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1、层层 析析CHROMATOGRAPHY掌握：层析的概念、一般原理掌握：层析的概念、一般原理凝胶层析的基本原理凝胶层析的基本原理装层析柱的过程及装柱要求装层析柱的过程及装柱要求熟悉：层析技术的分类熟悉：层析技术的分类凝胶层析的特点凝胶层析的特点凝胶的结构与性质凝胶的结构与性质了解：凝胶的选择了解：凝胶的选择柱、样品、洗脱液的选择柱、样品、洗脱液的选择凝胶的保存凝胶的保存一一.概述概述 层层析析Chromatography(色色谱谱),利利用用混混合合物物中中各各组组分分的的物物理理化化学学性性质质间间的的差差异异(溶溶解解度度、分分子子极极性性、分分子子大大小小、分分子子形形状状、吸吸附附能能力
2、力、分分子子亲亲合合力力等等)，使使各各组组分分在在支支持持物物上上集集中中分分布布在在不不同同区区域域，借借此此将将各各组组分分分离。分离。色谱历史色谱历史古古罗马人分析混合染料（类似辐射纸色谱）罗马人分析混合染料（类似辐射纸色谱）19031903（19061906）年，）年，MichaelMichael TswettTswett提出提出色谱法色谱法19311931年，年，KuhnKuhn采用柱色谱分离了类胡萝卜素采用柱色谱分离了类胡萝卜素19411941年，年，MartinMartin和和SyngeSynge提出分配色谱法提出分配色谱法 19441944年，年，MartinMartin等又
3、提出纸色谱法等又提出纸色谱法 19521952年，年，MartinMartin和和JamesJames发明了气液色谱法发明了气液色谱法19551955年年，第第一一台台商商品品气气相相色色谱谱问问世世，标标志志着着现现代色谱分析的建立代色谱分析的建立19561956年，年，StahlStahl系统研究了薄层色谱法系统研究了薄层色谱法(TLC)(TLC)19581958年年，SteinStein和和MooreMoore研研制制出出氨氨基基酸酸分分析析仪仪，确定了核糖核酸的分子结构确定了核糖核酸的分子结构19671967年年，HorvvathHorvvath和和HuberHuber等等研研制制了了
4、高高效效液液相色谱相色谱( (high-performance liquid chromatography,HPLChigh-performance liquid chromatography,HPLC) )仪仪19751975年，年，SmallSmall等提出离子色谱等提出离子色谱 2020世纪世纪8080年代，超临界色谱年代，超临界色谱2020世世纪纪9090年年代代，毛毛细细管管电电泳泳（18091809年年ReRessss第一次电泳实验）第一次电泳实验）2121世世纪纪，联联用用技技术术、大大分分子子色色谱谱分分离离、制制备备色谱可望取得更大的发展色谱可望取得更大的发展层层析析法法进进
5、行行时时有有两两个个相相，一一个个相相称称为为固固定定相相(Stationaryphase)，另另一一相相称称为为流流动动相相(Mobilephase)。由由于于各各组组分分所所受受固固定定相相的的阻阻力力和和流流动动相相的的推推力力影影响响不不同同，各各组组分分移移动动速速度度也也各各异异，从而使各组分得到分离从而使各组分得到分离。二二.层析技术的分类层析技术的分类 1.按两相所处的按两相所处的状态状态分类分类以以液液体体作作为为流流动动相相的的层层析析称称为为液液相相层层析析，以气体作为，以气体作为流动相流动相的称为的称为气相层析气相层析。其其固固定定相相也也可可有有两两种种状状态态，一一
6、种种是是以以固固体体作作为为吸吸附附剂剂的的固固定定相相，另另一一种种是是以以涂涂布在固体载体表面的布在固体载体表面的液体液体作为固定相。作为固定相。层析层析气相层析（气相层析（gas-chromatography）液相层析（液相层析（liquid-chromatography）气气-固层析（固层析（gas-solidchromatography）气气-液层析（液层析（gas-liquidchromatography）液液-固层析（固层析（liquid-solidchromatography）液液-液层析（液层析（liquid-liquidchromatography）2.按层析过程的机制可分
7、为按层析过程的机制可分为.吸附层析吸附层析(adsorptionchromatography ) -利用吸附剂对不同组分利用吸附剂对不同组分吸附吸附能力的不同能力的不同加以分离的方法。加以分离的方法。.分配层析分配层析(partitionchromatography ) -利用不同组分在流动相和固定相中的利用不同组分在流动相和固定相中的分配系数分配系数不同而进行分离的方法。不同而进行分离的方法。.离子交换层析离子交换层析（ion-exchangechromatography） -利利用用离离子子交交换换剂剂与与各各组组分分之之间间的的离离子子亲亲和和力不同力不同而进行层析分离的方法。而进行层析
8、分离的方法。.凝胶层析凝胶层析（gelchromatography） -利利用用不不同同组组分分之之间间分分子子大大小小不不同同，在在通通过过凝凝胶胶介介质质时时所所受受到到的的阻阻滞滞作作用用的的差差异异而而进行分离的方法。进行分离的方法。.亲和层析亲和层析（affinitychromatography）-利利用用生生物物大大分分子子之之间间特特有有亲亲和和力力的的不不同同进分离纯化的方法。进分离纯化的方法。3.按操作技术形式分类按操作技术形式分类.柱层析柱层析（columchromatography） -将将固固定定相相装装在在层层析析柱柱中中，使使样样品品朝朝着着一一个个方方向向移移动动
9、，通通过过各各组组分分随随流流动动相相流流动而得到分离的方法。动而得到分离的方法。纸层析纸层析（paperchrmatography） -用用纸纸作为液体的载体，样品点在作为液体的载体，样品点在纸上随后展开达到分离鉴定的纸上随后展开达到分离鉴定的方法。方法。.薄层层析薄层层析（thinlayperchromatography） -将适当的将适当的吸附剂吸附剂在玻璃板或在玻璃板或其他材料薄板上其他材料薄板上铺成薄层铺成薄层，样品，样品点在上面随后用流动相展开达点在上面随后用流动相展开达到分离鉴定的方法。到分离鉴定的方法。三三.层析的一般原理层析的一般原理 1.分配系数分配系数(Partition
10、chromatography)混混合合物物在在层层析析过过程程中中不不管管层层析析技技术术采采用用哪哪两两种种状状态态的的相相(流流动动相相和和固固定定相相)都都能能达达到到分分配配平平衡衡，用用来来叙叙述述一一种种物物质质在在两两种种特定相中的分配程度特定相中的分配程度是用分配系数表示的。是用分配系数表示的。分分配配系系数数-是是一一种种物物质质在在两两种种特特定定相相中中分分配配，在在特特定定的的温温度度时时这这个个系系数数的的值值是是一一个个常常数数，即即:溶质在固定相中的浓度溶质在固定相中的浓度CsK=溶质在流动相中的浓度溶质在流动相中的浓度Cm有效分配系数有效分配系数：定义为化合物在
11、一个相的总量：定义为化合物在一个相的总量除以另一个相中的总量。实际上是分配系数乘除以另一个相中的总量。实际上是分配系数乘以两个相的体积比。以两个相的体积比。在不同的层析机制中在不同的层析机制中,分配系数分配系数K的含义的含义不同不同,在吸附层析中在吸附层析中,K为吸附平衡常数为吸附平衡常数;在分配在分配层析中层析中,K为分配系数为分配系数;在离子交换层析中在离子交换层析中K为为交换常数交换常数. 分配系数分配系数K值大值大,说明物质在层析中被说明物质在层析中被固定相吸附得比较牢固固定相吸附得比较牢固,随流动相迁移的速随流动相迁移的速度较慢度较慢,留在固定相中的时间较长留在固定相中的时间较长,在
12、洗脱液在洗脱液中后出峰。若分配系数中后出峰。若分配系数K值小，则该物质在值小，则该物质在洗脱液中较早出峰。洗脱液中较早出峰。从从一一个个混混合合物物中中分分离离和和纯纯化化一一种种生生物物物物质质的的纯纯度度如如何何，取取决决于于混混合合物物中中各各组组分分K值的差异程度。值的差异程度。混混合合物物中中各各组组分分若若K值值相相差差较较大大,则则能能较较易易地地把把混混合合物物中中的的生生物物物物质质分分离离。反反之之,K值值相相差差较较小小,不不易易把把混混合合物物中中的的生生物物物物质质分离分离。2.讨论层析中的移动情况讨论层析中的移动情况通通常常采采用用平平衡衡过过程程的的研研究究方方法
13、法,把把层层析析柱柱划划分分为为若若干干连连续续部部分分,每每个个体体系系都都达达到到平平衡。衡。理理论论板板数数(n)：在在层层析析柱柱上上，溶溶剂剂连连续续不不断断加加入入，化化合合物物在在流流动动相相和和固固定定相相中中不不断断分分配配平衡，所发生的平衡次数称为理论板数。平衡，所发生的平衡次数称为理论板数。凝胶层析凝胶层析GelChromatography一、定义一、定义凝凝胶胶层层析析是是按按照照被被分分离离物物质质分分子子大大小小,经经过过具具有有一一定定孔孔径径的的多多孔孔物物质质进进行行分分离离的的一一种种方方法法。其其又又称称为为凝凝胶胶过过滤滤或或分分子子筛筛过滤过滤或排阻层
14、析。或排阻层析。主要机理是主要机理是分子筛效应分子筛效应,当被分离物质当被分离物质流经凝胶柱时流经凝胶柱时,因各组份的因各组份的分子大小不同分子大小不同,在凝胶受到的在凝胶受到的阻滞作用有差异阻滞作用有差异,从而造成各从而造成各组分在凝胶柱中的组分在凝胶柱中的迁移速度不同迁移速度不同得到分得到分离。二二.基本原理基本原理 流动相（洗脱液）流动相（洗脱液）固定相（凝胶）固定相（凝胶） 原理原理：被分离物质中各组分的：被分离物质中各组分的分子量分子量不同不同 。进入具有一定孔径的凝胶柱后进入具有一定孔径的凝胶柱后,较较大大的的分子分子不能进入凝胶孔隙不能进入凝胶孔隙中中,被排阻在外被排阻在外,而而
15、较较小小的分子则的分子则能进入凝胶孔隙能进入凝胶孔隙,加入洗脱剂加入洗脱剂后后,大分子大分子就随洗脱剂从凝胶间隙洗脱下来就随洗脱剂从凝胶间隙洗脱下来,受到的受到的阻力小阻力小,其其流速较快流速较快,小分子小分子物质从物质从上一层凝胶孔隙中出来又扩散到下一层凝上一层凝胶孔隙中出来又扩散到下一层凝胶孔隙中胶孔隙中,这样这样多次反复多次反复,大分子物质先从大分子物质先从柱中流出柱中流出,小分子物质后流出小分子物质后流出 。小小分分子子由由于于扩扩散散作作用用进进入入凝凝胶胶颗颗粒粒内内部部而而被被滞滞留留,大大分分子子被被排排阻阻在在凝凝胶胶颗颗粒粒外外面面,在颗粒之间在颗粒之间迅速通过迅速通过。凝
16、胶层析过程的数理关系凝胶层析过程的数理关系 柱床体积柱床体积(VT)即凝胶体积以及颗粒即凝胶体积以及颗粒内外间隙体积的总和。内外间隙体积的总和。VT=1/4 D2hD是内壁的直径是内壁的直径h是凝胶层析柱床的高度。是凝胶层析柱床的高度。洗脱体积（洗脱体积（Ve）即欲分离物质通过层析即欲分离物质通过层析柱洗脱下来所需洗脱液柱洗脱下来所需洗脱液的总体积。的总体积。外水体积（外水体积（V0）即存在于柱床内凝胶外即存在于柱床内凝胶外面空隙之间的水相体积，面空隙之间的水相体积，相应于一般层析法中流相应于一般层析法中流动相的体积。动相的体积。内水体积（）内水体积（）即凝胶颗粒内部所含即凝胶颗粒内部所含水相
17、的体积，它可从水相的体积，它可从干凝胶颗粒重量和吸干凝胶颗粒重量和吸水重量求得。水重量求得。凝胶干体积（）凝胶干体积（）+ 洗脱体积与及之间的关系洗脱体积与及之间的关系 （）（）为样品组分的分配系数，也可以说为样品组分的分配系数，也可以说是是分分子子量量不不同同的的溶溶质质在在凝凝胶胶内内部部和和外外部的分配系数。部的分配系数。它它只只与与被被分分离离物物质质分分子子的的大大小小和和凝凝胶胶颗颗粒粒孔孔隙隙的的大大小小分分布布有有关关，而而与与柱柱的的长长短短粗粗细细无无关关，也也就就是是说说它它对对每每一一物物质质为为常常数数与与柱柱的物理条件无关。的物理条件无关。可通过实验求得。可通过实验
18、求得。Ve为实际测得洗脱体积为实际测得洗脱体积。Vo可可用用不不被被凝凝胶胶滞滞留留的的大大分分子子物物质质的的溶溶液液（最最好好有有颜颜色色以以便便于于观观察察如如Hb、印印度度黑黑墨墨水水）通通过过实实际际测测量量求求出出.Vi可可由由gWr求求得得（g为为干干凝凝胶胶重重,单单位位为为克克,Wr为为凝凝胶胶的的吸吸水水量量以以ml/g表示）。表示）。Ve-VoKd=Vi（1）Kd=0时时,Ve=Vo,意意味味着着该该分分子子完完全全被被排排阻阻于于凝凝胶胶颗颗粒粒之之外外,全全部部分分布布于于流流动动相相里里,在在固固定定相相分布为分布为0,而而最先流出最先流出。（2）当当Kd=1时时,
19、Ve=Vo+Vi,意意味味着着该该分分子子完完全全不不被被排排阻阻,可可以以自自由由地地扩扩散散进进入入凝凝胶胶颗颗粒粒内内部部,它它能能均均等等地地分分布布在在流流动动相相和和固固定定相相里里,在在两两相相分分配配的比值为的比值为1,而而最后流出最后流出.（3）当当0Kd1现现象象说说明明凝凝胶胶对对组组分分有有吸吸附附作作用用,此此时时VeVo+Vi,例例如如一一些些芳芳香香族族化化合合物物的的洗洗脱脱体体积积远远远远超超出出理理论论计计算算的的最最大大值值,这这些些化化合合物物的的Kd1如如苯苯丙丙氨氨酸酸、酪酪氨氨酸酸和和色色氨氨酸。酸。因因此此分分子子的的正正常常Kd值值01之之间间
20、,这这种种由由小小到到大的大的Kd值顺序决定了物质流出的顺序值顺序决定了物质流出的顺序。Ve与与MW的关系的关系 对对同同一一类类型型的的化化合合物物,洗洗脱脱特特性性与与组组分分的的分分子子量量有有关关,流流过过凝凝胶胶柱柱时时,按按分分子子量量(MW)大大小小顺顺序序流流出出,MW大大的的走走在在前前面面,Ve与与MW的关系可用下式表示的关系可用下式表示:Ve=K1-K2lgMWK1K2为常数为常数,MW为分子量为分子量三三.凝胶层析的特点凝胶层析的特点 （一）优点（一）优点1.凝胶是一种不带电荷的惰性载体。其结凝胶是一种不带电荷的惰性载体。其结构稳定构稳定,所以凝胶所以凝胶本身不与样品发
21、生化本身不与样品发生化学反应。学反应。2.凝胶层析的凝胶层析的操作条件较温和操作条件较温和,不易引起生不易引起生物物质的变性物物质的变性,即使用来分离一些理化性即使用来分离一些理化性质不稳定的物质也很少被破坏。质不稳定的物质也很少被破坏。3.样品得率高样品得率高,重复性好重复性好.如果按比例扩大柱如果按比例扩大柱的体积和高度的体积和高度,可进行大量样品的分离纯可进行大量样品的分离纯化。化。（二）缺点（二）缺点1.要求要求样品和洗脱液的样品和洗脱液的粘度很低粘度很低。2.凝胶颗粒网络凝胶颗粒网络孔径大小非常有限孔径大小非常有限,所以可被所以可被纯化的物质的纯化的物质的分子量范围受到限制分子量范围
22、受到限制。3.凝胶结构凝胶结构对某些溶质分子具有吸附作用对某些溶质分子具有吸附作用,如如芳香族化合物与脂蛋白等。芳香族化合物与脂蛋白等。四四.凝胶的结构与性能凝胶的结构与性能1.葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶（商品名为（商品名为Sephadex）结构：结构：葡葡聚聚糖糖用用交交联联剂剂1-氯氯代代-2,3-环环丙丙烷烷使使葡葡聚聚糖糖之间通过醚键之间通过醚键(C-O-CH2-CH-CH2-O-)交联交联聚合而成的聚合而成的三维空间网状结构三维空间网状结构。OH特点：特点：Sephadex的的三三维维空空间间网网状状结结构构的的网网孔孔大大小小取取决决于于交交联联度度,交交联联度度的的大大小小可可在在合合
23、成成Sephadex时时控控制制加加入入交交联联剂剂的的百百分分比比决决定定.交交联联剂剂的的百百分分比比高高,交交联联度度大大,网网状状结结构构愈愈紧紧密密,孔孔隙隙愈愈小小,吸吸水水后后膨膨胀胀也也愈愈小小,机机械械强强度度高高,分分离离物物质质的的分分子子量量也也小小。反反之之,交交联联剂剂的的百百分分比比低低,分分离离物物质质的的分分子子量量大大。G类类Sephadex的的型型号号表表示示每每克克干干凝凝胶胶吸吸水水量量x10,如如G-50表表示示每每克克干干凝胶吸水量为凝胶吸水量为5ml。Sephadex的的化学性质稳定化学性质稳定,不溶于水、盐、弱酸和碱不溶于水、盐、弱酸和碱,耐热
24、耐碱不耐酸耐热耐碱不耐酸。2.琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶（商品名为（商品名为Sepharose)它它是是一一种种大大孔孔凝凝胶胶,其其工工作作范范围围的的下下限限几几乎乎是是Sephadex的的上上限限,可可分分离离MW40万万以以上上的的物物质质,因此可用来分离核酸及病毒。因此可用来分离核酸及病毒。琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶不不带带电电荷荷,不不受受微微生生物物作作用用而而降降解解,但但对对热热不不稳稳定定,易易受受pH影影响响(只只在在pH4.5-9.0范围内稳定范围内稳定.3.聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶使使用用范范围围及及效效果果同同葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶相相似似,但但化化学学性性质较葡聚糖稳定质较
25、葡聚糖稳定,可在可在pH2-11范围内使用范围内使用.聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶的的商商品品为为生生物物胶胶P（Bio-GelP），由由美美国国Bio-Rod厂厂生生产产，型型号号很很多多，从从P-2至至P-300共共10种种，P后后面面的的数数字字再再乘乘1000就相当于该凝胶的排阻限度。就相当于该凝胶的排阻限度。 4.凝胶的选择凝胶的选择选选择择何何种种凝凝胶胶以以及及它它的的型型号号,这这需需要要根根据据实实验验条条件件,溶溶质质的的分分子子量量的的大大小小和和分分离离工工作作的的目目的的而而定定,每每种种型型号号凝凝胶胶都都有有一一定定分分离离溶溶质质分分子子量量的的范范围围,选选择
26、择的的型型号号凝凝胶胶要要能能满满足实验要求。足实验要求。六六.其它条件选择其它条件选择1.柱的选择柱的选择层层析析的的长长度度（L）与与直直径径（D）之之比比（L/D）对对层层析析分分辨辨率率有有影影响响,一一般般对对用用于于组组别别分分离离的的层层析析柱柱其其L/D为为1518：1,层层析析柱柱的的体体积积一一般般大大于于样样品品体体积积的的410倍倍,这这类类常常用用于于脱脱盐盐.对对于于分分级级分分离离可可采采用用L/D40：1,甚甚至至100：1,层层析析柱柱体体积积一一般般大大于于样品体积的样品体积的25倍。倍。柱柱短短而而粗粗,则则易易使使样样品品稀稀释释,柱柱长长而而窄窄,则则
27、柱柱的的管管壁壁效应较大效应较大,会造成拖尾现象。会造成拖尾现象。2.样品的选择：样品的选择：量适当量适当,粘度小粘度小。3.洗脱液的选择：洗脱液的选择：每每种种样样品品分分离离所所用用的的缓缓冲冲洗洗脱脱液液应应根根据据使使样样品稳定品稳定的原则使用。的原则使用。七七.应用应用1.分离纯化分离纯化2.脱盐脱盐3.高分子溶液的浓缩高分子溶液的浓缩4.测分子量测分子量凝胶层析法分离蛋白质凝胶层析法分离蛋白质 原原理理 血血红红蛋蛋白白（Hb，分分子子量量64480左左右右）与与二二硝硝基基苯苯鱼鱼精精蛋蛋白白（DNP鱼鱼精精蛋蛋白白，分分子子量量200012000）混混合合物物，由由于于分分子子
28、大大小小不不同同，通通过过SephadexG50层层析析受受阻阻滞程度有差异，从而达到分离。滞程度有差异，从而达到分离。 器材器材 层析柱（层析柱（1.525ml）等等 试剂试剂 1.1.样品液：样品液：DNP-鱼精蛋白、鱼精蛋白、Hb2.SephadexG-50 操作操作 1. 1. 装柱：装柱：在层析柱的底部出口套上乳胶塑料在层析柱的底部出口套上乳胶塑料管，向层析柱内加蒸馏水赶走在层析柱的管，向层析柱内加蒸馏水赶走在层析柱的死体积和接口处的气泡，在蒸馏水高度约死体积和接口处的气泡，在蒸馏水高度约占体积的占体积的1/3时，关闭下端出口，自顶部缓时，关闭下端出口，自顶部缓缓加入已处理好的缓加入
29、已处理好的SephadexG-50悬液，待悬液，待底部凝胶沉积底部凝胶沉积12cm时，再打开出口，凝胶时，再打开出口，凝胶加至凝胶沉积离层析柱口约加至凝胶沉积离层析柱口约3cm即可。即可。装柱注意点：装柱注意点：不得有气泡和分层不得有气泡和分层；凝胶表面应平整凝胶表面应平整；柱床体积稳定；柱床体积稳定；不能让凝胶表面露出水面。不能让凝胶表面露出水面。2. 2. 加样：取样品液加样：取样品液5滴即为上柱样品。将出滴即为上柱样品。将出口打开，使表面的蒸馏水流出，直至恰好口打开，使表面的蒸馏水流出，直至恰好与表面相平（不可使床面干掉），关紧出与表面相平（不可使床面干掉），关紧出口，用滴管将上述样品缓
30、缓地加到床表面，口，用滴管将上述样品缓缓地加到床表面，注意尽量注意尽量不要使平整的床表面搅动不要使平整的床表面搅动，然后，然后打开出口，让样品进入床内，直至床面恰打开出口，让样品进入床内，直至床面恰好露出，用上法不断加蒸馏水洗涤好露出，用上法不断加蒸馏水洗涤，立即立即用试管收集，待红色流尽，换试管收集。用试管收集，待红色流尽，换试管收集。3. 3. 观观察察实实验验现现象象，并并计计算算Hb的的洗洗脱脱体体积积（Ve）和）和DNP- -鱼精蛋白的鱼精蛋白的Ve。4.4.再再生生 用用蒸蒸馏馏水水洗洗涤涤凝凝胶胶层层析析柱柱10 0分分钟钟，此柱即可再生。此柱即可再生。把菊根粉或白垩粉（把菊根粉
31、或白垩粉（CaCOCaCO3 3）装在玻璃管中，将植物叶子装在玻璃管中，将植物叶子的石油醚提取液倒入管中，的石油醚提取液倒入管中，然后加入石油醚淋洗。随着然后加入石油醚淋洗。随着淋洗进行，样品中各种色素淋洗进行，样品中各种色素向下移动的速度不同，逐渐向下移动的速度不同，逐渐形成一圈圈的连续色带。形成一圈圈的连续色带。茨茨维特维特在当时的实验中观察到在当时的实验中观察到6 6个色带，它们分别是胡萝卜个色带，它们分别是胡萝卜素、叶黄素和叶绿素素、叶黄素和叶绿素A A和和B B。提取液色带ChromatographiccolumnStationaryphaseMobilephaseoreluent Themobile(top)andstationary(bottom)phasesincolumnchromatography. Paperchromatographyisananalyticalmethod.Notetheverysmallsamplevolumespottedontotheplate.
