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1、细菌的特殊染色技术细菌的特殊染色技术一、目的要求一、目的要求n学习并掌握芽胞染色法原理和方法，并学习并掌握芽胞染色法原理和方法，并了解芽胞的形态特征；了解芽胞的形态特征；n学习并掌握荚膜染色法原理和方法，并学习并掌握荚膜染色法原理和方法，并了解荚膜的形态特征；了解荚膜的形态特征；n巩固显微镜操作技术及无菌操作技术。巩固显微镜操作技术及无菌操作技术。 二、基本原理二、基本原理 用着色力强的染色剂孔雀绿或石炭酸复红，在加用着色力强的染色剂孔雀绿或石炭酸复红，在加热条件下染色，使染料不仅进入菌体也可进入芽孢内，热条件下染色，使染料不仅进入菌体也可进入芽孢内，进入菌体的染料经水洗后被脱色，而芽孢一经着
2、色难进入菌体的染料经水洗后被脱色，而芽孢一经着色难以被水洗脱，当用对比度大的复染剂染色后，芽孢仍以被水洗脱，当用对比度大的复染剂染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色，而菌体和芽孢囊被染成复染剂的保留初染剂的颜色，而菌体和芽孢囊被染成复染剂的颜色，使芽孢和菌体更易于区分。颜色，使芽孢和菌体更易于区分。n荚膜是包裹在某些细菌细胞外的一层黏液状荚膜是包裹在某些细菌细胞外的一层黏液状或胶状物质，含水量很高，其他成分主要为或胶状物质，含水量很高，其他成分主要为多糖、多肽或糖蛋白等。荚膜不易着色且容多糖、多肽或糖蛋白等。荚膜不易着色且容易被水洗去，因此常用负染法进行染色，而易被水洗去，因此常用负染法进行染色，而
3、荚膜不着色，在深色背景下呈现发亮区域。荚膜不着色，在深色背景下呈现发亮区域。n由于荚膜含水量高，制片时通常不用热固定，由于荚膜含水量高，制片时通常不用热固定，以免变形影响观察。以免变形影响观察。二、基本原理二、基本原理三、器材三、器材n菌种菌种 枯草芽胞杆菌、褐球固氮菌枯草芽胞杆菌、褐球固氮菌 2d营养琼脂斜面培养物。营养琼脂斜面培养物。n溶液和试剂溶液和试剂 5%孔雀绿水溶液、孔雀绿水溶液、0.5%番红水溶液、绘番红水溶液、绘图墨水（滤纸过滤后使用）等。图墨水（滤纸过滤后使用）等。n仪器和其他用品仪器和其他用品 酒精灯、载玻片、盖玻片、显微镜、双酒精灯、载玻片、盖玻片、显微镜、双层瓶（内装香
4、柏油和二甲苯），擦镜纸，接种环，小试管、层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸，接种环，小试管、烧杯、试管架，镊子，载玻片夹子，载玻片支架，滤纸，烧杯、试管架，镊子，载玻片夹子，载玻片支架，滤纸，滴管和无菌生理盐水等。滴管和无菌生理盐水等。 四、操作步骤四、操作步骤1、芽胞染色、芽胞染色n制片制片 按常规方法涂片、干燥及固定；（回忆涂片的关键环节？）按常规方法涂片、干燥及固定；（回忆涂片的关键环节？）n加热染色加热染色 向载玻片滴加数滴向载玻片滴加数滴5%孔雀绿水溶液覆盖涂菌部位，用夹子夹孔雀绿水溶液覆盖涂菌部位，用夹子夹住载玻片在微火上加热至染液冒蒸汽并维持住载玻片在微火上加热至染液冒蒸汽并维持
5、5min，加热时注意补充染液，加热时注意补充染液，切勿让涂片干涸；（保持涂菌部位的染液不干涸，否则菌体变性，无法切勿让涂片干涸；（保持涂菌部位的染液不干涸，否则菌体变性，无法观察）观察）n脱色脱色 待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗至流出水无色为止；待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗至流出水无色为止；n复染复染 用用0.5%番红水溶液复染番红水溶液复染2min；n水洗水洗 用缓流自来水冲洗至流出水无色为止；用缓流自来水冲洗至流出水无色为止；n镜检镜检 成功的关键：成功的关键：n（1）选用适当菌龄适当菌龄的菌种，幼龄菌尚未形成芽胞，而老龄菌芽胞囊已破裂；n（2）加热染色时必须维持在染液微冒蒸汽的状态微冒
6、蒸汽的状态，加热沸腾会导致菌体或芽胞囊破裂，加热不够则芽胞难以着色；n（3）脱色必须等待玻片冷却后进行，否则骤然用冷水冲洗会导致玻片破裂。 2、荚膜染色、荚膜染色 1、取干净载玻片，在其上滴加 1d 绘图墨水，挑取少量菌体于其中混匀； 2、盖上盖玻片，镜检即可。（尽量不要混入空气）成功的关键：成功的关键：n（1）载玻片必须干净无油迹干净无油迹，否则混合液不能均匀铺开；n（2）绘图墨水使用量要很少绘图墨水使用量要很少，否则会完全覆盖菌体与荚膜，难以观察；n（3）制片过程中所涉及的固定及干燥步骤均不能加热和用热风吹干不能加热和用热风吹干，因为荚膜含水量高，加热会使其失水变形。同时，加热会使菌体失水收缩，与细胞周围染料（或绘图墨水）脱离而产生透明的明亮区，导致某些不产荚膜的细菌被误认为有荚膜。 四、操作步骤四、操作步骤芽孢形状芽孢形状荚膜荚膜
