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1、LOGOiTRAQ技术对卵巢癌早期筛查技术对卵巢癌早期筛查/ /诊断的蛋诊断的蛋白质磷酸化修饰的研究白质磷酸化修饰的研究 卵巢癌的研究现状目前最普遍使用的卵巢癌生物标记物是肿瘤抗原CA125,尽管80%的晚期卵巢癌病人CA125浓度不正常,但是50% 60%的期卵巢癌病人CA125 浓度增高。CA125 作为标记物的阳性预测值不到10%。因此,需要寻找特异性更强和灵敏度更高的肿瘤分子标记物。 蛋白质组学的新进展 尽管人类基因组包含了机体的所有遗传信息, 但其只是指导蛋白质合成，而构成细胞并发挥各种功能作用则是由蛋白质来完成，蛋白质还是机体多种不同类型细胞之间差异的决定因素。同样, 肿瘤细胞和正
2、常细胞的差异在很大程度上也是由功能基因及其指导合成的蛋白质组的不同来决定的。因此，有必要从蛋白质组水平来揭示肿瘤的发生机制。蛋白质组学可全面、动态、定量地分析比较正常与癌变标本中蛋白质种类和数量的改变,不仅有助于肿瘤发病机制的阐明,还能筛选和鉴定蛋白质特异性标记和特异性抗原,在肿瘤的早期诊断、治疗和新药研制方面,具有广阔的应用前景。研究背景研究背景 蛋白质的磷酸化修饰 蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一是生物界最普遍也是最重要的一种蛋白质翻译后修饰。磷酸化的失调会导致很多严重的人类疾病，如癌症。磷酸化蛋白质检测技术用于卵巢癌研究中，有利于寻找卵巢癌诊断和治疗的靶点。目前，磷酸化
3、蛋白质组学在定量研究方面多采用32P代谢标记、荧光染料染色的磷酸化蛋白质定量分析方法、同位素标记技术等。对于图谱创建中许多磷酸化调控蛋白呈低丰度状况, 蛋白质鉴定技术敏感性的提高将是克服这一障碍的关键。随着样本制备技术和仪器设备的迅速发展, 更好的富集策略和磷酸化定量两大难点将会不断得到克服, 蛋白磷酸化位点的鉴定和定位技术也更易开展 稳定同位素标记技术在定量准确度和规模化定量分析方面都有很大的应用前景。这种方法既可以研究全蛋白质组的变化,也可以结合磷酸化肽段的富集技术和串联质谱技术对磷酸化肽段进行定量研究。目前,可用于肽段定量研究的iTRAQ、iCAT等技术同样可用于磷酸化肽段的研究。研究背
4、景研究背景研究背景研究背景u我们为什么选择iTRAQ技术？u iTRAQ技术是一种新的、功能强大的可同时对多种样品进行绝对和相对定量研究的方法，可以标记生物样品中产生的所有肽段，增强任一给定蛋白的肽段覆盖度，同时保留了诸如一些蛋白的翻译后修饰的重要结构信息，可以实现在二级图谱上的定量，具体原理已有详细报道，但目前有关iTRAQ 在磷酸化蛋白质定量方面的研究报道还很少。u 这种方法是建立在iTRAQ试剂的基础上。iTRAQ实际上是一种同位素标记试剂包括一个带电荷的报告基团，另外还有一个肽段反应基团和一个平衡基团。主要观点和创新之处主要观点和创新之处目前，国内外对于卵巢癌的早期筛查目前，国内外对于
5、卵巢癌的早期筛查/诊断尚缺乏有效方诊断尚缺乏有效方法和特异性的肿瘤标志物。我们本次实验意在通过对卵巢癌法和特异性的肿瘤标志物。我们本次实验意在通过对卵巢癌蛋白质组学研究，或得出正常卵巢和癌变卵巢表达蛋白的差蛋白质组学研究，或得出正常卵巢和癌变卵巢表达蛋白的差异。异。基于基于iTRAQ+蛋白组学研究蛋白组学研究+蛋白磷酸化修饰的差异蛋白磷酸化修饰的差异基于基于iTRAQ标记结合质谱技术筛选卵巢癌血清标记物在标记结合质谱技术筛选卵巢癌血清标记物在国内虽有学者研究，但还没有突破性的成果。我们发现国内国内虽有学者研究，但还没有突破性的成果。我们发现国内外尚无学者研究卵巢癌表达蛋白磷酸化修饰的差异，我们
6、此外尚无学者研究卵巢癌表达蛋白磷酸化修饰的差异，我们此次通过研究卵巢癌表达蛋白磷酸化修饰的差异或得出正常卵次通过研究卵巢癌表达蛋白磷酸化修饰的差异或得出正常卵巢和癌变卵巢表达蛋白的磷酸化修饰是否存在差异。从而寻巢和癌变卵巢表达蛋白的磷酸化修饰是否存在差异。从而寻找用于卵巢癌早期诊断的血清肿瘤标志物提供了一定的临床找用于卵巢癌早期诊断的血清肿瘤标志物提供了一定的临床前期研究基础。之所以选择磷酸化修饰作为研究对象，是因前期研究基础。之所以选择磷酸化修饰作为研究对象，是因为蛋白质磷酸化是最常见，也是最重要的一种蛋白翻译后修为蛋白质磷酸化是最常见，也是最重要的一种蛋白翻译后修饰方式。蛋白质的磷酸化在真
7、核生物的信号转导中具有很重饰方式。蛋白质的磷酸化在真核生物的信号转导中具有很重要的作用。要的作用。基本思路和方法基本思路和方法关注新浪微博关注新浪微博 jdppt or 经典经典PPT基本思路和方法基本思路和方法u1、血清来源血清来源:选取医院经病理证实为卵巢恶性肿瘤患者晨选取医院经病理证实为卵巢恶性肿瘤患者晨空腹血清空腹血清20份，年龄份，年龄3370岁，设为卵巢癌组；岁，设为卵巢癌组；经体检无任何疾病的健康人群晨空腹血清经体检无任何疾病的健康人群晨空腹血清20份，份，设为正常对照组。所采集的血清标本保存于设为正常对照组。所采集的血清标本保存于-80冰箱；冰箱；基本思路和方法基本思路和方法u
8、2、血清差异蛋白筛选：血清差异蛋白筛选：u1）去除高丰度蛋白：每组样品先取）去除高丰度蛋白：每组样品先取10例冰上解冻。等体积混合得到混合例冰上解冻。等体积混合得到混合血清。从中取血清。从中取20L，用缓冲液，用缓冲液A各稀释各稀释4倍。加入倍。加入0.22m的离心过滤的离心过滤器器416000g离心离心1min，去除血清中碎片成分。取稀释血清，去除血清中碎片成分。取稀释血清80L，进行，进行LC分离，流速分离，流速0.125mL/min，在，在1116min收集低丰度蛋白收集低丰度蛋白的流出组分。采用的流出组分。采用Bradord试剂盒检测馏分蛋白浓度。其余样本试剂盒检测馏分蛋白浓度。其余样
9、本-80保保存待用。存待用。u2）蛋白定量标记：）蛋白定量标记：1.2mL的预冷丙酮加入的预冷丙酮加入300L低丰度蛋白血清，见低丰度蛋白血清，见沉淀物形成。沉淀物形成。415000g离心离心100min，弃上清，沉淀室温放置，弃上清，沉淀室温放置20min使丙酮挥发完全。然后加入使丙酮挥发完全。然后加入20L溶解缓冲液充分混匀，使样品充分溶解缓冲液充分混匀，使样品充分溶解。每组样品取溶解。每组样品取100g，加入，加入2倍体积的还原剂，充分混合，倍体积的还原剂，充分混合，60孵孵育育1h。管内加入半胱氨酸封闭剂涡旋混合后室温孵育。管内加入半胱氨酸封闭剂涡旋混合后室温孵育10min。按。按1
10、30（胰酶（胰酶 蛋白质）的比例向样品管内加入消化酶，涡旋混合，蛋白质）的比例向样品管内加入消化酶，涡旋混合，37孵育孵育16h。iTRAQ试剂室温冻融，每管试剂室温冻融，每管iTRAQ试剂加入试剂加入70L无水乙醇，无水乙醇，涡旋混合，使之溶解后转入样品管。然后按照卵巢癌组加入质量数涡旋混合，使之溶解后转入样品管。然后按照卵巢癌组加入质量数118Da和正常对照组和正常对照组119Da的标记分别加入样品管，漩涡混匀，室温孵的标记分别加入样品管，漩涡混匀，室温孵育育1h，真空冷冻干燥，去除标记中的胰蛋白酶和未标记的多肽；，真空冷冻干燥，去除标记中的胰蛋白酶和未标记的多肽；基本思路和方法基本思路和
11、方法u3、二氧化钛富集磷酸化肽段：二氧化钛富集磷酸化肽段：称取称取1mgTiO2放入放入50%ACN/0.1%FA(40L)中，制成匀浆液，装入中，制成匀浆液，装入GELoader枪头中，用惰枪头中，用惰性材料塞紧。装好的微柱依次用性材料塞紧。装好的微柱依次用40L的的01%FA，80%ACN/0.1%TFA，40L2的的300mmol/LLA/80%ACN/0.1%FA的溶液冲洗，将样品注入微的溶液冲洗，将样品注入微柱中，依次用柱中，依次用40L2的的300mmol/LLA/80%ACN/0.1%FA，40L80%ACN/0.1%TFA，40LH2O洗脱，最后用洗脱，最后用10L2的的5%N
12、H3H2O收集，并用甲酸调至收集，并用甲酸调至pH3；称取；称取1mgC18-AQ材料装材料装柱柱(同上同上),将装好的微柱依次用将装好的微柱依次用40LACN，40L2的的50%ACN/0.1%FA溶液冲洗，再用溶液冲洗，再用40L2的的0.1%FA溶液平衡微柱，将上述富集到的收集液上样，溶液平衡微柱，将上述富集到的收集液上样，再用再用40L2的的0.1%FA溶液脱盐，最后用溶液脱盐，最后用20L2的的50%ACN/0.1%FA溶液洗脱收集并旋干，再用溶液洗脱收集并旋干，再用10L的的50%ACN/0.1%FA溶解；溶解；基本思路和方法基本思路和方法u4、质谱分析：质谱分析：采用串联质谱技术
13、采用串联质谱技术LC-MS/MS质谱分析，浓缩的质谱分析，浓缩的iTRAQ标记样本加入标记样本加入2mL稀释液，调溶液稀释液，调溶液pH值低于值低于3。采。采用用HPLC柱进行阳离子交换色谱分析。由强阳离子交换柱分柱进行阳离子交换色谱分析。由强阳离子交换柱分离活的组份经真空干燥，多肽采用离活的组份经真空干燥，多肽采用20L溶剂溶剂A重悬，重悬，NanoLC分离并在线连接电喷雾串联质谱分析。采用分离并在线连接电喷雾串联质谱分析。采用NanoAquityUPLC系统系统Nano在线连接电喷雾离子源的在线连接电喷雾离子源的LTQOrbi trapXL质谱仪。所有质谱仪。所有MS/MS谱图采用谱图采用
14、Thermo公司的公司的SEQUEST软件进行，使用数据库为人软件进行，使用数据库为人Swiss-Prot数据库（数据库（Release2010-04）。多肽分子量误差范围为）。多肽分子量误差范围为15ppm，碎片离子误差为，碎片离子误差为0.1Da；u5、数据统计：数据统计：定量分析蛋白磷酸化位点变化差异。定量分析蛋白磷酸化位点变化差异。总结总结预计达到以下目标：预计达到以下目标：研究出卵巢癌血清定量疾病蛋白质磷酸化修饰的差异研究出卵巢癌血清定量疾病蛋白质磷酸化修饰的差异为卵巢癌早期诊断和筛查提供更有效的临床价值。为卵巢癌早期诊断和筛查提供更有效的临床价值。参考文献参考文献【1】彭小宁】彭小
15、宁,彭司华彭司华,曾小敏曾小敏,卵巢癌早期诊断方法的研究进展卵巢癌早期诊断方法的研究进展J.国际病理科学与临床杂志国际病理科学与临床杂志,2007,27(6):490-492【2】李国庆，肖哲峰，刘建平，等，肿瘤：一种蛋白质组病】李国庆，肖哲峰，刘建平，等，肿瘤：一种蛋白质组病.2010,40（9）:788-794；【3】陈主初】陈主初,梁宋平梁宋平,肖志强肖志强,等等.肿瘤蛋白质组学肿瘤蛋白质组学.长沙长沙:湖南科技出版社湖南科技出版社,2002.19：454-463；【4】李文凯】李文凯,李子博李子博.蛋白质组学蛋白质组学一门正在崛起的蛋白质分子生物学一门正在崛起的蛋白质分子生物学,200
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