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1、第三节第三节 基因工程的常规技术基因工程的常规技术 杂交技术杂交技术 PCR技术技术n 凝胶电泳技术凝胶电泳技术 基因文库构建基因文库构建一一 凝胶电泳技术凝胶电泳技术凝胶电泳：凝胶电泳：用用琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶或或聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶等作为等作为介质的区带电泳法称为凝胶电泳技术介质的区带电泳法称为凝胶电泳技术。凝胶电泳的原理：凝胶电泳的原理： 分离原理分离原理- -在电场的作用下，在电场的作用下，DNADNA分子在琼脂糖凝胶中移分子在琼脂糖凝胶中移动时，有电荷效应和分子筛效应动时，有电荷效应和分子筛效应。 检测原理检测原理- -溴化乙锭（溴化乙锭（EBEB）在紫外光照射下能发射荧光，
2、）在紫外光照射下能发射荧光，当用当用EBEB对对DNADNA样品染色时，加入的样品染色时，加入的EBEB就插入就插入DNADNA分子中，荧光分子中，荧光强度与强度与DNADNA含量成正比。含量成正比。影响琼脂糖凝胶电泳的因素：影响琼脂糖凝胶电泳的因素：nDNA片段的大小片段的大小n凝胶的类型凝胶的类型n凝胶的浓度凝胶的浓度n电泳缓冲液电泳缓冲液n电压电压琼脂糖凝胶电泳装置：琼脂糖凝胶电泳装置： 琼脂糖凝胶电泳装置：琼脂糖凝胶电泳装置：凝胶成像分析系统：凝胶成像分析系统： DNA电泳图谱电泳图谱 RNA电泳图谱电泳图谱 nn重组子：重组子：重组子：重组子： 2.7 2.7 kbkb + 4.0
3、kb + 4.0 kbnn非重组子：非重组子：非重组子：非重组子： 2.7 2.7 kbkbpUC18pUC18 2.7kb2.7kbHindIIIHindIII SphISphI PstIPstI SalISalI BamHIBamHI SmaISmaI KpnIKpnI EcoRIEcoRIApAprrlacZlacZoriori4.0 4.0 kbkb2.7 kb2.7 kb5.4 kb5.4 kbL1 L24.0 kb4.0 kbP PHH聚丙烯酰胺凝胶电泳装置及其原理示意图聚丙烯酰胺凝胶电泳装置及其原理示意图 SDS-PAGE电泳图谱电泳图谱 n1975，Edwen Southern
4、提出分子印迹概念。n概念：将存在于凝胶中的生物大分子转移（印迹）于固定化介质上并加以检测分析的技术。目前主要应用于DNA，RNA，蛋白质的检测。二二 杂交技术杂交技术核酸分子杂交的基本原理：核酸分子杂交的基本原理：n具有互补序列两条单链核酸分子在一定条件下具有互补序列两条单链核酸分子在一定条件下按碱基互补配对原则退火形成双链的过程。按碱基互补配对原则退火形成双链的过程。 n杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列，已知杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列，已知核酸序列称探针。核酸序列称探针。 DNA-DNA杂交双链分子杂交双链分子DNA印迹技术印迹技术nSouthern blotting 基因组基因组
5、DNA经限制性内切酶消化后，进行琼脂糖经限制性内切酶消化后，进行琼脂糖凝胶电泳，将含有凝胶电泳，将含有DNA片断的凝胶放入变性溶液变性片断的凝胶放入变性溶液变性后，将硝酸纤维膜后，将硝酸纤维膜(NC)膜放在胶上，上面放吸水纸巾，膜放在胶上，上面放吸水纸巾，利用毛吸作用使胶利用毛吸作用使胶DNA转移质转移质NC膜上，然后利用杂膜上，然后利用杂交技术检测交技术检测NC膜上的膜上的DNA片断。片断。Southern Blotting: Gel TransferSouthern blotRNA印迹技术印迹技术nNorthern blotting 与与Southern blotting相似，但不需要限制
6、性相似，但不需要限制性内切酶切割。用于基因表达的特异性分析和定量内切酶切割。用于基因表达的特异性分析和定量分析。分析。 酵母转化子酵母转化子Northern杂交结果杂交结果蛋白质免疫印迹法蛋白质免疫印迹法nWestern blotting: 免疫印迹法是检测蛋白质混合溶液中某种特定目的蛋免疫印迹法是检测蛋白质混合溶液中某种特定目的蛋白质的定性方法，也可以作为确定同一蛋白质在不同细胞白质的定性方法，也可以作为确定同一蛋白质在不同细胞或者同一种细胞不同条件下的相对含量的半定量方法。由或者同一种细胞不同条件下的相对含量的半定量方法。由于其检测往往需要抗体，所以也被称为免疫印迹技术。于其检测往往需要抗
7、体，所以也被称为免疫印迹技术。n应用应用 1 检测样品中特异蛋白存在与否检测样品中特异蛋白存在与否 2 细胞中特异蛋白的半定量分析细胞中特异蛋白的半定量分析 3 蛋白质分子相互作用的研究蛋白质分子相互作用的研究原理：蛋白质组分经原理：蛋白质组分经SDS-PAGE分离后，平行转分离后，平行转移到固相支持体（移到固相支持体（NC膜或膜或PVDF膜）上，通过免疫膜）上，通过免疫试剂来检测靶蛋白。试剂来检测靶蛋白。靶蛋白的检测通常采用两步法或间接法，用一抗结靶蛋白的检测通常采用两步法或间接法，用一抗结合靶蛋白，再用过氧化物酶（合靶蛋白，再用过氧化物酶（HRP）标记的二抗标记的二抗结合一抗，然后结合一抗
8、，然后HRP催化化学显色反应或化学发催化化学显色反应或化学发光反应。光反应。三三 PCR技术技术PCRPCR技术的创建技术的创建Kary B. Mullis（穆利斯（美）Khorana(1971)Khorana(1971)等提出在体外经等提出在体外经DNADNA变性变性, ,与适当引物杂交与适当引物杂交, ,再再用用DNADNA聚合酶延伸聚合酶延伸, ,克隆克隆DNADNA的设想。的设想。19831983年年,Mullis,Mullis发明了发明了PCRPCR技术技术, ,使使KhoranaKhorana的设想得到实现。的设想得到实现。19881988年年SaikiSaiki等将耐热等将耐热D
9、NADNA聚合酶（聚合酶（TaqTaq）引入了）引入了PCRPCR技术技术 19891989年美国年美国ScienceScience杂志列杂志列PCR PCR 为十余项重大科学发明之为十余项重大科学发明之首首, ,比喻比喻19891989年为年为PCRPCR爆炸年爆炸年,Mullis,Mullis荣获荣获19931993年度诺贝尔化学年度诺贝尔化学奖。奖。Kary B. Mullis（1944）http:/PCRPCR技术的基本原理技术的基本原理无细胞分子克隆法：在微量离心管中无细胞分子克隆法：在微量离心管中, ,加入适量的缓冲液加入适量的缓冲液, , 微量的模板微量的模板DNA,DNA,四种
10、脱氧单核苷酸四种脱氧单核苷酸, ,耐热性多聚酶耐热性多聚酶, , 一对一对合成合成DNADNA的引物的引物, ,通过通过高温变性高温变性、低温退火低温退火和和中温延伸中温延伸三三个阶段为一个循环个阶段为一个循环, ,每一次循环使特异区段的基因拷贝数每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍放大一倍, ,一般样品是经过一般样品是经过3030次循环次循环, ,最终使基因放大了最终使基因放大了数百万倍数百万倍; ; 扩增了特异区段的扩增了特异区段的DNADNA带。带。 PCR扩增原理引物引物引物引物延伸延伸延伸延伸延伸延伸延伸延伸5 55 53 33 3变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退
11、火变性、退火变性、退火变性、退火Polymerase Chain Reaction (PCR)引物设计：引物设计：（1)1)序列应位于高度保守区序列应位于高度保守区, ,与非扩增区无同源序列。与非扩增区无同源序列。（2 2）引物长度以）引物长度以15-30 15-30 bpbp为宜（为宜（17 1.517 1.510101010bpbp）。）。（3 3）碱基尽可能随机分布碱基尽可能随机分布,G+C,G+C占占50-60%50-60%。（4 4）引物内部避免形成二级结构。）引物内部避免形成二级结构。（5 5）两引物间避免有互补序列。）两引物间避免有互补序列。（6 6）引物）引物3 3端为关键碱基
12、；端为关键碱基；5 5端端无严格限制。无严格限制。 总体积总体积 50-100 l Buffer 缓冲液缓冲液 dNTP 原料原料 Primer 引物（引物（0.1-0.5 mol/L） DNA分子分子 模板模板 （50-100ng ） Taq酶酶 DNA聚合酶（聚合酶（0.5-2.5 U/50 L ） 反应体系：反应体系：经典循环参数：经典循环参数：94 30s 55 45s72 1min 94 5min30次次 72 7min 4用途广泛：用途广泛：生命学科生命学科生命学科生命学科医学工程医学工程医学工程医学工程遗传工程遗传工程遗传工程遗传工程疾病诊断疾病诊断疾病诊断疾病诊断法医学法医学法
13、医学法医学考古学考古学考古学考古学四四 基因文库构建基因文库构建nn基因文库的基本概念基因文库的基本概念基因文库的基本概念基因文库的基本概念nn基因文库的构建程序基因文库的构建程序基因文库的构建程序基因文库的构建程序nn基因组文库重组克隆的排序基因组文库重组克隆的排序基因组文库重组克隆的排序基因组文库重组克隆的排序基因文库（基因文库（gene librarygene library）从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式存在（人工构建）。根据构建方法的不同，基的形式存在（人工构建）。根据构建方法的不同，基因文库分为：因文库分为： 基因
14、组文库（含有全部基因）基因组文库（含有全部基因）cDNA文库（含有全部蛋白质编码的结构基因）文库（含有全部蛋白质编码的结构基因）基因文库构建的基本战略基因文库构建的基本战略用用cDNA法构建法构建cDNA文库，文库，材料来自材料来自mRNA 在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段的段的mRNAmRNA种类不同（即基因的表达谱不同），因此同种种类不同（即基因的表达谱不同），因此同种生物体的生物体的cDNAcDNA文库一般还有组织细胞的界定，如肝组织文库一般还有组织细胞的界定，如肝组织cDNAcDNA文库或胚胎组织文库或胚胎组织cDNAcDNA文
15、库等。文库等。用鸟枪法构建基因组文库，用鸟枪法构建基因组文库，材料来自染色体材料来自染色体DNA基因文库的构建程序基因文库的构建程序基因组基因组DNA的制备的制备 为为了了最最大大限限度度地地保保证证基基因因在在克克隆隆过过程程中中的的完完整整性性， 用用于于基基因因组组文文库库构构建建的的DNADNA在在分分离离纯纯化化操操作作中中应应尽尽量量避避免免过过度度的的断断裂裂。制制备备的的DNADNA分分子子量量越越大大，经经切切割割处处理理后后样样品品中中含含有有不不规规则则末末端端的的DNADNA片片段段的的比比率率就就越越低低，重重组组率率和和完完备备性性也也就就越高。越高。基因组基因组D
16、NA的切割的切割 用用于于基基因因组组文文库库构构建建的的DNADNA片片段段的的切切割割一一般般采采用用超超声声波波处处理理和和限限制制性性内内切切酶酶部部分分酶酶切切两两种种方方法法，其目的是：其目的是：第一，保证第一，保证DNA片段之间存在部分重叠区片段之间存在部分重叠区 第二，保证第二，保证DNA片段大小均一片段大小均一载体和受体的选择载体和受体的选择 出出于于压压缩缩重重组组克克隆隆的的数数量量，用用于于基基因因组组文文库库构构建建的的载载体体通通常常选选装装载载量量较较大大的的-DNA-DNA或或考考斯斯质质粒粒；对对于于大大型型基基因因组组（如如动动植植物物和和人人类类）需需使使
17、用用YACYAC或或BACBAC载体载体。 由由于于绝绝大大多多数数真真核核生生物物的的mRNAmRNA小小于于10 10 kbkb，因因此用于此用于cDNAcDNA文库构建的载体通常选质粒文库构建的载体通常选质粒。 用于基因文库构建的受体则根据载体使用大肠杆用于基因文库构建的受体则根据载体使用大肠杆菌或酵母菌。菌或酵母菌。从基因文库中筛选目的基因从基因文库中筛选目的基因 大大型型基基因因组组文文库库一一般般由由数数十十万万甚甚至至上上百百万万个个重重组组克克隆隆组组成成。除除了了一一些些具具有有特特殊殊功功能能的的蛋蛋白白质质编编码码基基因因（如如抗抗药药性性基基因因、结结合合蛋蛋白白编编码码基基因因等等）可可以以采采用用特特殊殊的的正正选选择择筛筛选选程程序序（如如抗抗药药性性筛筛选选法法、酵酵母母双双杂杂交交技技术术等等）直直接接筛筛选选外外，一一般般的的基基因组文库筛选均需多轮操作步骤。因组文库筛选均需多轮操作步骤。 从基因文库中筛选目的基因从基因文库中筛选目的基因密集铺板（密集铺板（1-10万）万）目的重组克隆目的重组克隆杂交杂交取挖取挖铺板铺板铺板铺板作业：n简述基因工程实验中常规技术？
