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1、镇痛药理研究实验方法周玖瑶药理学教研室疼痛的生理、病理和药学当代疼痛学之所以能够发展，最重要的是得益于外周和中枢神经系统结构与功能可塑性变化概念的引入，从分子到脑功能全面地揭示病理痛信息跨突触、跨膜和胞内信号转导机制奠定了理论基础，为临床寻找高效、低毒、全安的镇痛药提供了导向。镇痛发展简史回顾(一)中医对痛的认识痛为临床的常见症状，是疾病发展到一定时期的表现，又是人体神经抗御外邪自护自调的一种反应，身体的某一部受损，最终表现疼痛。中医理论认为,“不通则痛”和“不荣则痛”则是一切疼痛发生的病理基础。中医理论认为：“诸病皆因于气”。即一切痛的产生都由于气机被干扰素问举痛论云：“经脉流行不止，环周不
2、休。寒气入经则稽迟，泣而不行，客于脉外则血少，客于脉中则气不通，故卒然而痛”。不通则痛”具体的病因病机又可与下面因素有关。寒邪凝滞，阳气不达，气血不畅，经气闭阻则可致疼痛的发生。内经认为“寒邪入经二稽迟，泣而不行，客于脉中则气不通，故卒然而痛脉寒则缩卷，缩卷则绌急，则外引小络，故卒然而痛.”，疼痛或缓或急，常有冷感，痛有定处，得温痛减，或喜按，遇寒加剧瘀血内阻每致络脉不通，不通则痛。津不生血反为滞更加阻滞气运行与生成，形成肿胀而痛，气血瘀滞，脉搏道失荣，真气难通，瘀血阻碍滞，脏虚腹实，气血运行失常其常规，久病入络，血液污秽，成毒败血，损伤脉络而痛。痛如针刺，痛有定处，拒按，夜间痛甚。气机郁滞而
3、致的疼痛。疼痛性质多为胀痛，痛无定处，遇情志刺激加重。热毒内蕴，腑气不通，六腑以通为用，以降为顺，如腑气通降失常，梗阻不通则产生疼痛，痛势较剧，呈热痛，得冷稍减。痰浊阻滞脏腑经络或结聚四肢百骸，经气不利而致的痛，疼痛多为钝痛、隐痛、胀痛、木痛等。“不荣则痛”正气不足，气血津液亏虚，脏腑经络失养而致“不荣则痛”。素问举痛论：“寒气客于五藏，厥逆上泄，阴气竭，阳气未入，故卒然而痛”。灵枢阴阳二十五人：“血气皆少则喜转筋，踵下痛”。灵枢五癃津液别：“阴阳不和，则使液溢而下流于阴，髓液皆减而下，下过度则虚，虚故腰背痛而胫酸。”明确提出了虚可致痛的观点。卫生宝鉴:“清阳之气愈亏损，不能上荣.所以头苦痛”
4、。质疑录：“肝血不足则为筋挛.为目眩，为头痛，为胁肋痛。为少腹痛，为疝痛诸证，凡此皆肝血不荣也”。一般而言，虚证常有寒化或热化之趋势，故除疼痛外，尚可兼有虚热或虚寒的相应征象。“不荣则痛”表现为隐隐作痛，绵绵不休，疲劳即剧，时作时止。中医理论认为，心主神明。疼痛是一种感觉,一切疼痛又必须在“神”的参与下才能产生。素问灵台秘典论云：“心者，君主之官，神明出焉。”灵枢本神云：“所以任物者谓之心”。内经强调：“刺肉无伤脉，脉伤则内动心”。疼痛的定义国际疼痛学会（InternationalAssociationfortheStudyofPain,IASP）“疼痛是与实际或潜在的组织损伤相关联的不愉快的
5、感觉和情感体验，或用组织损伤这类词汇所描述的主诉症状”,“无交流能力决不能否定一个个体正有痛体验和需要适当缓解疼痛治疗的可能性”。疼痛应包括“痛知觉”（painperception），和“难受的”(unpleasant)的情感反应。包含机体内在的主观的、个人的、多维的体验,它涉及心理、行为、情感、认知和感觉等内容。疼痛的的生物学息义疼痛是所有动物共有的感觉,并与人感觉相似。疼痛也是每个人一生中体验最早、最多的主观感觉,像一把峰刃的双面刀，是机体和内脏受到伤害性刺激、侵害的保护性警报信号。生理性疼痛是生存必需的警报系统病理性疼痛是妨碍生存的一种疾病,它提醒患者需要医疗帮助，去看医生，获得治疗,早
6、期治疗有助于急性疾病和组织损伤保持稳态,启动复杂的体液反应,避免病变化过度或过分延长，减少患者死亡率,从而使人们躲避危险、确保人体健康。因此,疼痛是作为保护人和生物体正常生存必不可少的防御系统,是生命不可缺少的一种特殊保护性机制(功能),具有积极的生物学作用。镇痛的目的意义严重的疼痛能引起休克或引起人体各个系统功能失调、免疫功能低下而诱发各种并发症,甚者引发终身致痛性残疾或危及病人的生命。及时施用镇痛法能有效地缓解、减轻、控制和治疗疼痛,预防剧烈疼痛诱发机体休克等症状的发生所造成对机体的严重伤害,有效地保护机体、促使疾病的康复。与疼痛相关的术语1.感觉阈受试者首次感觉到有刺感、温热感的最小刺激
7、量。2.痛阈（painthreshold）受试者首次能够识别引起痛觉的最小刺激量。在人的心理物理或动物实验研究中，为了检测痛阈或伤害性反应阈值，以能识别50%的刺激为痛刺激的强度定为阈值或将能引起伤害性反应的50%的刺激强度定为伤害性反应阈值。3.痛耐受水平（paintolerancelevel）是指受试者能够忍受痛的最高水平，与痛阈一样，也可用刺激强度测量，但不代表刺激强度。4.镇痛或无痛（analgesia）是指在机体正常或病理状况下，痛刺激不能够引起痛及痛反应。5.麻醉性镇痛药指药物通过阻断中枢神经系统(CNS)痛觉冲动的突触传递镇痛的镇痛药。6.解热镇痛药:指药物通过阻断外周痛觉感受器
8、产生痛觉冲动而发挥镇痛作用的药物。7.内脏痛(visceralpain)是由内脏器官障碍所引发的,它包括由于阻塞或肿瘤所致的扩张、缺血、炎症及肠系膜的牵拉等,能引起联合症状,如发热、恶心、不适和疼痛。内脏痛觉是因感觉传入神经刺激内脏器官活动的结果。临床上极为普遍的症状，常伴有情绪反应和防御反应。8.烧灼痛（causalgia）特指在外周神经创伤性损伤后发生的一种持续的烧灼样自发痛、痛敏和异常痛敏等症状，并伴有萎缩、血管运动和汗腺分泌功能障碍等植物神经功能紊乱症状。9.牵涉性痛（referredpain）是内脏关联痛的重要特征之一，以胸腹盆腔内脏器官病变为原因而发生的内脏痛常常在远离痛因部位的某
9、躯体部位而被感知，这种非痛因部位的躯体痛被称之为牵涉痛。牵涉痛只发生在接受传导内脏痛冲动的传入纤维所进入的脊髓后根所支配的躯体部位。10.纤维肌痛(FM)指非骨关节的广泛平滑肌痛，并有触痛点。美国风湿学会拟订的诊断要点为：身体两侧广泛痛(腰或腰以上的中轴线骨骼肌痛)超过3个月，T双侧触痛，可能伴有头痛、抑郁、焦虑、刺激性排便、自主神经功能紊乱、神经内分泌改变等。11.复合性局部疼痛症候群(CRPS型)，旧称反射性交感神经营养不良实为创伤后疼痛症候群，表现为持续痛，有时有刺蜇痛,亦有书将其分为：炎症性疼痛、神经性疼痛、血源性疼痛、代谢性疼痛、免疫源性疼痛、心理性疼痛。其中炎症性疼痛是慢性痛中最常
10、见的原因之一，可表现为长期的酸痛，隐痛或定期及不定期的发作痛，有时可有明确的定位疼痛，有时则缺乏。12.炎症炎症是“各种内源性、外源性刺激引起细胞损伤,同时引起伴有血管反应的结缔组织的复合性反应”。依据炎症持续时间,分为急性炎症和慢性炎症。前者通常病程为数天，以渗出液反应（蛋白成分多的细胞外液浸润）和中性粒细胞反应主。后者的细胞成分以淋巴细胞和巨噬细胞为主，伴有组织坏死或组织修复环节之一的纤维化反应,病程趋亍复杂。其主要是以“病情经过”来定义,疾病表现趋于多样化。13.炎症疼痛:组织炎症或造型引起的炎症模型均可引发痛阈敏化,产生疼痛,引起炎性疼痛。与疼痛有着密切相关,炎性疼痛,是由于炎症引起组
11、织肿胀、炎性渗出物压迫神经纤维末梢和强致痛性的致炎性介质释放直接作用于神经末梢。如缓激肽、5-HT、前列腺素等能敏化伤害性感受器而诱发痛过敏(1),大鼠后肢足跖中部皮下注射角叉菜胶造成炎症痛过敏(2),链脲佐菌素诱发大鼠糖尿病性神经痛模型,其行为伤害性痛阈值明显降低,表明糖尿病大鼠处于痛过敏状态。14.痛敏(或痛觉过敏)hyperalgesia(或hyperesthesia）是指在组织或神经损伤后，正常情况下,一定阈上痛刺激强度在损伤部位或损伤以外部位引起更强的疼痛。或对伤害性刺激产生过强的疼痛反应。痛敏分为原发性痛敏（primaryhyperalgesia）和继发性痛敏（secondaryh
12、yperalgesia）痛敏只是感觉强度上的量变，但无感觉模式上的质变。痛敏可能是外周和中枢神经系统结构或功能改变的结果。15.痛觉超敏或称痛性感觉异常（allodynia）是指在组织或神经损伤后，正常情况下不引起痛的刺激，或指在非伤害性刺激作用下产生痛觉。如触刺激、轻压刺激、非伤害性冷或热刺激，能在损伤或损伤以外部位引起痛。异常痛敏与痛敏不同，它在刺激-感觉模式上发生了“质变”，已失去了感觉模式的特异性。痛敏只是感觉强度上的量变，但无感觉模式上的质变。16.中枢性疼痛(centralpain,CP)是指由于中枢神经系统本身伤病所造成的自发痛和对于外加刺激的过度疼痛反应,包括一种不愉快的触物感
13、痛(dysaesthesia)。17.自发痛(spontancouspain)指在没有可见的刺激条件下产生的痛觉。18.神经痛（neuralgia）是指疼痛沿着单根或多根外周神经分布或放散。而神经痛的使用较广泛。19.神经痛常由创伤或疾病所致的神经根、神经节、祌经丛、祌经干或其分支的原发或继发性损害引起的异常疼痛。多见于颈肩腰腿痛等病证。是一种临床常见的慢性痛。或是指疼痛沿着单根或多根外周神经分布或放散。神经痛的使用较广泛。20.神经炎（neuritis）是指外周单根或多根神经炎症。只有在确定炎症时才使用神经炎。是指疼痛沿着单根或多根外周神经分布或放散；只有在确定炎症时才使用神经炎。而神经痛的
14、使用较广泛。21.神经源性痛（neurogenicpain）是指由中枢或外周神经原发性损伤、功能障碍或一过性激惹而引起的疼痛。22.伤害性痛（nociceptivepain）是在机体组织损伤或向机体施加具有造成组织损伤潜在性的伤害性刺激时所发生的一种疼痛。有生理性伤害性疼痛（physiologicalpain）、非生理性或称病理性疼痛（pathologicalpain）。分为躯体性疼痛（somaticpain）和内脏性疼痛（visceralpain）。躯体性疼痛有皮肤、黏膜部位的表浅痛（superficialpain）和骨骼肌、骨骼及关节等部位的深部痛（deeppain）。22.神经源性疼痛（
15、neurogenicpain）是由于中枢或外周神经原发性损伤、功能障碍或一过性激惹而引起的疼痛(综合症),包括自发痛和诱发痛。23.神经病理性痛（neuropathicpain）又称神经性疼痛系指中枢或外周神经组织自身受损伤或炎性病变引起的疼痛感觉系统功能异常所引起的伴随性疼痛和神经系统激惹一过性异常兴奋所产生的持续性的慢性疼痛，疼痛常在损伤后一段时间发生，伴有感觉异常。或泛指由神经系统原发性损伤或功能障碍所引起的疼痛。24.精神源性痛（painofpsychologicalorigin）是在机体无任何病理性异常时所表现的一种疼痛。它包括由精神妄想（delusion）或幻想（hallucina
16、tion）、癔病（hysteria）、转换（conversion，指由情绪转换为躯体症状的过程）、疑病症（hypochondriasis）或抑郁症（depression）等精神性疾患所引起的疼痛。25.周围神经病理性疼痛(多发性神经病痛)因小神经纤维受累所致，见于糖尿病、血管炎、AIDS、尿毒症、毒物和药物中毒，以及淀粉样变性。26.交感祌经依赖性疼痛(SMP)和交感祌经非依赖性疼痛(SIP)前者指如果交感神经阻断后疼痛减轻,而后者指若始疼痛不减轻。27.脊髓刺激(spinalcordstimulation,SCS)指通过放置硬膜外隙电极,提供电刺激作用于脊髓后根。镇痛药常用给药途径应采用拟推
17、荐临床应用的给药途径。给药途径一般采用二种,其中一种应与临床相同。如确有困难可采用其他给药途径,但应说明困难的原和选用其他给药途径的理由。溶解性好的药物,可注射给药,但要排除非特异性反应。粗制剂或溶解性差的药物,可使用单一的给药途径。注射给药或离体实验时应考虑到样品中杂质、不溶解始质、无机离子及PH浓度等因素对实验的干扰。镇痛的常用给药途径动物实验常用肌内给药、腹腔内注射、关节内注射、口服给药、皮下给药、皮肤给药、粘膜给药、脑室给药、脑内神经核团给药、脑脊腔内给药、鞘内注射给药、蛛网膜下腔注射给药、经皮给药、经粘膜给药等以评价其药效及其作用机制、毒性。(一)小鼠侧脑室注射给药小鼠。剪去小鼠头部
18、毛,消毒皮肤,在头頂部注射部位剪去直径约0.8cm皮肤。将小鼠头腹位固定,用微量注射器,于小鼠头部两耳连线与矢状缝交点的左右前外各2mm进针,深度约2min,约10s内注射完,停针1min出针,用胶尼封口。一次注射量10l。给药10minip1%醋酸溶液,观察记录15min小鼠扭体次数,计算小鼠扭体抑制%,求出icvID50。试验前进行预测,注射1%伊文氏蓝注入脑室注即刻处死小鼠,剖检观察伊文氏蓝是否进入脑室,以确定注射部住,以后按照此坐标定位给药。(二)大鼠侧脑室注射给药大鼠乙醚麻醉后,固定于脑立体定位仪上。剪去头部毛,切开皮肤,暴露颅骨。剥离附着在颅骨的组织,用脱脂酒精棉球擦干颅骨,在矢状
19、缝外2mm,冠状缝后2mm两平行线交点,用钻头打一个小孔,用固定于立体定位仪的微量注射器垂直植入孔内4mm,每次注入不超过20ul/只,注射毕,停针20秒出针,用速凝牙托粉封口,15分进行测痛。多次给药,可植入导管,用螺丝或速凝牙托粉浇注固定,术后45天进行实验。取合格大鼠,随机分组。(三)家兔侧脑室注射给药成年家兔,雌雄不拘。剪去手术野毛,碘酒、酒精消毒,于局部麻醉下,在冠状缝离中线4mm处钻孔,然后将一特制的家兔脑室套管(塑料)插入脑室,使套管的尖端位于侧脑室,并固定于颅骨上。(四)脑内神经核团给药(五)鞘内注射给药(六)蛛网膜下腔注射给药(七)经皮给药(八)经粘膜给药一、小鼠扭体试验(w
20、rithingtest)【原理】把一定容量和浓度的化学刺激物质(醋酸溶液等)或盐水注入小鼠腹腔内,由于刺激脏层和壁层腹膜,引起深的、大面积而持久的疼痛刺激，引起深部广泛的腹膜炎造成腹壁肌肉紧张、炎性疼痛,致使小鼠出现典型的腹部肌肉收缩，同时伴有一侧后肢外伸的躯体伸缩行为。即腹部内凹、躯干与后肢伸张、臂部高起,身体扭曲等特征性的行为反应,称之为扭体反应(writhingresponse)(图20-2-1)。潜伏期为35分钟,以注射醋酸溶液后15分钟内出现扭体反应频率为高。醋酸诱发广泛的腹膜炎造成腹壁肌肉紧张有躯体痛的参与而导致的。醋酸所引起的伤害性反应,可能由于腹腔PH值降低而直接刺激伤害性传入
21、神经纤维和促进炎症递质合成引起的炎症和疼痛,共同起作用。随机分为对照组、广西血竭组、吗啡组。每组20只。对照组、广西血竭组灌胃给药、每天一次,连读5天,于末次给药后60分,吗啡组一次腹腔注射30分钟后，腹腔注射1醋酸溶液10mlkg后,观察记录注射醋酸溶液后20分内出现扭体反应鼠数和扭体次数作为疼痛反应指标。并计算其均值、抑制扭体反应次数百分率(抑制%)对照组扭体次数均值药物组扭体次数均值抑制%=-X100%对照组扭体次数均值广西血竭对小鼠醋酸扭体反应的影响(xs,n=20)组别组别剂量剂量(g/kg)扭体动物数扭体动物数(%)扭体次数扭体次数对照组对照组20 (100%)20 (100%)4
22、2.60 42.60 11.4 11.4广西血竭组广西血竭组 14.414.420 (100%)20 (100%)26.40 26.40 14.5*14.5*吗啡组吗啡组0.0050.005 3 (15%) 3 (15%) 0.20 0.20 0.02 0.02*对照组对照组 20 (100%)20 (100%)39.10 39.10 12.8 12.8广西血竭组广西血竭组7.27.220 (100%)20 (100%)26.40 26.40 14.5*14.5*吗啡组吗啡组0.0050.0053 (15%)3 (15%)0.20 0.20 0.02 0.02*注意事项1.扭体试验又称为扭动试
23、验、腹部收缩试验。可应用多种动物，以小鼠和大鼠最佳。2.己证明多种物质腹腔注射可诱发小鼠扭体反应。但应用最普遍的是醋酸溶液3.Schmauss7提出了一个行为学评分标准，将扭体行为分为03四个等级,根据这个评分标准可以把行为学量化。因此，这种模型也成为评定其它模型的一个对照标准。4.腹腔注射生理盐水可诱发小鼠(4%)、大鼠扭体(6%)反应,应注意。5.常用小鼠，亦用大鼠（费用高）小鼠扭体反应诱发剂种类诱发剂名称浓度(%)用量(ml/只)醋酸溶液0.60.90.2(小鼠)0.52.5(大鼠)酒石酸锑钾溶液0.050.2苯醌水溶液(饱和溶液)0.020.2缓激肽溶液0.001250.22-苯-1,
24、4-苯甲酰苯醌(含有5%酒精水溶液)0.020.20.02%苯醌混悬于1%羧甲基纤维素溶液0.25PgE131.6ug乌头碱、乙酰胆碱、高岭土混悬液、酵母多糖溶液、五羟色胺、硫酸镁等。5. 醋酸浓度为11时小鼠扭体最明显，注射后35分钟小鼠出现明显的扭体反应。酸浓度为03，不出现扭体反应，醋酸浓度为 19时，小鼠活动减少。室温在2022扭体反应最典型, l6时小鼠扭体反应不稳定，28时小鼠活动减少8。 6.诱发剂浓度及用量应通过预试验确定。7.酒石酸锑钾溶液务必于临用时新配, 放久效用减弱。8.对照组小鼠扭体反应次数, 一般在控制在2530次为宜。【评价】1.小鼠扭体法是筛选镇痛药的常用方法之
25、一,尢其是弱镇痛药的一种常规筛选试验方法。适合于中枢和外周镇痛药的筛选研究,尤其用于外周镇痛药的评价。其试验的作用强度和临床镇痛效果具有明显的相关性。2.观察记录药物抑制小鼠扭体鼠数或扭体次数,以出现扭体鼠为阳性,不出现扭体鼠为阴性,计算其ED50,评价药效作用强度。所反应药效作用前者强,后者弱。3.己被许多学者所采用的一种操作简单、敏感、方便、重复性好、经济实惠的实验方法。4.扭体反应代表内脏痛(紧张性病理性疼痛),亦是应用最为广泛的内脏痛模型之一。无刺激特异性。方法缺乏特异性,一些非镇痛药,如中枢抑制剂、阿托品、利多卡因等有抑制扭体反应,出现假阳性(应结合其他测痛方法),约有8的动物不出现
26、扭体反应，而且不能在同一个动物上观察药物的时效作用。家兔K离子皮下透入致痛实验(K+paintest)【原理】正常情况下，细胞膜内外K+浓度相差极大。局部组织受损时，组织释放的K+为一种致痛物质。当K+浓达到1015mmol/L时即可致痛。由于输入电流强度与K透入及其引起的疼痛反应呈正比，给药后电流强度的变化直接反映受试药物镇痛作用强弱。当在一定强度直流电场作用下，饱和氯化钾溶液可以经不同部位皮肤透入动物体内产生伤害性刺激，引起动物疼痛反应，以家兔缩腿，摇头，挣扎、扬爪等反应作为痛阈指标,观察受试药物对家兔痛阈的影响。当给药后,家兔上述反应消失或减弱。表明受试药具有镇痛效应。方法选用体重1.5
27、2.0公斤家兔，雌雄不拘家兔置于固定器中。除去左耳尖部位毛。将浸泡饱和氯化钾溶液的棉球置于耳尖部，把K-4型测痛仪的刺激电极置于棉球上并固定好，保持湿润状态。无关电极为针状电极，插入后腿，并用生理盐水湿润纱布盖上。以引起家兔摇头或全身挣扎反应作为疼痛反应指标，记录从通电开始至引起家兔痛反应的电流强度（mA数）作为痛阈值。给药前测定痛阈二次，取其mA数均值作为基础痛阈值。给药后60分测痛，每10分钟测痛一次，观察2小时,计算给药后痛阈值提高百分率，与对照比较,检验组间电流强度显著性差异。必要时可测定其ED50值。大鼠法:测痛仪的输出电极(正极)于尾部下13处用乳胶管固定,无关电极用盐水纱布固定于
28、尾根部，以甩尾(嘶叫、全身挣扎等)反应作为疼痛反应指标,记录甩尾的电流强度(mA)作为嘶叫和运动痛阈，并计算出镇痛指数。由于阈电流增加反映镇痛药效应强度和有效时程,与对照组比较,阈电流增长2倍以上可认为药有镇痛作用,或计算其ED50值。若痛阈测定用固定电流强度,记录动物痛反应时间作为痛阈值,计算PMAP,以给药后痛阈值超过基础痛阈一倍为100%镇痛。猴实验以缩腿、挣扎为疼痛反应指标价昂贵,不宜用于药物筛选【评价】本方法采用K+-4型测痛仪测痛,输入电流强度与K透入及其引起的痛反应呈正比,阈电流增减反映药物镇痛作用强弱,并可以同时观察其作用时程。操作方便，灵活、反应指标明确,直观记录，能准确测定
29、痛阈值,结果重现性好,为常用测痛方法之一。广泛用于研究镇痛药的效价强度和作用时程。为了进一步了解药物作用方式并找到更适于人的治疗量,在一种新化合物试用于临床前还需要用猴进行实验。【注意事项】1.实验必须在12hL/12hD光周期的恒温(2226oC)、恒湿、安静的光控实验室进行,实验前7天将动物置于光控室饲养。2.每次实验必须在同一时间进行。3.安放电极耳尖部位必须脱毛,电极必须固定牢，并经常用生理盐水保持湿润状态。4.输入电压必须稳定。5.为了避免损伤，规定最强的电流为10mA为限。小鼠光辐射热甩尾法(tail-flicktest)【原理】小鼠光辐射热甩尾法也叫光热甩尾或光照甩尾。是将一束光
30、照射到动物尾根1/3处,使鼠尾局部升温,产生热刺激,当其尾部受到伤害性刺激超过动物忍耐的痛阈时,动物出现明显甩尾的躲避反应,是一种脊髓的屈曲反射。光辐射热甩尾是急性伤害性知觉疼痛的测痛方法,反应体表痛,疼痛持续的时间长短不。以动物甩尾作为痛反应指标,记录动物自光照射开始到甩尾反应的时间(潜伏期)作为疼痛阈值。根据动物痛阈值高低变化来判断药物的镇痛效应。方法小鼠,雌雄兼用,体重18-22g。实验前12小时禁食,不禁水。把小鼠装入小鼠固定筒内。尾部暴露于外，实验前先用75%乙醇檫净鼠尾，用黑墨汁涂于尾根部下1/3处作为光刺激点的标记。测痛时，使小鼠尾光刺激点与YLS-12A鼠尾光照测痛仪聚光灯灯孔
31、重合,待动物安静后进行测痛，以鼠尾受热刺激出现甩尾作为疼痛反应指标。记录小鼠从开始光照射到甩尾反应的潜伏期（TFL,s）作为痛阈值。预选基础痛阈57秒小鼠供实验用。取合格小鼠随机分为对照组、OT-05B组(26g、18g/kg)、吗啡组(阳性药组,5mg/kg)。每组10只。各组给药前连续测痛2次，取其均值作为给药前基础痛阈值。各组肌肉注射给药后45分测痛,计算其均值及痛阈提高百分率,痛阈提高率%。给药后TFL一基础TFL痛阈提高率%=-X100%基础TFL,与对照组比较,检验其组间显著性差异。.对小鼠辐射热甩尾痛阈值的影响组 别剂 量(X/kg)动物数药前痛阈值(s)药后痛阈值(s)痛阈提高
32、%对照116.80.87.10.6OT-05B18g127.30.97.91.48.2吗啡5mg137.10.613.91.5*95.8对照147.00.67.20.8Te-05B26g136.61.08.31.0*22.7【评价】1.热刺激引起的疼痛与生长抑素有关。光辐射热甩尾法试验,是防御性的反射，主要在脊髓水平进行整合。是一种脊髓的屈曲反射,反应体表痛。可以测定轻度麻醉的动物而不受动物运动协调性的影响。在实验观察中,动物的跑反应是大脑控制的复杂现象。甩尾法比热板法具有优越性。但必须引起注意,本法纯粹是一种脊髓反射,骨骼肌松弛药可能呈阳性结果。2.适用于筛选麻醉性镇痛药,但对弱镇痛药,如阿
33、斯匹林则出现阴性结果。3.光辐射热甩尾法试验,终点指标直观、明确,记录潜伏期准确。设备简单、操作方便,故常用。4.甩尾反射法只能检测简单伤害性反射，而不能对动物意识性或目的性的反应进行客观检测。甩尾实验最终的行为反应也较为复杂（如舔其后爪）。5.使用动物有小鼠、大鼠、,免或豚鼠。常用小鼠或大鼠,以甩尾潜伏期为痛反应指标。小鼠易得,经济、便于操作。大鼠每组不少于5只。免照射鼻部或嘴角,以引起甩头潜伏期为痛反应指标,每次照射不超过30秒。当给药后痛阈值提高大于基础痛阈值的200%,停止照射,以200%作为最大值。豚鼠照射背部皮肤,以皮肤或肌肉抽搐颤动为痛反指标。【注意事项】1.试验必须在标准等级实
34、验动物室进行,确保实验环境条件的恒定性。确保实验结果的的可靠性、重现性。2.实验程序化,分组应注意体重、组间痛阈值的均匀性、试验时间的一致性(避免时辰差异对实验结果的影响)。3.控制刺激强度(光辐射热),刺激强度应经过预测,强度适当,用药前的基础痛阈值非常重要,刺激时间不宜大长,测定次数不宜大多,避免烫伤尾巴,影响实验结果。4.为了确保光照射点的一致性,应用黑墨汁涂于尾端1/3处作为光刺激点的标记。同时增加吸热度。测痛时，必须使小鼠光刺激点与光热测痛仪聚光灯灯孔重合,并待动物安静后进行。5.鼠尾表面积大,易散热,尾温度可能会影响实验结果,室温对甩尾潜伏期有明显的影响,容易造成假阳性或假阴性,室
35、温一般为2022oC。冷板诱发的痛觉超敏冷板诱发的痛觉超敏【原理】利用4金属冷板作为刺激，诱发病理性痛模型动物出现以抬爪为主要表现的痛觉超敏（allodynia）现象，给药后抬爪次数的变化可直接反映受试药物镇痛作用的强弱。.L5/L6脊神经结扎模型小鼠的建立：选用8周龄雄性C57BL/6小鼠，在乌来糖（1200mg/kg,腹腔注射）的麻醉下手术分离并结扎小鼠右侧L5和L6脊神经制备坐骨神经病理性痛模型小鼠。恢复两周后进行模型筛选，凡是4金属冷板刺激引起的小鼠5分钟抬足次数大于10次可视为动物模型合格，可用于进一步的实验实验分组：将制备好的坐骨神经痛模型小鼠随机分为盐水对照组，1.0106U/k
36、g干扰素-注射组，2.5106U/kg干扰素-注射组和5.0106U/kg干扰素-注射组。模型小鼠疼痛行为学测定：将小鼠放在表面温度为41的金属冷板上，并罩在一个有机玻璃方盒或玻璃烧杯下，稳定5分钟，待小鼠探究活动基本消失后，利用手控计数器单盲法记录小鼠损伤侧脚掌5分钟内的抬足次数作为基础痛阈，动物因活动或体位变化所引起的抬足不计入内。然后将生理盐水或干扰素-一次腹腔注射给药后15分钟开始测痛，每隔15分钟测痛一次，观察90分钟。【评价】本方法将实验动物放在可以自由活动的环境下进行研究，最大限度地减少了人为因素给动物造成的压力，且操作简便，反应指标明确，可以准确地反映动物的痛觉行为。为常用测痛
37、方法之一，广泛用于研究痛觉行为异常、针刺镇痛以及药物对炎性痛和神经病理性痛的镇痛作用。该方法也可通过测量动物脚掌在空中的停留时间作为痛觉超敏指标，空中停留时间越短说明动物痛阈越高，空中停留时间越长说明动物痛阈越低。比较给药前后动物脚掌在空中停留时间的变化可判定药物的镇痛作用。此外，也可利用0-4冷水代替冷板进行测定。在直径20cm的玻璃容器中放入，深度约2cm左右的0-4冷水，将大鼠放入容器中，5分钟后记录大鼠在冷水中的抬足次数，记录时间为5分钟。【注意事项】实验必须在恒温(2226)、恒湿、安静的隔音实验室进行。每次实验在8:00-18:00进行，且最好保持在每天的同一时间段进行。实验前3天
38、开始对测试动物进行冷板刺激，每天1次，每次10分钟，使动物适应测试平台并诱发稳定的痛觉超敏。由于4是一种非伤害性刺激，很少引起正常大鼠的抬足反应，因此该方法一般不以正常动物作为研究镇痛药物的受试动物。此外，一些神经病理性痛动物模型，如坐骨神经部分结扎模型等，往往不表现冷诱发的痛觉超敏现象，所以在利用这些模型研究镇痛药物的作用时也不宜采用此方法。丙酮诱发的痛觉超敏丙酮诱发的痛觉超敏【原理】利用丙酮挥发过程吸收热量引起的冷刺激，诱发动物出现以缩足反应为主要表现的疼痛反应，给药后缩足反应次数或潜伏期的变化可直接反映受试药物镇痛作用强弱。方法1L5/L6脊神经结扎模型大鼠的建立：依据Kim和Chung
39、报道的方法。2实验分组：将制备好的L5/L6脊神经结扎痛模型大鼠随机分为盐水对照组，2.5mg/kg吗啡注射组，5.0mg/kg吗啡注射组和10mg/kg吗啡注射组。3模型大鼠疼痛行为学测定：将模型大鼠放在金属网架上，并罩在一个有机玻璃方盒内，适应20分钟后，利用连接有聚乙烯细管的注射器向模型大鼠脚跟滴一滴丙酮溶液（约20微升），观察模型大鼠是否出现缩足反应。连续测量五次（时间间隔为2分钟），如果模型大鼠出现缩足反应的次数超过三次，则认为该动物出现了明显的冷诱发的痛觉超敏，以缩足反应的次数作为基础阈值。然后将吗啡一次皮下注射给药后30分钟开始测痛，每30分钟测痛一次，观察4小时。【评价】本方法
40、采用丙酮诱发的缩足反应测痛，反应指标明确，可直观记录，为常用测痛方法之一，广泛用于研究各种镇痛药物的效价强度和作用时程，以及药物对炎性痛、癌性痛和神经病理性痛的镇痛作用研究。由于该方法每个时间点一般需多次重复测量，操作起来相对较复杂。此外，该方法也可通过记录动物出现缩足反应的潜伏期作为痛觉超敏指标，测定5次取其平均值。【注意事项】实验应在室温(201)、恒湿、安静的隔音实验室进行。每次实验在8:00-18:00进行，且最好保持在每天的同一时间段进行。向动物脚掌滴加丙酮时注意不能触到动物脚掌，以免人为引起缩足反应。如果同时进行双侧脚掌的痛阈测定，应首先测定损伤对侧脚掌。冷诱发的甩尾反射冷诱发的甩
41、尾反射【原理】利用冷水浸尾诱发动物出现以甩尾反射为主要表现的疼痛反应，给药后痛阈的变化可直接反映受试药物镇痛作用强弱。模型大鼠疼痛行为学测定首先将各组模型大鼠尾巴浸入0冰水中（5cm），记录大鼠出现甩尾反射的潜伏期，重复测定3次（时间间隔为15秒钟），取其平均值作为基础痛阈。将药物一次鞘内注射给药后55分钟测定其甩尾反射的潜伏期。【评价】本方法采用0冰水诱发的甩尾反射进行测痛，操作简便，无须特殊设备，反应指标明确，结果重现性好，为常用测痛方法之一，广泛用于针刺镇痛以及阿片类镇痛药物的效价强度和作用时程研究。【注意事项】实验必须在恒温(2226)、恒湿、安静的隔音实验室进行。每次实验在8:00-
42、18:00进行，且最好保持在每天的同一时间段进行。实验前3天开始对测试动物进行冷水浸尾刺激，每天1次，使动物适应测试环境。动物固定最好采用特制动物固定器，这样可以保证每次测试过程动物的固定强度一致，减少因手抓力量不同所导致的结果差异。每次实验最少重复三次，取其平均值。电刺激小鼠甩尾法【原理】应用恒定的电压或电流参数经皮肤或电极刺激鼠尾出现疼痛反应,是由于兴奋C纤维产生传入放电引起的疼痛反应。以小鼠受刺激后出现甩尾、嘶叫作为痛反应指标,记录其电压或电流参数作为疼痛阈值,根据给药前后痛阈的变化评价药物效应。分别将小鼠放入小鼠固定器中，每次刺激前均用75酒精擦洗鼠尾后，再用生理盐水棉球涂擦小鼠尾根刺
43、激区以增加皮肤导电性。实验时将刺激电极(BL一410生物机能实验系统)放置于小鼠的尾根部，进行刺激：以程控方式输出电刺激，刺激电压根据预实验从20V起，间隔2s以步幅1v递增刺激电压强度，至小鼠开始出现挣扎、甩尾或抖尾、撕叫等痛反应，此时的电压值为该鼠的痛阈值。先记录给药前小鼠出现痛反应的电压作为基础痛阈，随后各组小鼠分别灌胃给药1小时h后，将小鼠放入小鼠同定器中，按同法记录小鼠出现痛反应的刺激阈值电压,电刺激电压为35V为限，电压超过35V者均记为35V。按下式计算痛阈提高百分率。药后痛阈均值-药前痛阈均值痛阈提高百分率(%)=-100%药前痛阈均值芎附正天软胶囊对电刺激小鼠痛反应的电压阈值
44、的影响(xs,n=10)组别剂量(g/kg给药前电压(V)给药后电压(V)痛阈提高率(%)溶媒对照组PEG-40024.71.9526.02.875.3阿斯林肠溶片0.1523.21.8727.22.3917.2芎附正天软胶囊1.025.51.6529.13.41*14.1芎附正天软胶囊0.525.82.6629.53.63*14.3芎附正天软胶囊0.2524.91.6027.42.4110.0L1【评价】电刺激鼠尾-嘶叫法是对组织施加短暂的可逃避的伤害性刺激，造成一种时相性急性疼痛，称为急性实验痛。反映体表痛。疼痛持续的时间也长短不一。一般认为动物嘶叫的整合中枢涉及高位脑干(如中脑)，能反应
45、强、弱、镇痛药物的效应,但机体组织阻抗不易控制,敏感性不高,反应与动物的种族、品系、年龄、性别及基础阈值等因素有关。由于本法有反射性因素,临床无镇痛作用的药物可能呈阳性反应。不如机械刺激实验方法严谨。设备简单,痛反应指标明确,直观记录,方法可靠、重现性好。【注意事项】1.电刺激鼠尾致痛法个体差异较大,应预选合格小鼠供实验。于鼠尾刺激部位涂上薄层导电胶,以增加导电性能。2.电(方波)刺激是生理药理最常用的实验方法之一,而刺激仪功能的强弱、方波设定范围的宽窄、波形的好坏、使用方便与否往往是实验成败的关键。3.刺激参数文献报道不一。,必须经预试验确定最佳刺激参数。角叉菜胶诱发大鼠炎痛模型【原理】外周
46、伤害性信息传人可导致痛及痛过敏。大鼠右后掌足跖部皮下注射后角叉菜胶后，动物出现早期的痛反应和随后的痛觉过敏,表现为局部迅速肿胀，动物出现反复抬腿，舔足、摇动后掌，后掌抬离盒底等自发痛行为。随着炎症介质的释放，加强炎症,也增加对疼痛的敏感性，降低痛阈值，产生痛敏，对热刺激的耐受性下降等。表明射角叉菜胶后，动物出现了炎性痛与痛过敏。伴随这些行为变化及注射局部的炎症反应，从3小时开始可持续到24小时。局部炎症反应于24小时达高峰，之后自发痛行为自行消失。由此诱发大鼠炎痛模型，用于镇痛药的研究。【评价】注射角叉菜胶已用于制备多种组织炎症模型。角叉菜胶皮下注射后3-24小时，大鼠处于一种稳定的痛敏状态，
47、便于观察药效及作用时程。致炎大鼠分早期时相（2-6小时）和晚期时相（15-24小时）都表现为痛觉过敏。早期时相是由于周围敏感引起，而晚期时相是中枢敏感引起。早期时相和晚期时相比较明确，是研究炎症痛双时相常用模型。己用于镇痛药作用效应、中枢和外周镇痛药的评价研究。【注意事项】1.角叉菜胶稳定性强，在中性和碱性溶液中也很稳定，即使加热也不水解，但酸性溶液中比较容易发生酸水解作用,尤其是Ph4以下时。2.为了获得稳定、可靠的测定结果,实验室温在2025，环境安静,避免光线的干扰。调节辐射热强度,使之恒定于一定水平,基础痛阈在815秒，超过20秒终止照射,以避免损伤后脚掌皮肤组织。每次辐射热照射的部位
48、应保持一致(预先标定光斑落点范围)。间隔时间要相对恒定。福尔马林试验【原理】将福尔马林注射于大鼠后爪皮下，可提供一个持续的伤害性刺激，从而激发一种明显的、弥散的、长时间持续的痛行为反应，即回缩或震摇及舔咬注射足现象，可模拟人类损伤后疼痛的某些特征。将福尔马林溶液注射入大鼠一侧足底皮下后产生两个截然分开的疼痛时相，立即诱发出一持续0-5分钟的自发缩足反射期（第1相）、抬足和舔足行为反应，然后是15-20分钟的静止期（静止相），随后又出现20-40分钟的持续反应期（第2相），伤害性反射行为持续1小时左右停止。方法给药后,用微量注射器于小鼠后足底皮下注射2%福尔马林溶液6l/只，立即把小鼠放入离实验
49、台10cm高处玻璃板上的平底大烧杯，在烧杯下置一倾斜30度左右大镜子,从镜面上观察小鼠痛反应，以小鼠注射福尔马林后舔足反应作为痛反应指标(为福尔马林直接刺激神经引起的疼痛反应）。记录05分小鼠累积舔足反应时间作为痛阈值,计算其均值,与对照组比较，检验其组间显著性差异。OT-05B对小鼠福尔马林致痛阈值影响(xs)组别组别剂量剂量(g/kg)舔后足时间舔后足时间(s) 抑制镇痛抑制镇痛%对照对照69.6222.25Te- 05B18.661.0117.3714.1对照对照69.4915.06Te- 05B46.658.1412.71*16.55对照对照72.2514.40吗啡吗啡5mg/kg45
50、.5914.47*35.4【注意事项】1.福尔马林能导致机体组织炎症性持续性刺激,大鼠为10%0.0.05ml，但文献中报道皮下注射福马林浓度相差悬殊,低者0.5%,高者5%,甚至达15%。.小鼠痛觉模型浓度常用l5，该浓度下小鼠出现强烈的疼痛反应,0.025浓度小鼠呈现明显的痛反应,与生理盐水组相比有显著性差异。2.5，小鼠呈现强烈疼痛反应，并引起小鼠注射部位的组织损伤，加剧、延长痛反应。在小鼠福尔马林痛觉模型中，0.025是一个最适合、理想的致痛浓度，既能引起小鼠明显的痛反应，又不引起注射部位的组织损伤2.注射部:小鼠则将福尔马林溶液注射到脚底爪的中央皮下,大鼠可将福尔马林溶液注射到脚拇指
51、背上踝下方的皮下或前爪背面。 3.注射福尔马林后，立即将动物放回到容器内并开始记录疼痛第一期内大鼠总的后抓抽缩次数或小鼠的舔脚趾的总时间。大鼠福尔马林注射后30分即可开记录第二期的抽缩次数，一般计算20分；小鼠注射后1040分开始记录第二期。4.试验动物180220克,太大会渐迟钝。福尔马林注射不当或测痛方法不对都可造成实验结果的偏差，因此，应注意动物体重、注射程序和有效的测痛方法。辣椒素诱导疼痛动物模型【原理原理】辣椒素(CAP)是辣椒的主要成分，可激活小直径的感觉神经元中的辣椒素受体(vanidlloid1-R，VR1)而引起痛觉，并呈剂量相关性地释放SP等神经肽类物质。VR1广泛分布于初
52、级感觉神经元的末梢(又称伤害性感受器)。辣椒素等与VR1上的结合位点结合，激活VR1引发伤害性传导。生理条件的H+不会激活VR1，但在病理条件下，组织酸化使得H+能易化或激活VR1，加强伤害性疼痛传导。镇痛药可使小鼠疼痛反应减轻，舔脚掌时间缩短。【评价】通过实验确定辣椒素致痛剂量，认为200umol/L是理想的致痛浓度，既能引起显著疼痛反应，又不引起炎性损伤的致痛浓度，适于研究受体拮抗剂的抗痛作用。【注意事项】辣椒素致痛剂量要恰当。当注射辣椒素200umol/L时致痛效果较好，当辣椒素浓度4ooumol/L时，则具有镇痛作用。辣椒素受体阻滞药（CPZ）是一种合成的辣椒素类似物，可特异性地阻断辣
53、椒素受体。在小鼠痛觉模型中，CPZ能有效抑制辣椒素的致痛作用，而其本身并不致痛。因此，辣椒素致痛模型可用于镇痛药的筛选。坐骨神经挤压模型实验坐骨神经挤压模型实验【原理】坐骨神经挤压模型实验(sciaticnervecrush,SNC)是通过机械挤压坐骨神经引起动物损伤侧后肢出现明显的对机械、冷及热刺激的痛觉超敏和痛觉过敏现象，给药后动物痛阈的变化直接反映受试药物镇痛作用的强弱。坐骨神经部分结扎模型【原理】坐骨神经部分结扎模型(partialnerveinjury，PNI)是通过部分结扎（1/31/2）坐骨神经引起动物损伤侧后肢出现明显的对机械及热刺激的痛觉超敏和痛觉过敏现象，给药后动物痛阈的变
54、化直接反映受试药物镇痛作用的强弱。急性内脏痛模型【原理】急性内脏痛模型（modelofacutevisceralpain）是基于肠道存在对多种刺激敏感的感受器，大多数感受器对化学和机械性刺激敏感，肠道可能还存在特异和非特异内脏伤害性感受器，部分感受器对肠道扩张、局部缺血及缓激肽敏感，提示这些感受器可对不同强度、性质的伤害刺激编码，最终的感觉是中枢整合的结果，而随着重复、持续伤害性感受的传入，脊髓背角神经元兴奋性增高，由甲醛刺激乙状结肠壁引起的伤害性冲动传入可能是由多种炎症介质加入引起的更多外周感受器兴奋经中枢整合后的结果。三叉神经痛模型-青霉素G钾法【原理】K+为致痛物质。三叉神经脊束核尾侧部是三叉神经痛发病的关键部位。在该部位用微量进样器注入微量青霉素G钾，复制大鼠三叉神经痛实验动物模型，诱发出类似人的三叉神经痛样反应，表现为尖叫、甩头、左后肢快速抓同侧面部等特定指标。通过青霉素G钾致三叉神经痛反应模型，研究药物对三叉神经痛的镇痛作用。
