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1、实验五实验五 大肠杆菌生长曲线的大肠杆菌生长曲线的测定测定、微生物大小及数量测定、微生物大小及数量测定了解光电比浊计数法的原理。了解光电比浊计数法的原理。 学习、掌握光电比浊计数的操作方法。学习、掌握光电比浊计数的操作方法。通过细菌数量的测量了解大肠杆菌的生物特通过细菌数量的测量了解大肠杆菌的生物特征和规律，绘制生长曲线。征和规律，绘制生长曲线。 实验实验( (一一) ) 大肠杆菌生长曲线的测定大肠杆菌生长曲线的测定一、实验目的一、实验目的生长曲线生长曲线 将将少少量量纯纯种种单单细细胞胞微微生生物物接接种种到到定定量量的的液液体体培培养养基基中中，定定时时取取样样测测定定细细胞胞数数量量，以
2、以培培养养时时间间为为横横坐坐标标，以以菌菌数数为为纵纵坐坐标标作作图图，得得到到一一条条反反映映单单细细胞胞微微生生物物在在整整个个培培养期间菌数变化规律的曲线。养期间菌数变化规律的曲线。二、实验原理二、实验原理一个典型的生长曲线分为延缓期、对数期、一个典型的生长曲线分为延缓期、对数期、稳定期和衰亡期四个时期稳定期和衰亡期四个时期稀释平板计数法稀释平板计数法对样品稀释培养，据形成的菌落数计数。对样品稀释培养，据形成的菌落数计数。优点：优点：活菌计数方法，对设备要求不高。活菌计数方法，对设备要求不高。缺点：缺点：操作复杂。操作复杂。显微镜直接计数法显微镜直接计数法使用血球计数板在显微镜下直接计
3、数。使用血球计数板在显微镜下直接计数。优点：优点：操作简便，计数直观。操作简便，计数直观。缺点：缺点：计数结果为活细菌和死菌体的总和。计数结果为活细菌和死菌体的总和。光电比浊法光电比浊法光电比浊法是利用在一定的范围内，微生物细光电比浊法是利用在一定的范围内，微生物细胞浓度与透光度成反比的原理。当细菌细胞在胞浓度与透光度成反比的原理。当细菌细胞在溶液中数量越多，浊度越大，在光电比色计中溶液中数量越多，浊度越大，在光电比色计中测定时所吸收的光线越多。测定时所吸收的光线越多。优点：优点：简便快速，适合于自动控制。简便快速，适合于自动控制。 缺点：缺点：测定结果受培养液成分影响；某些样品测定结果受培养
4、液成分影响；某些样品 样品不适合用此法。样品不适合用此法。 菌种菌种 培养不同时段的大肠杆菌。培养不同时段的大肠杆菌。仪器或其他用具仪器或其他用具 分光光度计，比色皿等。分光光度计，比色皿等。三、实验器材三、实验器材开开电电源源，仪仪器器预预热热20 20 minmin，将将波波长长调调至至600 600 nmnm处。处。打打开开样样品品室室，将将挡挡光光体体插插入入比比色色皿皿架架，将将其推或拉入光路。其推或拉入光路。盖盖好好样样品品室室盖盖，在在T T MODEMODE下下，按按0%T0%T键键调调零零透射比。透射比。取出挡光体，按取出挡光体，按100%T/OA100%T/OA键调键调10
5、0%100%透射比。透射比。四、实验步骤四、实验步骤1.1.样品测试前的调试样品测试前的调试2.2.样品测定样品测定将将参参比比溶溶液液（未未接接种种的的LBLB液液体体培培养养基基）以以及及被测溶液倒入比色皿中。被测溶液倒入比色皿中。打打开开样样品品室室盖盖，将将参参比比溶溶液液放放在在样样品品架架的的第第一个槽位中，将被测溶液依次放入其它槽位。一个槽位中，将被测溶液依次放入其它槽位。将参比溶液推入光路，按将参比溶液推入光路，按100%T/OA100%T/OA键调满度。键调满度。按按MODEMODE，将将测测试试方方式式调调至至吸吸光光度度方方式式（A A）。此时此时, ,显示器显示显示器显
6、示“0.000”0.000”。将将被被测测溶溶液液推推入入光光路路，显显示示器器显显示示为为被被测测样样品的吸光值。品的吸光值。 在在600 600 nmnm波波长长下下，用用未未接接种种的的LBLB液液体体培培养养基基作作空空白白对对照照，分分别别对对培培养养了了0 0、4 4、8 8、1212、1616和和20 20 h h的的大大肠肠杆杆菌菌培培养养液液，进进行行光光电电比比浊浊测定。测定。 比比色色皿皿经经蒸蒸馏馏水水清清洗洗后后，必必须须经经待待测测样样品品润润洗洗。比比色色皿皿的的毛毛面面用用吸吸水水纸纸擦擦干干，而而光光面只能用吸水纸吸干，以免光面被划破。面只能用吸水纸吸干，以免
7、光面被划破。 比色皿之间吸光度进行比较。比色皿之间吸光度进行比较。四、实验结果四、实验结果 记录不同记录不同大肠杆菌培养液大肠杆菌培养液的的ODOD600600值，值，并绘制大肠杆菌的生长曲线。并绘制大肠杆菌的生长曲线。 培养时间培养时间（h） 4 8 12 16 20 光密度值光密度值OD600五、思考题五、思考题光电比浊计数的原理是什么？这种计数法有何光电比浊计数的原理是什么？这种计数法有何优缺点？优缺点？学学习习使使用用镜镜台台测测微微尺尺和和目目镜镜测测微微尺尺在显微镜下测定微生物大小的方法。在显微镜下测定微生物大小的方法。实验实验( (二二) ) 微生物大小的测定微生物大小的测定一、
8、目的要求一、目的要求对于病毒、细菌、放线菌、真菌和原生动物等不同类对于病毒、细菌、放线菌、真菌和原生动物等不同类型的微生物来说，它们的大小存在很大的差异。型的微生物来说，它们的大小存在很大的差异。在同一类型中不同种类的微生物，或同一种类中不同在同一类型中不同种类的微生物，或同一种类中不同时期的微生物个体，它们的大小也存在很大的差异。时期的微生物个体，它们的大小也存在很大的差异。二、实验原理二、实验原理 镜镜台台测测微微尺尺是是中中央央部部分分刻刻有有精精确确等等分分线线的的载载玻玻片片，一一般般是是将将l l mmmm等等分分为为100100格格，每每格格长长0.01 0.01 mm(mm(即
9、即10 10 um) um) ，用于校正目镜测微尺每格的相对长度。，用于校正目镜测微尺每格的相对长度。 目目镜镜测测微微尺尺是是一一块块中中央央有有精精确确的的等等分分刻刻度度的的圆圆形形小小玻玻片片，置置于于接接目目镜镜中中的的隔隔板板上上。目目镜镜测测微微尺尺每每小小格格所所代代表表的的实实际际长长度度不不一一样样，测测量量前前，必必须须先先用用镜镜台台测测微尺进行校正微尺进行校正。目镜测微尺镜台测微尺利用镜台测微尺测利用镜台测微尺测定目镜测微尺的每定目镜测微尺的每格绝对值格绝对值目镜测微尺测定微目镜测微尺测定微生物大小生物大小三、实验器材三、实验器材1 1、菌种：、菌种：酿酒酵母（酿酒酵
10、母（Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae ）2 2、器材：、器材： 显微镜、镜台测微尺、目镜测微尺显微镜、镜台测微尺、目镜测微尺三、实验步骤三、实验步骤1 1、目镜测微尺的校正、目镜测微尺的校正 镜台测微尺有刻度的一面朝上，置显微镜载物台上，镜台测微尺有刻度的一面朝上，置显微镜载物台上，先在低倍镜下，将镜台测微尺有刻度的部分移至视野先在低倍镜下，将镜台测微尺有刻度的部分移至视野中央。转动目镜使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的中央。转动目镜使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度平行。利用移动器移动镜台测微尺，使两尺在某刻度平行。利用移动器移
11、动镜台测微尺，使两尺在某一区域内两线完全重合，分别数出两重合线之间镜台一区域内两线完全重合，分别数出两重合线之间镜台微尺和目镜微尺所占的格数。计算微尺和目镜微尺所占的格数。计算40x40x下目镜测微尺的下目镜测微尺的校正值。校正值。目镜测微尺每格长度（目镜测微尺每格长度（umum）两重合线间镜台测微尺）两重合线间镜台测微尺格数格数10/10/两重合线间目镜测微尺格数两重合线间目镜测微尺格数2 2、细胞大小的测量、细胞大小的测量 酵母菌悬液滴在载玻片上，盖上盖玻片，置显微酵母菌悬液滴在载玻片上，盖上盖玻片，置显微镜载物台上。用目镜测微尺测量细胞宽和长。镜载物台上。用目镜测微尺测量细胞宽和长。三、
12、实验结果三、实验结果计算出目镜测微尺校正结果以及酵母菌大小测计算出目镜测微尺校正结果以及酵母菌大小测定结果定结果 四、思考题四、思考题1 1、为为什什么么更更换换不不同同放放大大倍倍数数的的目目镜镜或或物物镜镜时时，必必须须用用镜镜台台测测微微尺尺重重新新对对目目镜镜测测微微尺尺进进行行校校正正？1 1、明确血细胞计数板计数的原理。、明确血细胞计数板计数的原理。2 2、掌握使用血细胞计数板进行微生、掌握使用血细胞计数板进行微生 物计数的方法。物计数的方法。 实验实验( (三三) ) 微生物数量的测定微生物数量的测定一、目的要求一、目的要求二、实验原理二、实验原理显微镜直接计数法是将小量待测样品
13、的悬浮显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上玻片上( (又称计菌器又称计菌器) )，于显微镜下直接计数，于显微镜下直接计数的一种方法。的一种方法。显微镜直接计数法的优点是直观、快速。缺显微镜直接计数法的优点是直观、快速。缺点是所测得的结果通常是死菌体和活菌体的点是所测得的结果通常是死菌体和活菌体的总和。目前已有一些方法可以克服这一缺点，总和。目前已有一些方法可以克服这一缺点，如结合活菌染色，微室培养等方法来达到只如结合活菌染色，微室培养等方法来达到只计数活菌体的目的。计数活菌体的目的。 血细胞计数板由四条槽构成三
14、个平台；中间较宽的平台又被一短横血细胞计数板由四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为九个大方格，中间的大方格即为计数室。计数室是由一个大方格为九个大方格，中间的大方格即为计数室。计数室是由一个大方格分成分成2525个中方格，而每个中方格又分成个中方格，而每个中方格又分成1616个小方格；共计个小方格；共计400400个小个小方格。每一个大方格的面积为方格。每一个大方格的面积为1 mm1 mm2 2，盖玻片与计数区之间的高度为，盖玻片与计数区之间的高度为0.1 mm0.1
15、mm，所以计数室的容积为，所以计数室的容积为0.1 mm0.1 mm3 3 。计数时，通常在计数时，通常在4040下数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方下数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，以及大方格中的总菌数，再换算成格的平均值，以及大方格中的总菌数，再换算成1 ml1 ml菌液中的总菌菌液中的总菌数。数。(1ml=(1ml=? ? mm3)mm3)个计数室个计数室mmmm包含包含个中方格个中方格个中方格个中方格个小方格个小方格三、实验器材三、实验器材 1 1、菌种：、菌种： 酿酒酵母酿酒酵母 2 2、器材：、器材： 显微镜、血球计数板显微镜、血球计数板三、实验步骤三、实验步
16、骤 1 1、在、在1010和和4040下找到计数室。下找到计数室。2 2、盖盖上上盖盖玻玻片片将将摇摇匀匀的的酿酿酒酒酵酵母母菌菌（或或大大肠肠杆杆菌菌）悬悬液液由由盖盖玻玻片片边边缘缘滴滴一一小小滴滴，让让菌菌液液沿沿缝缝隙隙靠靠毛毛细细渗渗透透作作用用自自动动进进入入计计数数室室。如如滴滴入入过过多多，溢溢出出并并流流入入两两侧侧槽槽内内，使使盖盖玻玻片片浮浮起起，体体积积改改变变，会会影影响响计计数数结结果果，需需用用滤滤纸纸把把多多余余的的溶溶液液吸吸出出，以以槽槽内内没没有有溶溶液液为为宜宜。如如滴滴入入溶溶液液过过少少，经多次充液，易产生气泡，应洗净计数室，干燥后重做。经多次充液，
17、易产生气泡，应洗净计数室，干燥后重做。3 3、静置，先用低倍镜将计数室移至视野中央。、静置，先用低倍镜将计数室移至视野中央。4 4、在在高高倍倍下下计计数数：每每个个计计数数室室选选5 5个个中中格格(4(4个个角角和和中中央央的的一一个个中中格格) )中中的的菌菌体体进进行行计计数数。对对于于分分布布在在刻刻线线上上的的细细菌，依照菌，依照“数上不数下，数左不数右数上不数下，数左不数右“的原则进行计数。的原则进行计数。三、实验结果三、实验结果 1 1、统计五个大格中的细胞数量、统计五个大格中的细胞数量四、思考题四、思考题记数大格记数大格12345细胞记数细胞记数2 2、计算酵母菌（以及大肠杆菌）悬液的浓度。、计算酵母菌（以及大肠杆菌）悬液的浓度。 1 1、根据你的体会，说明用血细胞计数板计数的根据你的体会，说明用血细胞计数板计数的误差主要来自哪些方面？应如何尽量减少误差、误差主要来自哪些方面？应如何尽量减少误差、力求准确？力求准确？
