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1、细菌菌-淀粉淀粉酶产生菌生菌种挑种挑选一实验目的一实验目的1掌握从环境中采集样品并从中分掌握从环境中采集样品并从中分别纯化某种微生物的完好操作步别纯化某种微生物的完好操作步骤。骤。2稳定所学的微生物学实验技术。稳定所学的微生物学实验技术。二二. . 实验原理实验原理 -淀粉淀粉酶酶是一种液化型淀粉是一种液化型淀粉酶酶，它的，它的产产生菌芽生菌芽孢孢杆菌，广泛分布于自然界，尤其是杆菌，广泛分布于自然界，尤其是在含有淀粉在含有淀粉类类物物质质的土壤等的土壤等样样品中。品中。从自然界挑选菌种的详细做法，大致可以从自然界挑选菌种的详细做法，大致可以分成以下四个步骤：采样、增殖培育、纯分成以下四个步骤：
2、采样、增殖培育、纯种分别和性能测定。种分别和性能测定。 1 1、采样：即采集含菌的样品、采样：即采集含菌的样品1研讨所挑选的微生物得能够分布区域。研讨所挑选的微生物得能够分布区域。2土壤是微生物的大本营，所以普通采集土样。土壤是微生物的大本营，所以普通采集土样。3土壤中，数量上细菌土壤中，数量上细菌放线菌放线菌霉菌霉菌酵母菌。酵母菌。4 不同区域的土壤含有相应的优势微生物。例如不同区域的土壤含有相应的优势微生物。例如树林腐土和朽木中纤维素分解菌较多；面粉厂附树林腐土和朽木中纤维素分解菌较多；面粉厂附近、栽种淀粉质作物土壤中淀粉的分解菌较多；近、栽种淀粉质作物土壤中淀粉的分解菌较多；果实、树叶外
3、表酵母菌较多；蔬菜、牛奶中乳酸果实、树叶外表酵母菌较多；蔬菜、牛奶中乳酸菌较多；油田、炼油厂附近的土壤中石油分解菌菌较多；油田、炼油厂附近的土壤中石油分解菌较多等。较多等。2、增殖培育又称富集培育、增殖培育又称富集培育 增殖培育就是在所采集的含菌增殖培育就是在所采集的含菌样品中参与某些物质，并发明一些有利于样品中参与某些物质，并发明一些有利于待分别微生物生长的其他条件，使能分解待分别微生物生长的其他条件，使能分解利用这类物质的微生物大量繁衍，从而便利用这类物质的微生物大量繁衍，从而便于采用稀释分别法分别到这类微生物。因于采用稀释分别法分别到这类微生物。因此，增殖培育现实上是选择性培育基的一此，
4、增殖培育现实上是选择性培育基的一种实践运用。种实践运用。3、纯种分别、纯种分别 在消费实际中，普通都运用纯在消费实际中，普通都运用纯种微生物进展消费。纯种分别的方法很多，种微生物进展消费。纯种分别的方法很多，主要有：平板划线分别法、稀释分别法、主要有：平板划线分别法、稀释分别法、单孢子或单细胞分别法、菌丝尖端切割法单孢子或单细胞分别法、菌丝尖端切割法等。等。最常用的分别方法是稀释分别法。最常用的分别方法是稀释分别法。4、性能测定、性能测定 分别得到纯种只是选种任务分别得到纯种只是选种任务的第一步。所分别的纯种能否具有消费的第一步。所分别的纯种能否具有消费上要求的优良性能，还必需进展性能测上要求
5、的优良性能，还必需进展性能测定，根据性能上下进展取舍。定，根据性能上下进展取舍。性能测定的方法性能测定的方法1 初初筛筛：普通在培育皿上根据：普通在培育皿上根据选择选择性培育基性培育基的原理的原理进进展。展。 例如要挑例如要挑选选淀粉淀粉酶酶产产生菌，可以在稀生菌，可以在稀释释分分别时别时运用运用选择选择培育基培育基含淀粉的培育基，含淀粉的培育基，经经培育后培育后经过测经过测定透明圈与菌落直径的比定透明圈与菌落直径的比值值来衡量淀粉来衡量淀粉酶酶活力的上下。活力的上下。 2复筛：在初筛的根底上做比较精细的复筛：在初筛的根底上做比较精细的测定。普通是将微生物培育在三角瓶中作测定。普通是将微生物培
6、育在三角瓶中作摇瓶培育或固体培育，对培育物进展分析摇瓶培育或固体培育，对培育物进展分析酶活性酶活性 测定。根据酶活性的大小，进一步测定。根据酶活性的大小，进一步对所分别的菌种进展挑选。对所分别的菌种进展挑选。三实验资料三实验资料1、资料：小铁铲和无菌纸或袋。无菌、资料：小铁铲和无菌纸或袋。无菌水三角瓶水三角瓶300mL的瓶装水至的瓶装水至99mL，内有玻璃珠假设干；无菌吸管内有玻璃珠假设干；无菌吸管1mL，5 mL等；无菌水试管每支等；无菌水试管每支4.5mL水；无菌培育皿；水；无菌培育皿； 2、培育基、培育基1分别培育基分别培育基w/v：蛋白胨：蛋白胨 1%；NaCl 0.5%；牛肉膏；牛肉
7、膏 0.5%；可溶性淀粉；可溶性淀粉 0.2%；琼脂；琼脂1.5%；pH7.2；水定容。；水定容。注：先将可溶性淀粉加少量蒸馏水调成糊状，再加到注：先将可溶性淀粉加少量蒸馏水调成糊状，再加到溶化好的培育基中，调匀。溶化好的培育基中，调匀。 2肉膏蛋白胨培育基肉膏蛋白胨培育基w/v：肉膏蛋白胨培育基：牛：肉膏蛋白胨培育基：牛肉膏肉膏0.3%，蛋白胨，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，琼脂，琼脂1.5%, pH7.0-7.23麸曲培育基：麸皮麸曲培育基：麸皮7克；克； 玉米面玉米面 1克；克； NH42SO4 0.04克克 4%NH42SO4加加1mL； NaOH 0.08克克8%NaOH加加lmL
8、；水；水10mL，混合均匀，装入，混合均匀，装入250-300mL三角瓶中，三角瓶中，15磅灭菌磅灭菌30分钟。分钟。3.试剂：试剂：1 Lugol氏碘液：碘氏碘液：碘1克，碘化克，碘化钾钾2克，水克，水300毫升。毫升。 配制配制时时先将碘化先将碘化钾钾溶于溶于5-10毫升水中，再参与碘，溶解后毫升水中，再参与碘，溶解后定容。定容。2 碘原液：碘原液： 碘碘 2.2%； 碘化碘化钾钾 4.4%； 加水定容。加水定容。3 比色稀碘液：碘原液比色稀碘液：碘原液2mL，加碘化，加碘化钾钾20g，定容至，定容至500mL。现现配配现现用。用。4 0.2%可溶性淀粉液可溶性淀粉液 w/v ：称取：称取
9、0.2克可溶性淀粉，先以克可溶性淀粉，先以少少许许蒸蒸馏馏水混合，再徐徐水混合，再徐徐倾倾入煮沸蒸入煮沸蒸馏馏水中，水中，继续继续煮煮沸至透明沸至透明为为止，冷却定容至止，冷却定容至100ml。5 pH6.0磷酸磷酸氢氢二二钠钠-柠柠檬酸檬酸缓缓冲液：冲液：Na2HPO412H20 11.31克，克，柠柠檬酸檬酸 2.02克，加水定容至克，加水定容至250mL。 四实验方法 1、分、分别纯别纯化化采集采集样样品品样样品品稀稀释释：在在无无菌菌纸纸上上称称取取样样品品1g，放放入入100mL无无菌菌水水的的三三角角瓶瓶中中，手手摇摇10分分钟钟。80水水浴浴15分分钟钟，冷冷却却。用用1mL无无
10、菌菌吸吸管管汲汲取取0.5mL注注入入4.5mL无无菌菌水水试试管管中，梯度稀中，梯度稀释释至至10-6。 稀稀释释分分别别：用用稀稀释释样样品品的的同同支支吸吸管管分分别别依依次次从从10-4、10-3、10-2样样品品稀稀释释液液中中，汲汲取取1mL，注注入入无无菌菌培培育育皿皿中中，然然后后倒倒入入灭灭菌菌并并融融化化冷冷至至50左左右右的的固固体体培培育育基，小心基，小心摇动摇动冷凝后，倒置于冷凝后，倒置于37温箱中培育温箱中培育24小小时时。 碘液碘液检查：培育：培育24小小时后，取出平板，无菌后，取出平板，无菌操作向皿中注入操作向皿中注入1滴滴Lugol氏碘液，因淀粉遇氏碘液，因淀
11、粉遇碘碘变蓝色，如菌落周色，如菌落周围有无色圈，有无色圈，阐明明该菌菌能分解淀粉。能分解淀粉。菌种菌种纯化：无菌操作从平板上化：无菌操作从平板上选取淀粉水解取淀粉水解圈直径与菌落直径之比圈直径与菌落直径之比较大的菌落，用接种大的菌落，用接种环沾取少量培育物至斜面上，并沾取少量培育物至斜面上，并进展展2-3次划次划线分分别，挑取，挑取单菌落至斜面上，培育后察看菌落至斜面上，培育后察看菌苔生菌苔生长情况并情况并镜检验证为纯培育。培育。2、麸曲培育、麸曲培育 取取纯化菌落斜面中参与化菌落斜面中参与5mL无无菌水制成菌菌水制成菌悬液，取液，取1mL接种至麸接种至麸曲培育基中，曲培育基中，搅匀后，匀后，
12、36-37培育培育24小小时。 3 3、酶活测定、酶活测定 制制备酶液：在已成熟的夫曲三角瓶中，加水液：在已成熟的夫曲三角瓶中，加水100mL，搅匀，置匀，置30水浴水浴30分分钟，用脱脂棉，用脱脂棉过滤，滤液即液即细菌菌-淀粉淀粉酶液。液。 酶活活测定：在三角瓶中，参与定：在三角瓶中，参与0.2%可溶性淀粉溶液可溶性淀粉溶液2mL，缓冲液冲液0.5mL，在，在60水浴中水浴中10分分钟平衡温度，平衡温度，参与参与3mL酶液，充沛混匀，即刻液，充沛混匀，即刻记时，定，定时取出一滴反取出一滴反响液于比色板穴中，穴中先盛有比色稀碘液，当由紫色响液于比色板穴中，穴中先盛有比色稀碘液，当由紫色逐逐渐变
13、为红棕色，即棕色，即为反响反响终点，点，记录时间t，单位位为分分钟。 酶活力活力单位的位的计算算淀粉淀粉酶活力活力单位的定位的定义：1克或克或1mL酶制制剂或或酶液于液于60，在，在1小小时内液化可溶性淀粉的克数内液化可溶性淀粉的克数 克克/克或毫升克或毫升小小时。淀粉淀粉酶活力活力单位位=60/t20.2%f/3f/t 式中式中f是是酶的稀的稀释倍数。倍数。 本卷本卷须知：知：淀粉液淀粉液该当天配制运用，不能久当天配制运用，不能久贮。测定液化定液化时间应控制在控制在23分分钟内。内。五实验报告五实验报告 总结整个分别挑选过程，总结整个分别挑选过程，写出挑选结果并对挑选结果进展分析。写出挑选结
14、果并对挑选结果进展分析。六六. . 实验时间布置实验时间布置周一：配制培育基并周一：配制培育基并灭菌、配制菌、配制试剂；稀；稀释分分别，37培育培育24h。周二：碘液周二：碘液检查，挑取透明圈直径：菌落，挑取透明圈直径：菌落直径比直径比值大的大的单菌落，平板划菌落，平板划线，37培育培育24h。周三：挑取周三：挑取单菌落接斜面培育基。菌落接斜面培育基。周四：接麸曲培育基，周四：接麸曲培育基，37培育培育24h。周五：周五：测定定酶活。活。各组义务布置各组义务布置一组：分别培育基一组：分别培育基2000mL2000mL。4.5mL4.5mL无菌水无菌水6060支。包扎支。包扎1mL1mL移液管移
15、液管1010支支二组：肉膏蛋白胨培育基二组：肉膏蛋白胨培育基 。包扎。包扎1mL1mL移液管移液管1010支。培支。培育皿育皿3030套。套。三三- -五组：每组各五组：每组各6 6瓶，纱布塞。培育皿瓶，纱布塞。培育皿2020套套六组：六组：1 1LugolLugol氏碘液氏碘液300mL300mL，分装，分装6 6个棕色滴瓶。个棕色滴瓶。 2 2碘原液碘原液100mL100mL。 3 3比色稀碘液比色稀碘液3000mL3000mL。分装。分装6 6个棕个棕色试剂瓶。色试剂瓶。 4 4pH6.0pH6.0磷酸氢二钠磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲柠檬酸缓冲液液2000mL2000mL，分装，分装6 6个试剂瓶。个试剂瓶。
