈单个分散状态；细胞碎片、团块尽量少；细胞活求细胞呈单个分散状态；细胞碎片、团块尽量少；细胞活性不受到明显损伤，保证下一步荧光染色。性不受到明显损伤，保证下一步荧光染色。2.1.2 石蜡包埋组织样本制备石蜡包埋组织样本制备切片：将石蜡组织切成50um厚的组织片4-5片，放入1试管中；脱脂：加入二甲苯3-5ml脱脂，室温下1-2天，脱净后弃二甲苯；水化：依次加入100
35、%、95%、70%、50%梯度乙醇5ml，每步10 min，去乙醇后加入蒸馏水3-5ml，3-5min后弃水；消化：加入5ml 0.5%胃蛋白酶（pH 1.5-2.0），37恒温水浴30 min，每隔5-10min振荡一次；终止消化：加冷的PBS或生理盐水终止消化；过滤：用300目尼龙网过滤，未消化好的组织可做第二次消化；收集细胞悬液：将过滤液离心沉淀，再用PBS漂洗1-2次，低速离心沉淀去除碎片；根据实验目的标记荧光抗体，或保存细胞备用。2.1.3 血液、骨髓样本制备血液、骨髓样本制备外周血单个核细胞外周血单个核细胞PBMC的分离的分离血液层Ficoll层血浆层PBMCFicoll层红细胞层
36、离心前离心后Ficoll密度梯度离心法分离密度梯度离心法分离PBMC注意：注意：由于多核粒细胞比较大，由于多核粒细胞比较大，粒细胞沉降在红细胞层，粒细胞沉降在红细胞层，所以该法不适合粒细胞所以该法不适合粒细胞研究；研究；该法操作过程中可能丢该法操作过程中可能丢失一些有意义的细胞或失一些有意义的细胞或细胞亚群，所以临床上细胞亚群，所以临床上一般不主张分离血液或一般不主张分离血液或骨髓的单个核细胞。骨髓的单个核细胞。红细胞裂解液去除红细胞红细胞裂解液去除红细胞原理：红细胞裂解液成分为低渗的原理：红细胞裂解液成分为低渗的NH4Cl溶液，利用双溶液，利用双凹型的红细胞膜抗性差，白细胞膜抗性比较好的特点
37、，凹型的红细胞膜抗性差，白细胞膜抗性比较好的特点，加入低渗透压的红细胞裂解液时，红细胞膜胀破，而白加入低渗透压的红细胞裂解液时，红细胞膜胀破，而白细胞膜不受影响，从而达到去除红细胞的目的。细胞膜不受影响，从而达到去除红细胞的目的。2.1.4 培养细胞单细胞悬液制备培养细胞单细胞悬液制备2.1.5 体液脱落细胞样本制备体液脱落细胞样本制备悬浮生长细胞悬浮生长细胞吸管反复吹打吸管反复吹打贴壁生长细胞贴壁生长细胞消化处理消化处理离心获得单离心获得单细胞悬液细胞悬液洗脱液洗脱液尿液尿液胸腹水胸腹水离心收集细胞，离心收集细胞，用生理盐水或用生理盐水或PBS洗涤洗涤3次次300目尼龙膜目尼龙膜过滤后离心过
38、滤后离心沉淀去上清沉淀去上清单细胞单细胞悬液悬液FCM可检测下列细胞成分：可检测下列细胞成分：表面标记物表面标记物胞浆标记物胞浆标记物核内标记物核内标记物可溶性成分可溶性成分2.2 免疫荧光染色免疫荧光染色黏附因子黏附因子表面受体表面受体细胞因子细胞因子分泌到胞外的分泌到胞外的细胞因子细胞因子胞内抗原胞内抗原核酸含量核酸含量核内抗原核内抗原荧光素偶联抗体荧光素偶联抗体抗体上偶联荧光素抗体上偶联荧光素(FITC、PE等等)，通过，通过抗原抗体反应让目标细胞特异性的带抗原抗体反应让目标细胞特异性的带上荧光。上荧光。染色过程即抗原抗体反应过程。染色过程即抗原抗体反应过程。荧光染料荧光染料/荧光化合物
39、荧光化合物PI、DAPI等插入核酸链中；等插入核酸链中；CFSE和蛋白质共价结合；和蛋白质共价结合；Annexin V-FITC检测凋亡。检测凋亡。荧光蛋白荧光蛋白如如GFP，不需要染色，直接检测。，不需要染色，直接检测。免疫荧光染色主要包括直接和间接免疫荧光染色两种方法。免疫荧光染色主要包括直接和间接免疫荧光染色两种方法。间接标记的方法难以进行多色标记，而且操作复杂、信噪间接标记的方法难以进行多色标记，而且操作复杂、信噪比高，所以一般首先直标荧光抗体。比高，所以一般首先直标荧光抗体。荧光抗体荧光抗体荧光二抗荧光二抗第一抗体第一抗体直接标记直接标记间接标记间接标记一般检测时，获取一般检测时，获
40、取12万个细胞，标记万个细胞，标记0.51106细胞即细胞即可。可。下述情况细胞量需相应增加：检测胞内下述情况细胞量需相应增加：检测胞内/核内抗原，离心核内抗原，离心次数多；细胞周期乙醇固定损失细胞多；检测细胞在标本次数多；细胞周期乙醇固定损失细胞多；检测细胞在标本中比例低中比例低 0.51106个细胞个细胞孵育体积孵育体积50-100ul上机体积上机体积200-500ul终浓度约终浓度约1106个个/ml加染料加染料洗涤后补洗涤后补加液体加液体细胞表面抗原标记细胞表面抗原标记表面抗原分析是流式应用中最广泛的，标记步骤表面抗原分析是流式应用中最广泛的，标记步骤也相对简单。也相对简单。标记：取标
41、记：取0.51106细胞，加入适量抗体细胞，加入适量抗体(根据抗体说明根据抗体说明书书)，充分混匀后，充分混匀后(总体积总体积50-100ul)， 4 避光孵育避光孵育10-30min。洗涤：加入洗涤：加入1ml PBS洗液，洗液，300g离心洗涤离心洗涤5min。上机检测：弃去上清后加入上机检测：弃去上清后加入200-500ul PBS，重悬细胞后，重悬细胞后立即上机检测；如不能及时上机检测，则加入同样体立即上机检测；如不能及时上机检测，则加入同样体积的积的1%多聚甲醛，混匀后置于多聚甲醛，混匀后置于4 冰箱内保存，一般不冰箱内保存，一般不超过超过24h。胞内抗原荧光标记胞内抗原荧光标记细胞
42、内抗原：如细胞内抗原：如MPO；核内抗原：如核内抗原：如FoxP3；细胞内细胞因子细胞内细胞因子(胞内因子胞内因子)：IFN-r、IL-4、IL-17等。等。固定：固定：4多聚甲醛多聚甲醛破膜破膜/透化透化0.05%皂素皂素(saponin)；0.01% Triton X-100 70% 乙醇乙醇膜表面抗原染色：分别加入相应的荧光素标记抗体和适量膜表面抗原染色：分别加入相应的荧光素标记抗体和适量细胞标本，充分混匀后避光孵育细胞标本，充分混匀后避光孵育10-30min。洗涤：加洗涤：加1ml PBS洗液，洗液，300g离心离心5min。固定：去上清后加入固定：去上清后加入500ul 4%多聚甲醛
43、，固定多聚甲醛，固定20min。透化：离心洗去固定剂后，加皂素透化：离心洗去固定剂后，加皂素500 ul，透化，透化10min。胞内抗原染色：离心洗去透化液后，加入相应荧光素标记胞内抗原染色：离心洗去透化液后，加入相应荧光素标记抗体，混匀后室温避光孵育抗体，混匀后室温避光孵育30 min。洗涤：加洗涤：加1ml PBS洗液，洗液，300g离心离心5min。上机检测：弃去上清后加入上机检测：弃去上清后加入PBS 200-500 ul后上机检测。后上机检测。2.3 对照的设置对照的设置 空白对照空白对照细胞内物质自身也发出荧光，能被细胞内物质自身也发出荧光，能被FCM灵敏的检测到，这灵敏的检测到，
44、这种未染色的细胞自身发出的一些荧光称为自发荧光。种未染色的细胞自身发出的一些荧光称为自发荧光。设置空白对照（未染色的细胞），用以区分细胞的自发荧设置空白对照（未染色的细胞），用以区分细胞的自发荧光和特异性荧光，避免假阳性的结果。光和特异性荧光，避免假阳性的结果。流式结果中荧光强弱是一个相对值，流式结果中荧光强弱是一个相对值，光电倍增管电压越大，电子信号越光电倍增管电压越大，电子信号越强；电压越小，信号越弱。强；电压越小，信号越弱。通过调节电压，使阴性对照管的荧通过调节电压，使阴性对照管的荧光强度处于阴性的位置，实验组的光强度处于阴性的位置，实验组的荧光值都是相对对照组。荧光值都是相对对照组。0
45、01001002阳性对照阳性对照Positive Control设置阳性对照是为了检测荧光抗体是否有效，并不是每次设置阳性对照是为了检测荧光抗体是否有效，并不是每次分析时都必须设置：分析时都必须设置：使用新的荧光素抗体时；使用新的荧光素抗体时；使用存储时间较长的荧光素抗体时。使用存储时间较长的荧光素抗体时。设置阳性对照的方法：设置阳性对照的方法：用肯定表达有该抗原的细胞来检测；用肯定表达有该抗原的细胞来检测；已经证明有效的、偶联其他荧光素的该抗原的抗体。已经证明有效的、偶联其他荧光素的该抗原的抗体。单标对照单标对照Single Staining Control两色或多色实验时须设置单标对照，用
46、于补偿的调节；两色或多色实验时须设置单标对照，用于补偿的调节；单标实验时不需要。单标实验时不需要。2.4 光谱重叠与补偿光谱重叠与补偿当细胞携带两种以上荧光素激发出不同波长荧光时，理论上可选择滤当细胞携带两种以上荧光素激发出不同波长荧光时，理论上可选择滤光片使每种荧光仅被相应的通道检测到。但由于目前使用的各种荧光光片使每种荧光仅被相应的通道检测到。但由于目前使用的各种荧光染料都是染料都是宽发射谱宽发射谱性质，虽然它们之间各自发射的峰值各不相同，但性质，虽然它们之间各自发射的峰值各不相同，但发射谱范围有一定的重叠，因而少量的荧光信号会被另一通道检测到，发射谱范围有一定的重叠，因而少量的荧光信号会
47、被另一通道检测到，这种现象就是这种现象就是光谱重叠光谱重叠(spectral overlap)。FL1 530/30FL2 585/42发射波长FITC发射谱PE发射谱实验操作中，常利用电子技术和计算机软件设置的方法将实验操作中，常利用电子技术和计算机软件设置的方法将串入相邻荧光通道的信号扣除，这种技术称为荧光补偿串入相邻荧光通道的信号扣除，这种技术称为荧光补偿(fluorescence compensation)。FL-1(FITC)FL-2(PE)FL-1(FITC)FL-2(PE)FL2 - %FL1FL-1(FITC)FL-2(-)FL-1(-)FL-2(PE)FL1 - %FL2补偿
48、前补偿前补偿后补偿后FITC单标单标PE 单标单标未补偿未补偿正确补偿正确补偿FITC-PE补偿太大补偿太大PE-FITC补偿太大补偿太大补偿调节要合适补偿调节要合适三、流式细胞术的应用三、流式细胞术的应用细胞大小细胞粒度细胞表面面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量细胞结构特异性抗原（细胞表面/胞浆/核）细胞内细胞因子细胞活性酶活性激素结合位点细胞受体细胞功能在上述分析基础上进行分选在上述分析基础上进行分选生物学功能的应用生物学功能的应用信号转导信号转导- -磷酸化磷酸化细胞因子定量检测细胞因子定量检测CBACBA微球微球技术技术遗传毒理遗传毒理- -微核实验微核实验吞噬功能吞
49、噬功能MicroRNAMicroRNA作用后蛋白表达研究作用后蛋白表达研究多重荧光蛋白检测多重荧光蛋白检测细胞群比例胞群比例测定定细胞表型胞表型细胞周期胞周期细胞凋亡胞凋亡细胞增殖胞增殖细胞活性胞活性GFP转染染绝对计数数胞内胞内细胞因子胞因子检测钙离子流离子流动性性检测经典典应用用新新应用用应用领域应用领域植物植物DNADNA含量测定含量测定植物植物荧光蛋白检测荧光蛋白检测 工业微生物工业微生物精子活性检测精子活性检测细菌研究细菌研究海洋微生物海洋微生物制药制药基因与蛋白工程基因与蛋白工程基础免疫学研究基础免疫学研究 免疫标志的检测免疫标志的检测 调节性调节性T T细胞细胞 巨噬细胞免疫功能
50、的检测巨噬细胞免疫功能的检测感染免疫感染免疫干细胞研究干细胞研究肿瘤学肿瘤学细胞治疗研究细胞治疗研究自身免疫性疾病自身免疫性疾病糖尿病糖尿病肥胖肥胖传统传统领域领域新新领域领域3.1 检测细胞周期检测细胞周期3.2 检测细胞凋亡检测细胞凋亡3.3 检测细胞增殖检测细胞增殖3.4 免疫细胞亚型检测免疫细胞亚型检测3.5 检测细胞因子检测细胞因子3.6 检测细胞吞噬功能检测细胞吞噬功能3.7 流式分选流式分选定义：是指能持续分裂的真核细胞从一次有丝分裂结束后，再到下一次分裂结束的这种周而复始的循环过程。细胞周期包括有丝分裂期（M期）和分裂间期（G1，S和G2期）DNA合成前期合成前期相对静止期相对
51、静止期DNA合成期合成期DNA合合成后期成后期细胞分裂期细胞分裂期2倍体倍体4倍体倍体2倍体倍体-4-4倍体倍体3.1 检测细胞周期检测细胞周期DNA含量在细胞周期的体现含量在细胞周期的体现细胞周期细胞周期DNA倍体倍体G0期：DNA合成静止2CG1期：DNA合成前期2CS期：DNA合成期2C-4CG2期：DNA合成结束4CM期：有丝分裂4C正常细胞DNA含量稳定在2C水平性细胞DNA含量为1C凋亡细胞DNA断裂，DNA含量1.1 DI1.1 或或0.92.1 DI2.1 或或1.9)15%15%的的S S期期细细胞胞，并并伴有伴有G0/G1G0/G1峰的峰的CV9%CV9%，提示为肿瘤或增生
52、旺盛的病变，提示为肿瘤或增生旺盛的病变 DNA倍体分析倍体分析病变肿瘤细胞常出现结构和染色体异常，流式检测病变肿瘤细胞常出现结构和染色体异常，流式检测DNA含含量能反映异倍体情况。量能反映异倍体情况。二倍体二倍体异倍体异倍体异倍体异倍体1. 1. 变异系数变异系数（Coefficient of Variation，CV）细胞群体之间细胞群体之间DNADNA含量的细微差别可能具有显著的生物学意义。含量的细微差别可能具有显著的生物学意义。表示表示流式分析中流式分析中DNADNA含量的分辨率或精确度含量的分辨率或精确度。通常由通常由G0/G1G0/G1峰的峰的CVCV来反映来反映 【%CV=%CV=
53、（SD/meanSD/mean）x 100x 100】一般一般CVCV越小，峰形越好，越尖锐越小，峰形越好，越尖锐。能能控制在控制在5%5%左右精度足够，左右精度足够，一般一般小于小于8%-10%8%-10%认为可信。认为可信。2. DNA2. DNA指数（指数（DNA indexDNA index，DIDI）DNADNA指指数数，指指的的是是肿肿瘤瘤样样本本G0/G1G0/G1峰峰的的平平均均荧荧光光强强度度与与正正常常二二倍倍体体G0/G1G0/G1峰峰的的平平均均荧荧光强度（光强度（MeanMean） 之间的比值。之间的比值。DIDI为为1 1 意味着二倍体（意味着二倍体（2c2c）（一
54、般正常范围为）（一般正常范围为0.9-1.10.9-1.1）。）。高于或低于高于或低于1 1表示细胞表示细胞/ /组织中组织中DNADNA含量异常含量异常, ,常称为常称为DNADNA非整倍体。非整倍体。3. 3. 倍体（倍体（PloidyPloidy）原指染色体数目，流式中为描述总的原指染色体数目，流式中为描述总的DNA含量。含量。二倍体细胞有正常细胞的二倍体细胞有正常细胞的DNA含量但不除外染色体异常。含量但不除外染色体异常。二倍体：二倍体：DI为为0.85-1.15四倍体：四倍体：DI为为1.9-2.1 多倍体：多倍体：DI 2.1，其余其余DI值均为非整倍体值均为非整倍体DNA分析常用
55、术语分析常用术语异倍体异倍体精子单倍体细胞精子单倍体细胞3.2 检测细胞凋亡检测细胞凋亡细胞死亡方式主要有两种：包括细胞坏死细胞死亡方式主要有两种：包括细胞坏死(necrosis)和细胞和细胞凋亡凋亡(apoptosis)。细胞凋亡，也称细胞程序性死亡，是细胞受基因调控的一细胞凋亡，也称细胞程序性死亡，是细胞受基因调控的一种主动性的、高度有序的结束自己生命的过程。种主动性的、高度有序的结束自己生命的过程。凋亡细胞在形态学和生化上有明显的特征，如细胞皱缩、凋亡细胞在形态学和生化上有明显的特征，如细胞皱缩、核固缩、细胞膜卷曲、核固缩、细胞膜卷曲、DNA片段化、线粒体电位发生变化。片段化、线粒体电位
56、发生变化。根据这些特征，流式有多种方法能定性及定量的检测细胞根据这些特征，流式有多种方法能定性及定量的检测细胞凋亡情况。凋亡情况。检测细胞凋亡的方法检测细胞凋亡的方法胞质密度增加细胞体积缩小膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻形形态学学变化化DNA片段化线粒体膜电位消失生物化学生物化学变化化蛋白水解酶活化正常胸腺细胞正常胸腺细胞凋亡胸腺细胞凋亡胸腺细胞传统检测凋亡的方法：传统检测凋亡的方法：显微镜下进行形态学的观察；显微镜下进行形态学的观察；细胞细胞DNA提取物的电泳实验；提取物的电泳实验；细胞内凋亡信号通路相关蛋白的表达研究（如细胞内凋亡信号通路相关蛋白的表达研究（如ELISA, IHC, Western
57、 blot）；）；细胞凋亡流式检测方法细胞凋亡流式检测方法细胞凋亡细胞凋亡细胞膜变化的检测Annexin V/PI双染法SYTO/PI双染法线粒体损伤检测线粒体膜电位检测细胞色素C检测相关凋亡酶的检测Caspase-3的检测细胞核DNA的检测凋亡峰检测TUNEL检测（末端转移酶标记技术）流式检测指标流式检测指标3.2.1 亚二倍体亚二倍体(Sub-G1)峰的检测峰的检测 凋亡细胞核小体崩解，凋亡细胞核小体崩解，DNA含量减少，加之由于含量减少，加之由于DNA的降的降解，与荧光染料的结合减少，因此解，与荧光染料的结合减少，因此DNA染料的着色能力下染料的着色能力下降，荧光强度降低，表现在降，荧光
58、强度降低，表现在G1峰前出现亚二倍体峰，即亚峰前出现亚二倍体峰，即亚G1峰峰(凋亡峰凋亡峰)。细胞凋亡峰细胞凋亡峰 Sub-G1四倍体峰四倍体峰二倍体峰二倍体峰PINumber3.2.2 Annexin V/PI双染法双染法正常细胞膜是不对称性的，胞浆面含有带负电的磷脂正常细胞膜是不对称性的，胞浆面含有带负电的磷脂(如磷脂酰丝氨酸如磷脂酰丝氨酸, PS)。早期凋亡时，细胞表面不对称性发生改变，。早期凋亡时，细胞表面不对称性发生改变，PS外翻到胞外侧。外翻到胞外侧。Annexin V是一种是一种Ca2+依赖性的对依赖性的对PS有高度亲和力的磷脂结合蛋白，可有高度亲和力的磷脂结合蛋白，可作为探针识
59、别膜表面是否有作为探针识别膜表面是否有PS，从而识别凋亡细胞。，从而识别凋亡细胞。PS外翻外翻PI常用于鉴别死细胞。凋亡细胞的细胞膜仍然是完整的，所以常用于鉴别死细胞。凋亡细胞的细胞膜仍然是完整的，所以PI不能不能进入早期凋亡细胞核内。进入早期凋亡细胞核内。Annexin V-FITCPI活细胞活细胞早期凋亡早期凋亡晚期凋亡晚期凋亡坏死细胞坏死细胞裸核裸核免疫荧光图免疫荧光图C1h2h3h4h5h细胞膜透性核酸染料， 激发波长：488nm/633nm应用：与PI染料共同标记可用于细胞凋亡检测原理：荧光强度 活细胞凋亡细胞死细胞活细胞： SYTOhighPI-早期凋亡细胞： SYTOdimPI-
60、晚期凋亡（或坏死细胞） SYTOlowPI+PISYTO3.2.3 细胞膜变化检测细胞膜变化检测 - SYTO/PI 双染法双染法3.2.4 线粒体膜电位检测法线粒体膜电位检测法凋亡细胞线粒体膜电位会发生改变，利用荧光探针罗丹明凋亡细胞线粒体膜电位会发生改变，利用荧光探针罗丹明123(Rh123)、DiOC6和和JC-1等标记后，经过流式能检测出线粒体电位的变化，从而反等标记后，经过流式能检测出线粒体电位的变化，从而反映了细胞的凋亡情况。映了细胞的凋亡情况。JC-1在正常细胞中在胞浆以聚合体形式存在，在在正常细胞中在胞浆以聚合体形式存在，在 Fl-1 和和 Fl-2 有荧光；有荧光；细胞凋亡时
61、线粒体膜电位发生去极化，细胞凋亡时线粒体膜电位发生去极化，JC-1 进入线粒体以单体形式存进入线粒体以单体形式存在，仅在在，仅在 Fl-1通道有荧光通道有荧光 。JC-1 (Fl-1)Jurkat T CellsControl CamptothecinJC-1 (Fl-2)数据分析：数据分析：图片来源：中国流式协会网站论坛线粒体膜电位检测线粒体膜电位检测3.2.5 DNA断裂片段的检测断裂片段的检测(TUNNEL法法)凋亡中晚期会发生核酸内切酶的激活，双链的凋亡中晚期会发生核酸内切酶的激活，双链的DNA出现不出现不对称的断裂点，即产生一系列对称的断裂点，即产生一系列3-OH端。加入外源性的端。
62、加入外源性的脱脱氧核苷酸末端转移酶氧核苷酸末端转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT)能够催化外源性荧光素标记的能够催化外源性荧光素标记的dUTP连接到连接到DNA的的3-OH端，通过流式检测就能知道端，通过流式检测就能知道DNA断裂片段的多断裂片段的多少，这种方法叫做少，这种方法叫做TdT介导的介导的dUTP缺口末端标记法缺口末端标记法(TdT mediated-dUTP nick end labeling, TUNEL)。近来研究证实，近来研究证实，Br-dUTP(BrdU)更容易掺入到凋亡细胞的更容易掺入到凋亡细胞的DNA中，所以现在
63、流式中都先用中，所以现在流式中都先用BrdU进行掺入反应，然后进行掺入反应，然后使用荧光素标记的使用荧光素标记的BrdU抗体进行细胞染色，流式检测后得抗体进行细胞染色，流式检测后得到凋亡结果。到凋亡结果。TUNEL法检测凋亡原理法检测凋亡原理Fas-induced Apoptosis in Jurkat T CellsAnnexin V-FITCAnnexin V/PI双染法双染法PITUNEL法法BrdU-FITC3.3 检测细胞增殖检测细胞增殖细胞增殖细胞增殖(proliferation)是细胞生命活动的重要特征之一。是细胞生命活动的重要特征之一。检测细胞增殖的方法主要有：检测细胞增殖的方
64、法主要有：MTT检测法检测法胸腺嘧啶核苷（胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）掺入法掺入法流式细胞术流式细胞术细胞周期法细胞周期法相对计数法相对计数法/绝对计数法绝对计数法示踪染料标记法示踪染料标记法BrdU标记法标记法增殖蛋白检测增殖蛋白检测3.3.1 示踪染料标记法示踪染料标记法示踪染料能与细胞发生非特异性的稳定结合，主要有两种示踪染料能与细胞发生非特异性的稳定结合，主要有两种结合方式：结合方式：一种进入胞内与蛋白质共价结合，如一种进入胞内与蛋白质共价结合，如CFSE和和BRSE；另一种嵌入细胞膜的脂质双分子层，与细胞非共价结合，如另一种嵌入细胞膜的脂质双分子层，与细胞非共价结合，如PKH类类和和
65、CellVue类等。类等。CFSE标记细胞后对细胞没有很标记细胞后对细胞没有很强毒性，被激发后能发出很强毒性，被激发后能发出很强的荧光，并且非常稳定，强的荧光，并且非常稳定，只有当细胞分裂时，母细胞只有当细胞分裂时，母细胞内的染料会被平均分配到子内的染料会被平均分配到子细胞中，细胞的荧光信号减细胞中，细胞的荧光信号减少一半。少一半。PMA刺激小鼠的脾细胞增殖图刺激小鼠的脾细胞增殖图Figure 1: Example staining data from DC-T cell assay, (1) CFSE-labeled T cells incubated with DCs that were
66、not co-cultured with antigen, (2) CFSE-labeled T cells incubated with DCs that had been previously co-cultured with whole protein antigen (Drug 1), (3) CFSE-labeled T cells incubated with DCs that had been previously co-cultured with control antigen (Tuberculin PPD).DC-T cell co-culture assay 3.3.2
67、BrdU标记法标记法5-溴脱氧尿嘧啶核苷溴脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine, BrdU)是胸腺嘧啶是胸腺嘧啶核苷的类似物，在细胞增殖核苷的类似物，在细胞增殖DNA合成时可以与内源性的胸合成时可以与内源性的胸腺嘧啶核苷竞争掺入到新合成的腺嘧啶核苷竞争掺入到新合成的DNA中，而中，而BrdU抗体可以抗体可以特异性的识别特异性的识别BrdU，所以可以检测细胞增殖。，所以可以检测细胞增殖。BrBrBrBranti-BrdUBrBrAcid or DNase打开双链打开双链BrdU标记时同时加入标记时同时加入DNA染料染料(PI, 7-AAD)，结果为一个典，结果为一个典型的型的“马蹄
68、形马蹄形”峰，不仅能得到峰，不仅能得到G0/G1期、期、S期和期和G2/M期的期的比例，还能比较不同细胞比例，还能比较不同细胞DNA合成能力的不同。合成能力的不同。sub-G1 5.6%G0/G1 38.6%G2/M 14.4%S期期 38.6%BrdU标记法检测细胞增殖的另一优势是：发挥流式多参数标记法检测细胞增殖的另一优势是：发挥流式多参数的特性，能和其他指标同时检测，既可以是表面抗原，也的特性，能和其他指标同时检测，既可以是表面抗原，也可以是胞内蛋白。可以是胞内蛋白。取致敏取致敏BALB/c小鼠脾脏细胞，体外刺激小鼠脾脏细胞，体外刺激(PMA和离子霉素和离子霉素)后掺染后掺染BrdU 4
69、5 min，标记，标记anti-BrdU、7-AAD、CD8以及以及IL-10进行多参数分析进行多参数分析27%24%34%38%3.4 免疫细胞亚型检测免疫细胞亚型检测CD分子是细胞分子是细胞(包括白细胞、红细胞、血小板、内皮细胞包括白细胞、红细胞、血小板、内皮细胞等等)在分化为不同谱系在分化为不同谱系(lineage)、不同阶段以及活化过程中、不同阶段以及活化过程中或疾病状态下出现或消失的细胞表面标记。或疾病状态下出现或消失的细胞表面标记。分化群分化群(cluster of differentiation, CD) ：一类分化抗原的总：一类分化抗原的总称，进行流水编号，至称，进行流水编号，
70、至2009年已至少有年已至少有350种种CD分子。分子。大多数白细胞分化抗原在生物进化中具有保守性，但是有大多数白细胞分化抗原在生物进化中具有保守性，但是有些小鼠白细胞分化抗原和人类还是有所不同：些小鼠白细胞分化抗原和人类还是有所不同：某些人某些人CD分子尚未在小鼠中确定；分子尚未在小鼠中确定；某些人和小鼠某些人和小鼠CD 分子编号相同，但功能有所差别。分子编号相同，但功能有所差别。细胞群体细胞群体人人小鼠小鼠免疫细胞免疫细胞CD45+CD45+T淋巴细胞淋巴细胞CD3+CD3+B淋巴细胞淋巴细胞CD19+、CD20+B220(CD45R) +NK细胞细胞CD56+CD335(NKp46) +
71、单核细胞单核细胞CD14+Mac-1+红细胞红细胞CD235a+Ter119+造血干细胞造血干细胞Lin-CD34+CD38-Lin-Sca-1+CD117+免疫细胞特征表型免疫细胞特征表型Lin为谱系标记为谱系标记Lineage marker，是造血细胞来源的各种血，是造血细胞来源的各种血细胞和免疫细胞特异性标记的总称。细胞和免疫细胞特异性标记的总称。Lin虽然包括很多种抗体，干细胞鉴定时，可能把它们标上虽然包括很多种抗体，干细胞鉴定时，可能把它们标上同一种荧光素，只需分配一个流式通道。各流式抗体公司同一种荧光素，只需分配一个流式通道。各流式抗体公司一般都有用于流式的一般都有用于流式的lin
72、eage cocktail。GranulocytesGranulocytesMonocytesMonocytesEosinophilsEosinophilsBasophilsBasophilsNeutrophilsNeutrophilsLymphocytesLymphocytesT TB BNKNKPeripheral White Blood CellsPeripheral White Blood CellsCD45CD45+ +T T HelperHelperCD3CD3+ +CD4CD4+ +T TCytotoxicCytotoxicCD3CD3+ +CD8CD8+ +CD3CD3+ +C
73、D3CD3- -CD19CD19+ +CD3CD3- -CD16CD16+ +CD56CD56+ +MonocytesMonocytesCD14CD14+ +Type of cellsCytotoxicTh1Th2Th17TregTfhMain functionKill virus-infected cellsActivate Mac and help B cellsHelp B cells and switch antibody Enhance neutrophil responseImmune regulationB cell development antibodyDiseaseinfe
74、ctionIntracellular pathogenparasitesFungi and extracellular bacteriaAutoimmune and cancerautoimmuneSurface MarkersCD8CD4 CXCR3CD4,CCR4, CRTH2CD4,CCR6CD4,CD25CD4,CXCR5Effector cytokinesIFNg, TNFIFNg, TNFIL-4, 5, 13Il-17A,FTGFb, IL-10IL-21Transcription factorsT-betGATA3RORrtFoxP3Bcl-6T cell subsets an
75、d markersMarkerFluorochromePurposeViability dyeV500ViabilityCD3PerCP-Cy5.5T cell markerCD4BUV 395T cell subsetCD8FITCT cell subsetCD127Alex647Treg markerHLA-DRAPC-H7ActivationCD45ROPE-Cy7MemoryCD197 (CCR7)BV421NaveCD38BV605ActivationCD27BV786MemoryCD25PE-CF594Treg markerCD196(CCR6)PETh17 markerCXCR3
76、Alex700Th1 markerSurface Markers for T cell subsets3.4.1 淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析根据功能，淋巴细胞主要分为：根据功能，淋巴细胞主要分为：T淋巴细胞淋巴细胞(CD3+)，与细胞免疫有关；，与细胞免疫有关；辅助性辅助性T细胞细胞 (CD3+CD4+)：helper T cells，Th细胞；细胞；细胞毒性细胞毒性T细胞细胞(CD3+CD8+)：Cytotoxic T cells，Tc细胞。细胞。B淋巴细胞淋巴细胞(CD19+)，与体液免疫有关；，与体液免疫有关；NK细胞细胞(CD3-CD16+CD56+)，行使免疫监控功能，能够介，
77、行使免疫监控功能，能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性作用。导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性作用。总总T、总、总B和和NK细胞的比例以及细胞的比例以及Th/Tc可以用来判断某些免可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病。疫缺陷和自身免疫性疾病。FSCSSCCD3 PerCPSSCCD4 FITCCD8 PE42.04%48.3%1.8%13.9%35.9%T淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析CD3 PerCPCD4 FITCCD8 PE42.82%37.41%49.68%T细胞、细胞、B细胞和细胞和NK细胞比例检测细胞比例检测亚群亚群百分比百分比()绝对计数绝对计数(个个/ul
78、)总T细胞(CD3+)50-84955-2860总B细胞(CD3-CD19+)5-1890-560NK细胞(CD3+/CD16+CD56+)7-40150-1100健康成年人外周血淋巴细胞参考范围健康成年人外周血淋巴细胞参考范围人外周血淋巴细胞分析人外周血淋巴细胞分析3.4.2 树突状细胞树突状细胞树突状细胞树突状细胞(dendritic cell, DC)是机体功能最强的专职抗是机体功能最强的专职抗原递呈细胞，它能高效摄取、加工处理和递呈抗原。原递呈细胞，它能高效摄取、加工处理和递呈抗原。根据根据DC来源可将来源可将DC分为髓样分为髓样DC(myeloid DC, mDC)和浆细胞和浆细胞样
79、样DC(plasmacytoid DC, pDC)。mDC主要由主要由CD34+细胞和单细胞和单核细胞分化而来，特征性标志为核细胞分化而来，特征性标志为CD11c。pDC与淋巴细胞与淋巴细胞来源于同一前体细胞，特征性标志为来源于同一前体细胞，特征性标志为CD123。一般认为：。一般认为：mDC表型为：表型为：Lin-/lowHLA-DR+CD11c+CD123-；pDC表型为：表型为： Lin-/lowHLA-DR+CD11c-CD123+。（Lin包括包括CD3、CD14、CD16/56和和CD19/20）FSC-HeightSSC-HeightLin-FITCHLA-DR PerCPCD1
80、23 PECD11c APCR1R2R3 0.16% R4Identification of pDC in PBMCJ Immunol. 2004; 173: 1535-1548mDCmDCpDCpDCGM-CSF和和IL-4分选分选诱导分化诱导分化LPS或或TNF- 促成熟促成熟CD14+ MonocyteImmature dendritic cellmature dendritic cellMonocyte-Derived Dendritic Cell3.4.3 调节性调节性T细胞细胞调节性调节性T细胞细胞(regulatory T cell, Treg)是在机体免疫系统中发是在机体免疫系
81、统中发挥负向调节作用，属于一种免疫耐受的细胞，已成为目前挥负向调节作用，属于一种免疫耐受的细胞，已成为目前免疫学领域研究的热门课题。免疫学领域研究的热门课题。目前为止已经发现了多种表型的目前为止已经发现了多种表型的Treg存在，一般认为存在，一般认为Treg是指表达特征为是指表达特征为CD4+CD25+Foxp3+的一群的一群T淋巴细胞。淋巴细胞。Foxp3是是Treg细胞的特异性标志，它是一种转录因子，调控细胞的特异性标志，它是一种转录因子，调控着着Treg分化发育及功能维持。胞内染色法才能检测，不能分化发育及功能维持。胞内染色法才能检测，不能用于分选。用于分选。FSCSSCCD4 FITC
82、SSCCD25 APCIgG1 PECD25 APCFoxp3 PETreg细胞设门方法细胞设门方法FSCCD3 FITCCD25 PESSCCD4 PerCP-Cy5.5CD127 APC以前根据以前根据CD4+CD25high来分选来分选Treg。最近发现，。最近发现，CD127(IL-7受体受体)在在Treg中低表达，因此中低表达，因此CD127可以作为可以作为Treg比较理想比较理想的表面标记分子，以的表面标记分子，以CD4+CD25int/highCD127low作为作为Treg的标的标志。志。CD4、CD25、CD127三标法分选三标法分选Treg细胞细胞3.4.4 CD34+绝对
83、计数与造血干细胞移植绝对计数与造血干细胞移植外周血干细胞移植时，采集物中造血干外周血干细胞移植时，采集物中造血干细胞的数量对移植的成功有着直接的影细胞的数量对移植的成功有着直接的影响，因此有必要准确测定造血干细胞的响，因此有必要准确测定造血干细胞的绝对数量。绝对数量。CD34是目前应用最多的干细胞表面标记，是目前应用最多的干细胞表面标记，采用流式细胞术快速定量采用流式细胞术快速定量CD34+细胞，细胞，被临床上广泛采用。被临床上广泛采用。其基本原理都是加入一定量的微球作为其基本原理都是加入一定量的微球作为内参，通过已知浓度的微球测定内参，通过已知浓度的微球测定CD34+细胞的绝对值。细胞的绝对
84、值。绝对计数管绝对计数管CD34+细胞绝对计数计算公式：细胞绝对计数计算公式：CD34+细胞绝对值细胞绝对值(获取获取CD34+细胞数细胞数/获取微球数获取微球数) (每管微球数每管微球数/标本体积标本体积)3.5 检测细胞因子检测细胞因子细胞因子细胞因子(cytokine)是一类能在细胞间传递信息、具有免疫是一类能在细胞间传递信息、具有免疫调节和效应等功能的蛋白质或小分子多肽。根据功能可以调节和效应等功能的蛋白质或小分子多肽。根据功能可以分为分为6大类：白细胞介素、干扰素、集落刺激因子、肿瘤大类：白细胞介素、干扰素、集落刺激因子、肿瘤坏死因子、生长因子和趋化因子坏死因子、生长因子和趋化因子
85、。细胞因子的检测方法：细胞因子的检测方法：ELISA流式细胞术流式细胞术胞内细胞因子：胞内染色法胞内细胞因子：胞内染色法(intracellular staining assay)；胞间细胞因子：胞间细胞因子：CBA法法(cytometric bead assay, 流式微球阵列流式微球阵列)3.5.1 胞内因子检测胞内因子检测目的：检测胞内因子，结合膜表面抗原，可以对免疫细胞目的：检测胞内因子，结合膜表面抗原，可以对免疫细胞进行分类，进行分类，Th1、Th2和和Th17。Th细胞根据分泌细胞因子能力的不同，分为细胞根据分泌细胞因子能力的不同，分为Th1细胞和细胞和Th2细胞。细胞。细胞免疫细
86、胞免疫体液免疫体液免疫目前并没有找到公认的细胞表面鉴别标志，所以仍以分泌目前并没有找到公认的细胞表面鉴别标志，所以仍以分泌的细胞因子来区分的细胞因子来区分Th1和和Th2细胞：细胞：Th1：CD4+IFN- +Th2：CD4+IL-4+Tc1：CD8+IFN- +Tc2：CD8+IL-4+Th17是最近发现的一种效应性是最近发现的一种效应性CD4 + T细胞，以分泌细胞，以分泌IL-17为为特征。特征。Th17：CD4+IL-17+活化活化：自然状态下，静止的淋巴细胞不分泌或者分泌极少：自然状态下，静止的淋巴细胞不分泌或者分泌极少量细胞因子，刺激激活后，细胞内的细胞因子合成增加。量细胞因子，刺
87、激激活后，细胞内的细胞因子合成增加。常用的刺激剂有佛波酯常用的刺激剂有佛波酯PMA、离子霉素、离子霉素(Inomycin)、ConA、PHA、LPS等。等。抑制分泌抑制分泌：细胞因子合成后很快就主动分泌到细胞外，位：细胞因子合成后很快就主动分泌到细胞外，位于细胞内的细胞因子的量很少，一般无法达到流式分析检于细胞内的细胞因子的量很少，一般无法达到流式分析检测的最低标准，因此必须阻止细胞因子分泌到细胞外。蛋测的最低标准，因此必须阻止细胞因子分泌到细胞外。蛋白质分泌抑制剂如莫能霉素白质分泌抑制剂如莫能霉素(monensin)、BFA(brefeldin A)能抑制细胞因子分泌，使其累积在细胞内。能抑
88、制细胞因子分泌，使其累积在细胞内。检测原理检测原理取抗凝血和培养基取抗凝血和培养基1:1等体积稀释，加入刺激剂等体积稀释，加入刺激剂PMA、离子、离子霉素和阻断剂莫能霉素，霉素和阻断剂莫能霉素，37 、5%培养箱培养箱4-6h；取取200ul，溶血后用，溶血后用PBS洗一遍；洗一遍；细胞表面染色：细胞表面染色： 加加PerCP-CD3和和APC- CD8室温孵育室温孵育20 min (PMA刺激后刺激后CD4分子会被内吞减少分子会被内吞减少)；固定、破膜后加固定、破膜后加PBS洗一遍；洗一遍；细胞内染色：加入荧光抗体细胞内染色：加入荧光抗体FITC-IFN- 和和PE-IL-4，混匀后避，混匀
89、后避光孵育光孵育30min；加加2ml洗液，离心弃上清，加洗液，离心弃上清，加200ul PBS重悬细胞上机检测。重悬细胞上机检测。检测步骤检测步骤(以检测全血以检测全血Th1/Th2为例为例)吸毒人外周血吸毒人外周血Th1/Th2和和Tc1/Tc2比例检测比例检测Th2Tc2Tc1Th13.5.2 CBA法法CBA(cytometric bead array, 流式微球阵列流式微球阵列)是新发展起来的是新发展起来的能定量检测胞外游离可溶性成分能定量检测胞外游离可溶性成分(如细胞因子等如细胞因子等)的新方法。的新方法。CBA应用领域包括血清、血浆、泪液等体液标本以及细胞应用领域包括血清、血浆、
90、泪液等体液标本以及细胞培养上清液中多种可溶性成分的检测。培养上清液中多种可溶性成分的检测。技术优点：技术优点：能同时检测多种目的蛋白；能同时检测多种目的蛋白；样本需求量小；样本需求量小；更高的灵敏度和更好的重复性；更高的灵敏度和更好的重复性；操作简单省时省力。操作简单省时省力。+BeadCapture AbCapture BeadcytokineDetection AbCBA技术原理技术原理微微球球上上包包被被细细胞胞因因子子抗抗体体后后形形成成捕捕获获微微球球(capture bead)，捕捕获获微微球球上上的的捕捕获获抗抗体体(capture antibody)能能与与样样本本中中相相应应
91、的的细细胞胞因因子子特特异异性性结结合合。这这样样捕捕获获了了细细胞胞因因子子的的微微球球就就类类似似于于一一个个细细胞胞，加加入入相相应应的的荧荧光光素素检检测测抗抗体体形形成成“三三明明治治”式式夹夹心心复复合合物物，上上流流式式后后就就能能得得到到细细胞胞因因子子的含量。的含量。CBA微球是包被有荧光染料的，一系列荧光强度不同的微微球是包被有荧光染料的，一系列荧光强度不同的微球就能同时检测多种细胞因子。球就能同时检测多种细胞因子。PE-Cy5PEIL-2IL-4IL-8PEPE-Cy5IL-2IL-4IL-8 CBA kit中含有中含有已知浓度的已知浓度的标标准品准品，测定前，测定前将标
92、准品稀释将标准品稀释成不同浓度，成不同浓度，制作制作标准曲线标准曲线。0 pg/mL80 pg/mL1250 pg/mL5000 pg/mLFL3 Beads IL-2IL-4IL-6IL-10TNFIFN-rIFN-rTNF-aIL-10IL-6IL-4IL-2CBA human Th1/Th2 cytokine kit 标准曲线标准曲线PEPE-Cy53.6 检测细胞吞噬功能检测细胞吞噬功能巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞等都具有很强的吞噬巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞等都具有很强的吞噬功能，检测吞噬功能是免疫学研究的重要内容。功能，检测吞噬功能是免疫学研究的重要内容。把细菌或者吞噬颗粒
93、标上荧光后，与目标细胞在把细菌或者吞噬颗粒标上荧光后，与目标细胞在37作用作用一段时间，流式细胞仪检测荧光信号的强弱就可以区分目一段时间，流式细胞仪检测荧光信号的强弱就可以区分目标细胞是否具有吞噬功能以及吞噬功能的强弱。标细胞是否具有吞噬功能以及吞噬功能的强弱。Blood. 2008; 112: 3175-3185实验组：实验组：LRDC和和cDC与与FITC偶联的偶联的BSA在在37作用作用4h；对照组：对照组：LRDC和和cDC与与FITC偶联的偶联的BSA在在4作用作用4h；LRDC的吞噬功的吞噬功能要强于能要强于cDC。BSA-FITCCounts 3.7.1 免疫细胞亚群分选免疫细胞
94、亚群分选3.7.2 GFP阳性稳转株分选阳性稳转株分选3.7.3 干细胞分选干细胞分选 （一）造血干细胞分选（一）造血干细胞分选 （二）肿瘤干细胞分选（二）肿瘤干细胞分选 （三）（三） 侧群细胞分选侧群细胞分选3.7 流式分选流式分选3.7.1 免疫细胞亚群分选免疫细胞亚群分选3.7.2 GFP阳性稳转株分选阳性稳转株分选GFP(green fluorescent protein, 绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白)是一种含有内是一种含有内在荧光素的蛋白质，被在荧光素的蛋白质，被488nm激光激发后能够产生稳定的激光激发后能够产生稳定的绿色荧光，是常用的报告基因。绿色荧光，是常用的报告基因。将编码将编
95、码GFP的基因整合到目标基因的启动子后面，把构建的基因整合到目标基因的启动子后面，把构建好的质粒转染到细胞内，当目的基因表达时也会同时表达好的质粒转染到细胞内，当目的基因表达时也会同时表达GFP，通过流式检测，通过流式检测GFP的含量就能间接的反应目的基因的的含量就能间接的反应目的基因的转染效率以及表达强弱。转染效率以及表达强弱。当转染效率不是很高的时候，可以借助流式分选的方法把当转染效率不是很高的时候，可以借助流式分选的方法把GFP阳性的稳转株筛选出来。阳性的稳转株筛选出来。分分选选前前分分选选后后Visible MicroscopyFluorescence MicroscopyFlow C
96、ytometry5%98%FCM分选分选GFP阳性的细胞阳性的细胞SampleSorted 2Sorted 1FCM分选不同荧光强度的细胞分选不同荧光强度的细胞3.7.3 干细胞研究分选干细胞研究分选干细胞干细胞(stem cell)是一类具有自我更新能力的多潜能细胞，是一类具有自我更新能力的多潜能细胞，在一定条件下，可以分化成多种功能细胞。在一定条件下，可以分化成多种功能细胞。干细胞主要分为胚胎干细胞干细胞主要分为胚胎干细胞(embryonic stem cell, ESC)和成和成体干细胞体干细胞(somatic stem cell)成体干细胞是能够分化成特定组织和器官的细胞，如造血成体干
97、细胞是能够分化成特定组织和器官的细胞，如造血干细胞干细胞(骨髓、脐带血干细胞骨髓、脐带血干细胞)、间充质干细胞、神经干细、间充质干细胞、神经干细胞、上皮干细胞等。本节主要介绍：胞、上皮干细胞等。本节主要介绍：造血干细胞造血干细胞间充质干细胞间充质干细胞肿瘤干细胞肿瘤干细胞侧群细胞侧群细胞（一）（一） 造血干细胞造血干细胞 造血干细胞造血干细胞(hematopoietic stem cell, HSC)是具有自我更新是具有自我更新能力的并且能够分化成所有血细胞和免疫细胞的细胞。能力的并且能够分化成所有血细胞和免疫细胞的细胞。目前尚无任何方法可辨认出真正的目前尚无任何方法可辨认出真正的HSC，借助
98、细胞的免疫，借助细胞的免疫标志可以将人和动物的标志可以将人和动物的HSC缩小到一个较小范围内，甚至缩小到一个较小范围内，甚至通过分选富集纯化通过分选富集纯化HSC用于各种基础研究和临床应用。用于各种基础研究和临床应用。目前认为人的造血干细胞标志为目前认为人的造血干细胞标志为Lin-CD34+CD38-。Lin包括包括CD3、CD19、CD20、CD16、CD56、CD14、CD11b和和CD15。小鼠造血干细胞表型为小鼠造血干细胞表型为Lin-Sca-1+c-kit(CD117)+。Lin包括包括CD3(T细胞细胞)、B220(B细胞细胞)、CD11b(单核巨噬单核巨噬)、Gr-1(粒细胞粒细
99、胞)和和Ter119(红细胞红细胞)。从小鼠骨髓中分选出从小鼠骨髓中分选出Lin-Sca-1+c-kit(CD117)+，是研究造血干，是研究造血干细胞很好的模型。细胞很好的模型。（二）（二） 肿瘤干细胞分选肿瘤干细胞分选肿瘤干细胞肿瘤干细胞(cancer stem cell)假说：肿瘤组织是由异质性的假说：肿瘤组织是由异质性的细胞群体组成，肿瘤组织中存在的一小部分具有干细胞性细胞群体组成，肿瘤组织中存在的一小部分具有干细胞性质的肿瘤干细胞具有无限的自我更新能力，可以产生与上质的肿瘤干细胞具有无限的自我更新能力，可以产生与上一代完全相同的子代细胞，并且具有多种分化潜能和高度一代完全相同的子代细
100、胞，并且具有多种分化潜能和高度增殖能力，产生不同表型的肿瘤细胞，并使肿瘤在体内不增殖能力，产生不同表型的肿瘤细胞，并使肿瘤在体内不断扩大，或形成新的肿瘤。断扩大，或形成新的肿瘤。流式鉴定分选肿瘤干细胞方法：流式鉴定分选肿瘤干细胞方法：侧群干细胞；侧群干细胞；根据表型标记鉴定。根据表型标记鉴定。肿瘤类型肿瘤类型肿瘤干细胞的细胞表面标记肿瘤干细胞的细胞表面标记白血病白血病CD44+/CD38-乳腺癌乳腺癌CD44+/CD24-/low/Lineage-脑神经胶质瘤脑神经胶质瘤CD133+/musashi-1+/nestin+肉瘤肉瘤Stro-1+/CD105+/CD44+头颈癌头颈癌CD44+/B
101、MI-1+肺癌肺癌Sca-1+/CD45-/PECAM-/CD34+肝癌肝癌CD133+黑素瘤黑素瘤CD20+胰腺癌胰腺癌CD44+/CD24+/ESA+前列腺癌前列腺癌CD44+/ 21high/CD133+结肠癌结肠癌EpCAMhigh/CD44+/CD166+,CD133+各种肿瘤干细胞表面标记各种肿瘤干细胞表面标记肿瘤干细胞研究进展，饶冠华FACS Cell SorterSolid TumorSingle CellSuspensionCD24CD44Mince (small pieces)Surgical ImplantationSublethally irradiated NOD/S
102、CID MiceBreast Cancer Stem Cells: CD44+ CD24low Lin-（三）（三） 侧群细胞分选侧群细胞分选Hoechst 33342是一种是一种DNA荧光染料，在紫外激发下可发出荧光染料，在紫外激发下可发出蓝光蓝光(波长波长450 nm 左右左右)和红色和红色(波长波长650 nm 左右左右)两种荧光。两种荧光。1996年，年，Goodell等用等用Hoechst 33342染色小鼠骨髓细胞后，染色小鼠骨髓细胞后，经过流式检测后发现在经过流式检测后发现在Hoechst-Blue/Hoechst -Red散点图散点图中，有一小群染色较低的细胞，只占骨髓细胞的中
103、，有一小群染色较低的细胞，只占骨髓细胞的0.1%左右，左右，称之为侧群细胞称之为侧群细胞(side population, SP细胞细胞)。0.1%Lin-Sca-1+SP细胞广泛分布于胚胎、成体组织以及肿瘤细胞系中，具细胞广泛分布于胚胎、成体组织以及肿瘤细胞系中，具有自我更新和多向分化潜能，因此代表了一种新的干细胞有自我更新和多向分化潜能，因此代表了一种新的干细胞类型，类型，SP特征可能作为干细胞功能性标记。特征可能作为干细胞功能性标记。目前，从白血病、乳腺癌、大肠癌等肿瘤细胞中都检测出目前，从白血病、乳腺癌、大肠癌等肿瘤细胞中都检测出SP细胞，分选出这些肿瘤细胞的细胞，分选出这些肿瘤细胞的
104、SP细胞都具有成瘤以及耐细胞都具有成瘤以及耐药的特性，这些都提示这药的特性，这些都提示这SP细胞可能就代表着肿瘤干细胞。细胞可能就代表着肿瘤干细胞。主流观点：不是所有的肿瘤细胞都会出现主流观点：不是所有的肿瘤细胞都会出现SP特征；特征；SP细胞细胞也不一定就是干细胞。也不一定就是干细胞。SP细胞、干细胞和肿瘤干细胞细胞、干细胞和肿瘤干细胞SP产生的分子机制产生的分子机制干细胞表面高表达干细胞表面高表达ABC(ATP bind cassette)运输蛋白运输蛋白Bcrp1/ ABCG2，能将，能将Hoechst 333452泵出细胞外，所以泵出细胞外，所以SP细胞染细胞染色较低，而其他细胞没有这种能力。色较低，而其他细胞没有这种能力。转运蛋白的抑制剂维拉帕米，能够阻断转运蛋白的抑制剂维拉帕米，能够阻断SP细胞将细胞内的细胞将细胞内的Hoechst 33342泵出细胞外，可以作为泵出细胞外，可以作为SP检测的对照组。检测的对照组。Hoechst RedHoechst Blue实验组实验组加加Verapamil对照组对照组SP细胞细胞
