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1、第七节第七节 消化毒剂的作用机理消化毒剂的作用机理 1996年，吴文君等首次提出了年，吴文君等首次提出了消化毒剂消化毒剂的概念，把主要作的概念，把主要作用于昆虫消化系统，用于昆虫消化系统，即主要以消化系统为初始靶标的杀虫剂为即主要以消化系统为初始靶标的杀虫剂为消化毒剂。消化毒剂。 破坏破坏中肠中肠 中肠组织破坏剂中肠组织破坏剂 影响影响消化酶系消化酶系 消化抑制剂。消化抑制剂。 主要种类：主要种类： Bt内毒素内毒素 植物源次生代谢物植物源次生代谢物，如二氢沉香呋喃类化合物等。，如二氢沉香呋喃类化合物等。 两类靶标两类靶标一、一、 Bt内毒素内毒素 苏云金杆菌（苏云金杆菌（Bacillus t
2、huringiensis,Bt），），产品已达产品已达60余种，余种，是世界上产量最大、应用最广泛的微生物杀虫剂。是世界上产量最大、应用最广泛的微生物杀虫剂。 基本作用机理基本作用机理 BtBt的的杀杀虫虫活活性性主主要要是是其其产产生生的的杀杀虫虫蛋蛋白白晶晶体体在在起起作作用用。杀杀虫虫蛋蛋白白晶晶体体，也也叫叫原原毒毒素素（protoxinprotoxin），是是由由多多个个杀杀虫虫晶晶体体蛋蛋白白（insecticidalinsecticidal crystal crystal proteins,proteins,ICPsICPs）或或-内内毒毒素素（-endotoxinendotox
3、in）或或CryCry（晶晶体体）蛋蛋白白的的亚亚单单位位组组成成。昆昆虫虫摄摄食食该该毒毒蛋蛋白白后后，在在中中肠肠的的高高pHpH环环境境和和蛋蛋白白酶酶的的作作用用下下，毒毒蛋蛋白白晶晶体体溶溶解解并并被激活，引起试虫中肠膜上皮细胞裂解。被激活，引起试虫中肠膜上皮细胞裂解。症状：症状： 试虫失去运动能力，不停地颤抖，呕吐，停止取食，死亡试虫失去运动能力，不停地颤抖，呕吐，停止取食，死亡。 1. Bt杀虫晶体蛋白（杀虫晶体蛋白（Isecticidal Crystal Proteins，ICPs） 杀虫晶体蛋白是由苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白是由苏云金芽胞杆菌( ( BacillusBacil
4、lus thuringiensisthuringiensis ，Bt)Bt)所产生的毒素。所产生的毒素。 毒蛋白主要有毒蛋白主要有7 7种种：A2A2外毒素、外毒素、B2B2外毒素、外毒素、C2C2外毒外毒素、素、- -内毒素内毒素、不稳定外毒素、水溶性毒素、鼠因子、不稳定外毒素、水溶性毒素、鼠因子外毒素。外毒素。 - -内毒素内毒素是在形成芽孢的同时形成的蛋白质晶体，是在形成芽孢的同时形成的蛋白质晶体，位于芽孢之旁，所以又称位于芽孢之旁，所以又称伴孢晶体毒素伴孢晶体毒素，是主要的杀，是主要的杀虫晶体蛋白，这种晶体蛋白只是一种前毒素虫晶体蛋白，这种晶体蛋白只是一种前毒素( (PretoxinP
5、retoxin) )，经过激活，即消化成分子量为经过激活，即消化成分子量为100010007000070000的片段，才起毒素作用。的片段，才起毒素作用。 晶体蛋白有晶体蛋白有130130多种，按照杀虫范围和寄主同源型多种，按照杀虫范围和寄主同源型又可分为两大类群，即又可分为两大类群，即CryCry 蛋白蛋白和和CytCyt蛋白蛋白。 CryCry在活体和离体条件下只对鳞翅目、双翅目或鞘在活体和离体条件下只对鳞翅目、双翅目或鞘翅目有效；翅目有效； CytCyt活体条件下只对双翅目有效，而离体条件下具活体条件下只对双翅目有效，而离体条件下具有广谱性。有广谱性。 CryCry分为四大类（分为四大类
6、（根据杀虫谱）：根据杀虫谱）：CryCryI I（鳞翅目）、鳞翅目）、CryCryIIII( (鳞翅目和双翅目鳞翅目和双翅目) )、CryCryIIIIII（鞘翅目）和鞘翅目）和CryCryIVIV( (双翅目双翅目) )。 通常一种毒素只能杀死某一目的部分易感昆虫，通常一种毒素只能杀死某一目的部分易感昆虫，对有益生物和脊椎动物安全。对有益生物和脊椎动物安全。1. Bt杀虫晶体蛋白（杀虫晶体蛋白（ICPs） 完整的毒蛋白一般由完整的毒蛋白一般由三个结构域三个结构域组成。组成。 结构域结构域由一个由一个- -螺旋束组成，可能螺旋束组成，可能与细胞膜与细胞膜穿孔穿孔有关；有关； 结构域结构域由三组
7、由三组- -折叠片层组成，可能折叠片层组成，可能参与了参与了毒素与膜受体蛋白的识别和结合毒素与膜受体蛋白的识别和结合； 结构域结构域位于毒素分子位于毒素分子C-C-端，则可能端，则可能能够防止昆能够防止昆虫肠道蛋白酶对毒性肽分子的进一步降解虫肠道蛋白酶对毒性肽分子的进一步降解。 1. Bt杀虫晶体蛋白（杀虫晶体蛋白（Isecticidal Crystal Proteins，ICPs）2. Bt毒素受体蛋白毒素受体蛋白 晶体蛋白的毒性与受体蛋白和晶体蛋白晶体蛋白的毒性与受体蛋白和晶体蛋白结合的能力合的能力呈正相关，呈正相关，膜受体蛋白是毒蛋白膜受体蛋白是毒蛋白专一性的决定因子一性的决定因子。 昆
8、虫中肠昆虫中肠BtBt毒素受体蛋白主要为存在中肠的刷状毒素受体蛋白主要为存在中肠的刷状缘膜囊泡缘膜囊泡( (BBMV)BBMV)的的氨肽酶氨肽酶N N ( (aminopeptidaseaminopeptidase N N，APN)APN)（肽链端解端解酶酶，催化蛋白氨基末端残基的分裂，催化蛋白氨基末端残基的分裂 ）。）。鳞翅鳞翅目。目。 烟草天蛾中肠烟草天蛾中肠BBMVBBMV上上CryCry1Ab1Ab毒素的受体毒素的受体BT-R1BT-R1，证证明它是一明它是一种类钙粘蛋白种类钙粘蛋白( (cadherincadherin-like)-like)。 尖音库蚊幼虫中肠中球形芽孢杆菌晶体的尖
9、音库蚊幼虫中肠中球形芽孢杆菌晶体的BinBin毒素毒素受体可能是一种受体可能是一种- -葡糖苷酶葡糖苷酶。 - -内毒素的作用过程要经溶解、酶解活化、与受体内毒素的作用过程要经溶解、酶解活化、与受体结合、插入、孔洞或离子通道形成等五个环节。结合、插入、孔洞或离子通道形成等五个环节。昆虫取食孢子和毒素昆虫取食孢子和毒素毒素被蛋白酶活化毒素被蛋白酶活化毒素与膜受体结合毒素与膜受体结合毒素造成膜穿孔使细胞裂解毒素造成膜穿孔使细胞裂解3. 3. 杀虫晶体蛋白的作用机理杀虫晶体蛋白的作用机理 毒素的溶解毒素的溶解 晶体蛋白可以溶解于晶体蛋白可以溶解于pH 12pH 12或或pH 9.5pH 9.5并加有
10、巯并加有巯基试剂的碱性溶液中。中肠内环境诸如基试剂的碱性溶液中。中肠内环境诸如pHpH值、还原电值、还原电势、去垢性、体积等都可能影响势、去垢性、体积等都可能影响- -内毒素在昆虫体内毒素在昆虫体内的溶解性。鳞翅目幼虫的中肠内的溶解性。鳞翅目幼虫的中肠pHpH值一般都较高，呈值一般都较高，呈碱性碱性, , 对对- -内毒素的溶解很有利。内毒素的溶解很有利。3 3 杀虫晶体蛋白的作用机理杀虫晶体蛋白的作用机理 毒素的活化毒素的活化 溶解的晶体蛋白被中肠蛋白酶水解，由溶解的晶体蛋白被中肠蛋白酶水解，由130130kDkD左右的前毒素，打开二硫键，释放出左右的前毒素，打开二硫键，释放出N N 端的端
11、的7070kDkD左左右的抗酶多肽活力片段。右的抗酶多肽活力片段。 活力片段活力片段至少由两部分组成至少由两部分组成, , 即即毒力片段毒力片段和和细胞结细胞结合片段合片段。毒力片段位于。毒力片段位于N N端端, , 由几个保守的亲水区组成，由几个保守的亲水区组成，主要结构是主要结构是- -螺旋，对于螺旋，对于跨膜通道的形成及毒效跨膜通道的形成及毒效可能起可能起着重要作用。细胞结合片段由着重要作用。细胞结合片段由C C端的保守区和中间的可变端的保守区和中间的可变区组成，主要结构是区组成，主要结构是- -片层，负责片层，负责毒素与靶标昆虫受体毒素与靶标昆虫受体的结合的结合，从而决定了毒素的选择性
12、。中肠酶液的组成直，从而决定了毒素的选择性。中肠酶液的组成直接影响到接影响到- -内毒素的降解活化内毒素的降解活化, , 对对- -内毒素作用的专内毒素作用的专一性起着重要作用。一性起着重要作用。 3 3 杀虫晶体蛋白的作用机理杀虫晶体蛋白的作用机理 毒蛋白的活化过程毒蛋白的活化过程被昆虫取食的晶体蛋白被昆虫取食的晶体蛋白在中肠被溶解在中肠被溶解碱性环境碱性环境成熟毒素成熟毒素被中肠蛋白酶消化活化被中肠蛋白酶消化活化毒素的活化毒素的活化 3 3 杀虫晶体蛋白的作用机理杀虫晶体蛋白的作用机理 3 3 杀虫晶体蛋白的作用机理杀虫晶体蛋白的作用机理 毒素与受体蛋白的结合毒素与受体蛋白的结合 毒素被活
13、化以后，毒素首毒素被活化以后，毒素首先是通过结构域先是通过结构域与上皮细胞膜上的受体蛋白发生专与上皮细胞膜上的受体蛋白发生专一性结合。一性结合。结合分为两步结合分为两步，第一步即，第一步即初始结合初始结合( ( Initial Binding)Initial Binding)，结合上的毒素可以再次与受体发结合上的毒素可以再次与受体发生解离，故又称生解离，故又称可逆性结合可逆性结合( (Reversible Binding)Reversible Binding)；初始结合之后，毒素进一步与膜受体蛋白发生紧密结初始结合之后，毒素进一步与膜受体蛋白发生紧密结合或直接插入细胞膜合或直接插入细胞膜, ,
14、此时的毒素与受体难以发生解离此时的毒素与受体难以发生解离, ,故为故为不可逆性结合不可逆性结合( ( Irreversible Binding)Irreversible Binding)。 插插入入及及孔孔洞洞或或离离子子通通道道的的形形成成 - -内内毒毒素素与与刷刷状状缘缘膜膜上上的的受受体体结结合合后后，结结构构域域插插入入膜膜内内，形形成成孔孔洞洞或或离离子子通通道道，导导致致膜膜完完整整性性的的破破坏坏，引引起起离离子子渗渗漏漏，水随之进入细胞，细胞因膨胀而解体、死亡。水随之进入细胞，细胞因膨胀而解体、死亡。 3 3 杀虫晶体蛋白的作用机理杀虫晶体蛋白的作用机理 (+)结构域结构域
15、I- -螺旋束螺旋束 3 3 杀虫晶体蛋白的作用机理杀虫晶体蛋白的作用机理 结构域结构域在杀虫蛋白中的作用在杀虫蛋白中的作用 CryCry蛋白的结构域蛋白的结构域是由是由6-76-7个两亲的个两亲的-螺旋围绕着一个疏水的中心螺旋螺旋围绕着一个疏水的中心螺旋形成的。定点突变结果表明形成的。定点突变结果表明, , 结构域结构域可能是通过自身的带正电荷残基与带负电荷的膜表面接触的。对可能是通过自身的带正电荷残基与带负电荷的膜表面接触的。对于结构域于结构域在膜上形成穿孔的机制，认为是结构域在膜上形成穿孔的机制，认为是结构域IIII在完成毒素在完成毒素- -受体识别后，受体识别后，结构域结构域受毒素受毒
16、素- -受体结合的诱导要发生重大构象受体结合的诱导要发生重大构象变化，变化，周周围的两的两亲-螺旋向外翻，由螺旋向外翻，由-4-4螺旋与螺旋与-5-5螺旋构成螺旋构成的的“轴”突出，突出，4 4个毒素分子的个毒素分子的-5-5螺旋相互靠近形成孔道的内壁，螺旋相互靠近形成孔道的内壁，而而4 4个个-4-4螺旋螺旋则形成孔道的外壁，孔道穿透整个磷脂双形成孔道的外壁，孔道穿透整个磷脂双层，细胞外的水大量内流，胞外的水大量内流，导致致细胞胞胀裂。裂。 -5螺旋螺旋-4螺旋螺旋-5螺旋螺旋细胞膜细胞膜-4螺旋螺旋细胞膜细胞膜图图2 Bt杀虫毒蛋白作用的伞型模型与形成孔道原理示意图杀虫毒蛋白作用的伞型模型
17、与形成孔道原理示意图3 3 杀虫晶体蛋白的作用机理杀虫晶体蛋白的作用机理 结构域结构域由由3 3个个- -折叠片层组折叠片层组成，主要成，主要进行毒素与受体蛋白的特进行毒素与受体蛋白的特异性识别异性识别。在每个片层的顶端各有。在每个片层的顶端各有一个突环。毒素与受体的作用主要一个突环。毒素与受体的作用主要是通过这些突环与受体蛋白识别、是通过这些突环与受体蛋白识别、并进一步不可逆结合的。突环上氨并进一步不可逆结合的。突环上氨基酸组成和残基的带电性、侧链大基酸组成和残基的带电性、侧链大小及疏水性等对毒素与受体的专一小及疏水性等对毒素与受体的专一性结合都有影响，删除突环或改变性结合都有影响，删除突环
18、或改变突环上残基的性质都会导致毒素与突环上残基的性质都会导致毒素与受体结合能力的严重丧失。受体结合能力的严重丧失。 结构域结构域II -片层上的突环片层上的突环结构域结构域在毒素在毒素- -受体结合中的作用受体结合中的作用3 3 杀虫晶体蛋白的作用机理杀虫晶体蛋白的作用机理 结构域结构域在毒素在毒素- -受体结合中的作用受体结合中的作用 结构域结构域是由是由两组反平行的两组反平行的- -折叠片层组成的三明治结构。折叠片层组成的三明治结构。 通过交换不同毒素的通过交换不同毒素的结构域结构域发现发现, ,该结构域对毒该结构域对毒素的杀虫专一性有一定影响。素的杀虫专一性有一定影响。 结构域结构域也参
19、与了毒素也参与了毒素与受体的结合。与受体的结合。 结构域结构域与受体结合及离子通道活性的调节有关。与受体结合及离子通道活性的调节有关。 不同品系的不同品系的BtBt由于产生的由于产生的CryCry蛋白类型不同，不蛋白类型不同，不仅杀虫谱不同，而且很可能拥有不同的作用方式。总仅杀虫谱不同，而且很可能拥有不同的作用方式。总之，之，BtBt内毒素在进入昆虫中肠后，先是在碱性条件下内毒素在进入昆虫中肠后，先是在碱性条件下溶解，然后被活化为小分子多肽溶解，然后被活化为小分子多肽, ,再与中肠内膜上的再与中肠内膜上的刷缘状膜小泡（刷缘状膜小泡（BBMVBBMV）中特异受体结合，毒素分子插中特异受体结合，毒
20、素分子插入质膜形成一个微孔，以离子和小分子渗入，这些微入质膜形成一个微孔，以离子和小分子渗入，这些微孔因渗透肿胀而变大，最终细胞破裂。昆虫中肠上皮孔因渗透肿胀而变大，最终细胞破裂。昆虫中肠上皮细胞死亡，肠壁受损，肠道内容物进入血淋巴，直接细胞死亡，肠壁受损，肠道内容物进入血淋巴，直接造成血淋巴造成血淋巴pHpH值上升可使昆虫麻痹死亡；毒性肽进入值上升可使昆虫麻痹死亡；毒性肽进入血淋巴可使昆虫患毒血症死亡；活细胞或孢子进入血血淋巴可使昆虫患毒血症死亡；活细胞或孢子进入血腔可使昆虫患败血症死亡。腔可使昆虫患败血症死亡。 3 3 杀虫晶体蛋白的作用机理杀虫晶体蛋白的作用机理 二二氢氢沉沉香香呋呋喃喃
21、类类化化合合物物：苦苦皮皮藤藤素素、等等可可致致粘粘虫虫：中中肠肠柱柱状状细细胞胞的的微微绒绒毛毛排排列列不不整整齐齐，大大量量脱脱落落；基基膜膜内内褶褶空空间间变变大大，排排列列紊紊乱乱；细细胞胞质质密密度度降降低低；内内质质网网极极度度扩扩张张 ，囊囊泡泡化化，核核糖糖体体脱脱落落；线线粒粒体体嵴嵴模模糊糊不不清清楚楚，双双层层膜膜不不完完整整。推推测测其其机机理理为为：此此类类化化合合物物与与昆昆虫虫中中肠肠细细胞胞膜膜及及内内膜膜结结合合，膜膜系系统统结结构构发发生生改改变变，水水分分和和各各种种离离子子的的通通透透性性随随之之改改变变，引引起起细细胞胞肿肿胀胀、失失水水、瓦瓦解解，最
22、最终终死死亡亡。推推测测其其机机理理为为：此此类类化化合合物物与与昆昆虫虫中中肠肠细细胞胞膜膜及及内内膜膜结结合合，膜膜系系统统结结构构发发生生改改变变，水水分分和和各各种种离离子子的的通通透透性性随随之之改改变变，引引起起细细胞胞肿肿胀胀、失水、瓦解，最终死亡。失水、瓦解，最终死亡。 二、其他消化毒剂二、其他消化毒剂鬼臼毒素类化合物鬼臼毒素类化合物 丁布：丁布：可阻碍欧洲玉米螟幼虫和亚洲玉米螟幼虫的发育，可阻碍欧洲玉米螟幼虫和亚洲玉米螟幼虫的发育，使得幼虫体重降低，发育迟缓，蛹重降低，并出现畸形使得幼虫体重降低，发育迟缓，蛹重降低，并出现畸形蛹等，并对亚洲玉米螟幼虫具有较强的拒食作用。丁布蛹
23、等，并对亚洲玉米螟幼虫具有较强的拒食作用。丁布是一种消化抑制剂，可抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的是一种消化抑制剂，可抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的活性而影响食物的消化，进而影响昆虫的生长发育。丁活性而影响食物的消化，进而影响昆虫的生长发育。丁布作用于玉米螟的中肠细胞，使肠壁细胞再生细胞大量布作用于玉米螟的中肠细胞，使肠壁细胞再生细胞大量分裂，打破了固有的分裂周期，造成局部肿瘤，进而细分裂，打破了固有的分裂周期，造成局部肿瘤，进而细胞消融。急剧增长的肿瘤细胞消耗大量的能量，而且受胞消融。急剧增长的肿瘤细胞消耗大量的能量，而且受损的肠壁细胞不再具备分泌消化酶进行消化和吸收营养损的肠壁细胞不再具备分泌消化酶进行消化和吸收营养物质的功能，因而造成幼虫缺乏营养而死亡。物质的功能，因而造成幼虫缺乏营养而死亡。
