《RNA干扰技术及其应用.ppt》由会员分享,可在线阅读,更多相关《RNA干扰技术及其应用.ppt(25页珍藏版)》请在金锄头文库上搜索。
1、RNA干扰技术及其应用 生工1002 李奔存The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006安德鲁安德鲁法法尔尔AndrewZ.Fire美国美国麻省理工学院1959n雷格雷格梅洛梅洛Craig C.Mello美国哈佛大学1960For there discovery of RNA interference-gene silencing by double-stranded RNARNAi(RNA interference,RNA干扰)vDouble-stranded RNA inhibits expression of genes homologou
2、s to that RNA. 双链双链RNA抑制抑制含其同源序列含其同源序列基因的表达基因的表达Brief History of RNAi Discoveriesv1990年,RichJorgensen 设想,在矮牵牛中花插入一种催生红色素的基因,能使花朵的色彩更艳丽,而结果出其预料,转基因的植株不仅没有新基因表达,反而使原有的色素基因也受到了抑制,花的颜色变为白色,当时称共抑制(cosuppression) )95年年Guo和和kemphues在秀丽线虫在秀丽线虫(C.elegans)中用反义中用反义RNA 阻止一些基因阻止一些基因的表达,给对照组用正义的表达,给对照组用正义RNA不但不增不
3、但不增加该基因的表达,反而产生与反义加该基因的表达,反而产生与反义RNA 同样的结果同样的结果特异性阻断该基因的表达,特异性阻断该基因的表达,从而正式表明从而正式表明RNA 干扰现象的存在。干扰现象的存在。94年年Cogoni等证明真菌中亦有类似现等证明真菌中亦有类似现象,此称为基因压制象,此称为基因压制 (quelling)。 1998年Andrew Fire等首次将正义链反义链RNA混合注入线C.elegans中,观察到更强的基因表达抑制。首次提出了RNAinterference的概念A control: not stainedA control: not stainedB: wtB: w
4、tC: wt + antisense RNAC: wt + antisense RNAD: wt + D: wt + dsds RNA RNA2001年Elbashir等 Nature上首次报道通过21个核苷酸的siRNA成功的在哺乳动物培养细胞中诱导特异性基因沉默。三三. .RNAiRNAi作用机制作用机制起始阶段起始阶段效应阶段效应阶段扩增扩散阶段扩增扩散阶段起始阶段起始阶段v病毒基因、人工转入基因等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内,并利用宿主细胞进行转录时,常产生一些dsRNAv这些dsRNA被胞质中的RNase特异核酸酶Dicer切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA(大约21
5、23 bp),即siRNAvsiRNAsiRNA的特点:的特点:33端均有端均有2 23 3个突出个突出的核苷酸的核苷酸vsiRNA双链结合核酶复合物形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex, or RISC) 效应阶段效应阶段v在ATP存在情况下,siRNA双链展开激活RISC,激活的RISC即可通过碱基互补与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合,RISC具有核酸酶的功能,在结合部位切割mRNA,切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解,从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应 vsiRNA不仅能
6、引导不仅能引导RISC切割同源单链切割同源单链mRNA,而且可,而且可作为引物与靶作为引物与靶RNA结合并在结合并在RNA聚合酶聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRP)作用下合成)作用下合成更多新的更多新的dsRNA。v依次循环:依次循环: 新合成的长链新合成的长链dsRNAdsRNA同样可被同样可被DicerDicer切割、降解生切割、降解生成大量的次级成大量的次级siRNAsiRNA。次级。次级siRNAsiRNA又可进入合成一切割又可进入合成一切割的循环过程,进一步放大的循环过程,进一步放大RNAiRNAi作用。作用。扩增扩散阶段扩增扩散阶段四、RNA
7、i研究的一般技术路线确定目的基因设计siRNA的序列获得siRNA产物siRNA转染RNAi效果检测化学合成体外转录长片段RNA消化siRNA表达载体siRNA表达框架1.siRNA的一般结构:哺乳动物:21-23bp dsRNA 其它生物:更长的片段dTdT(UU)(UU)dTdT 四四 siRNA的设计的设计2.设计流程(选择siRNA靶位点)从转录本AUG起始密码子开始,搜寻下游AA序列,记录跟每个AA 3端相邻的19个核苷酸作为候选的siRNA靶位点;根据5和3非翻译区(UTR)及靠近起始密码子(75个碱基之内)等富含调节蛋白结合位点区域来设计siRNA。将候选靶位点与相应的基因组数据
8、库比较,去掉哪些与其它编码序列同源的靶序列。设计阴性对照:阴性对照siRNA应与siRNA的核苷酸组成相同但没有与基因组明显同源的序列。一般通过改变siRNA核苷酸顺序并经同源序列比较确证而得。获得siRNA产物v1、化学合成v尽管化学合成是最贵的方法,但是却是最方便的研究人员几乎不需要做什么工作。许多公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。v主要的缺点包括价格高,定制周期长,特别是有特殊需求的。v由于价格比其他方法高,为一个基因合成34对siRNAs 的成本就更高了,比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。v最适用于:已经找到最有效的siRNA的情况下,需要
9、大量siRNA进行研究;v不适用于:筛选siRNA等长时间的研究,主要原因是价格因素2、体外转录DNA Oligo为模版,通过体外转录合成siRNAs 相对化学合成法而言成本比较低,是一种性价比高的筛选siRNAs的好方法。更重要的是能够更快的得到siRNAs。值得一提的是体外转录得到的siRNAs只要较低的浓度就可以达到化学合成siRNAs较高浓度得到的效果。不足之处:实验的规模受到限制,虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs,但是反应规模和量始终有一定的限制。最适用于:筛选siRNAs,特别是需要制备多种siRNAs,化学合成的价格成为障碍时。不适用于:实验需要大量的,一
10、个特定的siRNA。长期研究。 3.用RNase III 消化长片断双链RNA制备siRNA v其其他他制制备备siRNAsiRNA的的方方法法的的缺缺陷陷是是需需要要设设计计和和检检验验多多个个siRNAsiRNA序序列列以以便便找找到到一一个个有有效效的的siRNAsiRNA。这这种种方方法法制制备备一一份份混混合合有有各各种种siRNAssiRNAs “混混合合鸡鸡尾尾酒酒”就就可可以以避避免免这这个缺陷。个缺陷。v这这个个方方法法是是选选择择通通常常是是20010002001000碱碱基基的的靶靶mRNAmRNA模模版版,用用体体外外转转录录的的方方法法制制备备长长片片断断双双链链ds
11、RNAdsRNA,然然后后用用RNaseRNase III III (or (or Dicer) Dicer) 在在体体外外消消化化,得得到到siRNAssiRNAs“混混合合鸡鸡尾酒尾酒”。v在在除除掉掉没没有有被被消消化化的的dsRNAdsRNA后后,这这个个siRNAsiRNA混混合合物物就就可可以以直直接接转转染染细细胞,方法和单一的胞,方法和单一的siRNAsiRNA转染一样。转染一样。v由由于于siRNAsiRNA混混合合物物中中有有许许多多不不同同的的siRNAssiRNAs,通通常常能能够够保保证证目目的的基基因因被有效地抑制。被有效地抑制。 vdsRNAdsRNA消消化化法法
12、的的主主要要优优点点在在于于可可以以跳跳过过检检测测和和筛筛选选有有效效siRNAsiRNA序序列列的的步步骤骤,为为研研究究人人员员节节省省时时间间和和金金钱钱(注注意意:通通常常用用RNAseRNAse IIIIII比比用用DicerDicer要便宜)。要便宜)。v不不过过这这种种方方法法的的缺缺点点也也很很明明显显,就就是是有有可可能能引引发发非非特特异异的的基基因因沉沉默默,特特别别是是同同源源或或者者是是密切相关的基因。密切相关的基因。v最最适适用用于于:快快速速而而经经济济地地研研究究某某个个基基因因功功能能缺失的表型缺失的表型v不不适适用用于于:长长时时间间的的研研究究项项目目,
13、或或者者是是需需要要一个特定的一个特定的siRNAsiRNA进行研究,特别是基因治疗进行研究,特别是基因治疗 3.用RNase III 消化长片断双链RNA制备siRNA 4.siRNA表达载体 v 毫毫无无疑疑问问,siRNAsiRNA表表达达载载体体的的优优点点在在于于这这是是众众多多方方法法中中唯唯一一可可以以进进行行长长期期研研究究的的方方法法带带有有抗抗生生素素标标记记的的载载体体可可以以在在细细胞胞中中持持续续抑抑制制靶靶基基因因的的表表达达,持持续续数数星星期甚至更久。期甚至更久。v开开始始研研究究逆逆转转录录病病毒毒和和其其他他病病毒毒载载体体用用于于siRNAsiRNA表表达
14、达,其其优优势势在在于于可可以以直直接接高高效效率率感感染染细细胞胞进进行行基基因因沉沉默默的的研究,避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便。研究,避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便。由由于于涉涉及及到到克克隆隆,这这个个过过程程需需要要几几天天的的时时间间,同同时时也也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。不不过过幸幸好好载载体体容容易易大大量量扩扩增增,这这个个优优点点足足以以弥弥补补所所有有缺陷,特别是当载体在实验中确实有效的时候。缺陷,特别是当载体在实验中确实有效的时候。4.siRNA表达载体 最适用于:已知一个有效的最适用于:已知一个有效的s
15、iRNAsiRNA序列,需要维序列,需要维持较长时间的基因沉默,或者需要用抗生素筛选持较长时间的基因沉默,或者需要用抗生素筛选能表达能表达siRNAsiRNA的细胞。长期研究。的细胞。长期研究。不适用于:筛选不适用于:筛选siRNAsiRNA序列(其实主要是指需要序列(其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作)多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作)expression5. siRNA表达框架 v siRNAsiRNA表表达达框框架架( (siRNAsiRNA expression expression cassettescassettes,SECsSECs) )是是一一种种由由PC
16、RPCR得得到到的的siRNAsiRNA表表达达模模版版,能能够够直直接接导导入入细细胞胞进行表达而无需事前克隆到载体中。进行表达而无需事前克隆到载体中。v这这个个方方法法最最早早是是由由CastanottoCastanotto采采用用,包包括括一一个个RNA RNA polpol IIIIII启启动动子子,一一段段发发夹夹结结构构siRNAsiRNA,一一个个RNA RNA polpol IIIIII终终止位点。止位点。v和和siRNAsiRNA表表达达载载体体不不同同的的是是,SECsSECs不不需需要要载载体体克克隆隆、测测序序等等颇颇为为费费时时的的步步骤骤,可可以以直直接接由由PCR
17、PCR得得到到,不不用用一一天天的时间。的时间。v因因此此,SECsSECs成成为为筛筛选选siRNAsiRNA的的最最有有效效工工具具,甚甚至至可可以以用用来筛选在特定的研究体系中启动子和来筛选在特定的研究体系中启动子和siRNAsiRNA的最适搭配!的最适搭配!v如如果果在在PCRPCR两两端端添添加加酶酶切切位位点点,那那么么通通过过SECsSECs筛筛选选出出的的最最有有效效的的siRNAsiRNA后后,可可以以直直接接克克隆隆到到载载体体中中构构建建siRNAsiRNA表达载体。表达载体。v构构建建好好的的载载体体可可以以用用于于稳稳定定表表达达siRNAsiRNA和和长长效效抑抑制
18、制的的研究。研究。 v这这个个方方法法的的主主要要缺缺点点是是PCRPCR产产物物很很难难转转染染到到细细胞胞中中。如如果果有有适适合合的的新新型型转转染染试试剂剂能能提提高高SECSEC的的转转染染效效率率的的话话,那那问问题题就就可可以以解解决决了了。另另外外,没没有有克克隆隆到到载载体体中中的的PCRPCR片断并不适于大规模制备。片断并不适于大规模制备。v最最适适用用于于:筛筛选选siRNAsiRNA序序列列,在在克克隆隆到到载载体体前前筛筛选选最最佳启动子;佳启动子;v不不适适用用于于:长长期期抑抑制制研研究究。(如如果果克克隆隆到到载载体体后后就就可可以了)以了) 。 5. siRN
19、A表达框架 五、RNA干扰的应用1、研究基因功能的新工具 线虫和果蝇的全部基因组序列已测试完毕,发现大量未知功能的新基因,RNAi将大大促进对这些新基因功能的研究。与传统的基因敲除技术相比,这一技术具有投入少,周期短,操作简单等优势。 2、开展基因治疗的新策略 RNAi具有抵抗病毒入侵,抑制转座子活动,防止自私基因序列过量增殖等作用,因此可以利用RNAi现象产生抗病毒的植物和动物,并可利用不同病毒转录序列中高度同源区段相应的dsRNA抵抗多种病毒。 3、进行药物筛选的工具 RNA干扰仍存在的问题 目前目前siRNAsiRNA导入胞内的效率低下,如何有效导入胞内的效率低下,如何有效将将siRNAsiRNA转移入体内成为转移入体内成为RNAiRNAi应用的最大障应用的最大障碍;碍; 如何在目的基因序列上选择如何在目的基因序列上选择21-23nt21-23nt左右左右的序列作为的序列作为siRNAsiRNA 的模板,从目前的研究的模板,从目前的研究来看,序列的选择原则尚不清楚;来看,序列的选择原则尚不清楚; 目前目前RNAiRNAi 机制尚未完全阐明。机制尚未完全阐明。