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1、医用检验技术及应用 电泳技术电泳技术电泳技术医用检验技术及应用 电泳技术目目 录录第一第一节区区带电泳泳 第二第二节等等电聚焦聚焦电泳泳 第三第三节SDS-PAGE电泳泳 第四第四节二二维电泳泳 第五第五节印迹技印迹技术 第六第六节免疫免疫电泳泳 第七第七节高效毛高效毛细管管电泳技泳技术 第八第八节电泳分析泳分析仪 医用检验技术及应用 电泳技术基本原理基本原理不同性不同性质的的质点，由于点，由于带电性性质及及电量不同，在量不同，在一定一定电场强度下移度下移动的方向和速度亦不同。的方向和速度亦不同。蛋白蛋白质质分子分子为为两性两性电电解解质质等等电点点pH等等电点点 带负电pH等等电点点 带正正
2、电医用检验技术及应用 电泳技术质点所带净电荷量越多（介质的质点所带净电荷量越多（介质的pH值离等电点越远）值离等电点越远）质点的直径越小质点的直径越小越接近球形越接近球形则它在电场中的泳动速度越快，迁移率亦越大。则它在电场中的泳动速度越快，迁移率亦越大。基本原理基本原理医用检验技术及应用 电泳技术区带电泳区带电泳检验医学中的医学中的应用血清蛋白用血清蛋白电泳泳图图 6-1 6-1 正常血清蛋白电泳图谱正常血清蛋白电泳图谱上图：箭头示电泳方向，右侧示各条带的主要组分；上图：箭头示电泳方向，右侧示各条带的主要组分；下图：光密度扫描后电泳图谱；下图：光密度扫描后电泳图谱；HPHP：触珠蛋白；：触珠蛋
3、白；CPCP：铜蓝蛋白：铜蓝蛋白Alb：清蛋白：清蛋白1：1酸性糖蛋白、1抗胰蛋白酶2：HP、CP、2巨球蛋白、脂蛋白：运铁蛋白、补体系统、：运铁蛋白、补体系统、脂蛋白：IgG、IgM、IgA、IgD、IgE医用检验技术及应用 电泳技术区带电泳区带电泳 图图6-2 6-2 几种常见异常血清蛋白图谱几种常见异常血清蛋白图谱A A：双清蛋白血清电泳图；：双清蛋白血清电泳图；B B：慢性肝病或肝硬变常见的：慢性肝病或肝硬变常见的 - - 融融合的桥连现象；合的桥连现象；C C：免疫球蛋白寡克隆增生型；：免疫球蛋白寡克隆增生型；D D：M M蛋白血清蛋白血清型（型（IgAIgA型）；型）；N N：正常
4、对照血清；：正常对照血清；P P：患者血清：患者血清A BC D医用检验技术及应用 电泳技术区带电泳区带电泳检验医学中的医学中的应用用 同工同工酶电泳泳 图图6-3 LDH6-3 LDH同工酶区带电泳图谱同工酶区带电泳图谱左：左：5 5份血清份血清iso-LDHiso-LDH电泳图；右：电泳图；右：iso-LDHiso-LDH电泳示意图电泳示意图医用检验技术及应用 电泳技术第一节第一节 区带电泳区带电泳检验医学中的医学中的应用用 同工同工酶电泳泳 图图6-4 CK6-4 CK同工酶示意图同工酶示意图左：血清左：血清iso-CKiso-CK电泳图，电泳图，3 3示正示正常血清（常血清（CK MB
5、5%CK MB5%CK MB5%）；）；4 4示示CK BBCK BB阳性；阳性；右：右：iso-CKiso-CK电泳图谱示意图电泳图谱示意图 医用检验技术及应用 电泳技术区带电泳区带电泳实验原理原理 让pHpI（max）所有所有蛋白蛋白质带负电各种蛋白各种蛋白质带电量不同量不同电泳速度不同泳速度不同经过一段一段时间电泳后，各种蛋白泳后，各种蛋白质被区分开被区分开医用检验技术及应用 电泳技术区带电泳区带电泳图图 6-1 6-1 正常血清蛋白电泳图谱正常血清蛋白电泳图谱上图：箭头示电泳方向，右侧示各条带的主要组分；上图：箭头示电泳方向，右侧示各条带的主要组分；下图：光密度扫描后电泳图谱；下图：光
6、密度扫描后电泳图谱；HPHP：触珠蛋白；：触珠蛋白；CPCP：铜蓝蛋白：铜蓝蛋白Alb：清蛋白：清蛋白1：1酸性糖蛋白、1抗胰蛋白酶2：HP、CP、2巨球蛋白、脂蛋白：运铁蛋白、补体系统、：运铁蛋白、补体系统、脂蛋白：IgG、IgM、IgA、IgD、IgE医用检验技术及应用 电泳技术医用检验技术及应用 电泳技术医用检验技术及应用 电泳技术第二节第二节 等电聚焦电泳等电聚焦电泳检验医学中的医学中的应用用次次级同工同工酶的分离的分离 图图 6-5 6-5 碱性磷酸酶同工酶等电聚焦电泳图谱碱性磷酸酶同工酶等电聚焦电泳图谱左：左：iso-ALPiso-ALP等电聚焦示意图；右：胆道梗阻性疾病等电聚焦示
7、意图；右：胆道梗阻性疾病iso-ALPiso-ALP电泳图谱电泳图谱医用检验技术及应用 电泳技术第二节第二节 等电聚焦电泳等电聚焦电泳 区区带电泳的原理是不同的蛋白泳的原理是不同的蛋白质有不同的有不同的电泳速度泳速度那么可不可以有另外一种方法：使得不同蛋白那么可不可以有另外一种方法：使得不同蛋白质在在泳道中本来就有泳道中本来就有“固定固定”位置，蛋白位置，蛋白质在相在相应的位的位置上停留？置上停留？蛋白蛋白质如何能如何能够停止停止电泳？泳？除了切断除了切断电源之外？源之外？蛋白蛋白质不不带电了了蛋白蛋白质处于等于等电点溶液中点溶液中医用检验技术及应用 电泳技术第二节第二节 等电聚焦电泳等电聚焦
8、电泳 基本原理基本原理在等在等电聚焦聚焦电泳泳时必必须有一个有一个稳定的定的pH梯度介梯度介质，使，使pH值从正极向从正极向负极极渐次增加，形成一次增加，形成一线性性pH梯度梯度。蛋白蛋白质混合物加入有混合物加入有pH梯度的梯度的电泳管中，在泳管中，在电场中中经一定一定时间后，混合物中各后，混合物中各组分将分分将分别聚焦聚焦在在与各与各等等电点点相相应的的pH介介质区域，形成分离的各种区域，形成分离的各种蛋白蛋白质区区带。这就是就是等等电聚焦聚焦电泳泳分离蛋白分离蛋白质的基的基本原理。本原理。医用检验技术及应用 电泳技术第三节第三节 SDS-PAGE电泳电泳 等等电聚焦根据等聚焦根据等电点将蛋
9、白点将蛋白质分离分离那那还能不能根据其他性能不能根据其他性质将蛋白将蛋白质分离分离?区区带电泳的泳的电泳速度的影响条件泳速度的影响条件较多多（大小、（大小、电荷、形状），不是根据荷、形状），不是根据单一一性性质分离分离有一种方法能根据蛋白有一种方法能根据蛋白质的分子量使之的分子量使之带上相上相应的的电荷，荷，远远大于蛋白大于蛋白质本身本身电荷的大小，并使荷的大小，并使电荷成荷成为电泳速度的泳速度的主要决定因素，那么主要决定因素，那么电泳速度只和分子泳速度只和分子量相关量相关医用检验技术及应用 电泳技术第三节第三节 SDS-PAGE电泳电泳 SDS是一种阴离子表面活性是一种阴离子表面活性剂，能使
10、能使蛋白蛋白质负载了大量了大量负电荷，大大超荷，大大超过了天然了天然蛋白蛋白质的原有的原有电荷，因此蛋白荷，因此蛋白质之之间原原有有电荷的差异就无荷的差异就无显著效著效应，蛋白，蛋白质带电量量的多少，只与蛋白的多少，只与蛋白质大小即大小即分子量分子量有关，有关，此此时，不同泳不同泳动速率速率仅反映了各反映了各蛋白蛋白质亚基的分子量的差基的分子量的差别。医用检验技术及应用 电泳技术第三节第三节 SDS-PAGE电泳电泳检验医学中的医学中的应用用非非浓缩尿蛋白尿蛋白电泳泳图图 6-7 6-7 非浓缩尿蛋白电泳非浓缩尿蛋白电泳示意图示意图医用检验技术及应用 电泳技术第三节第三节 SDS-PAGE电泳
11、电泳检验医学中的医学中的应用用非非浓缩尿蛋白尿蛋白电泳泳 图图 6-8 6-8 临床常见蛋白尿电泳图谱临床常见蛋白尿电泳图谱左：肾小球性蛋白尿；左：肾小球性蛋白尿；中：肾小管性蛋白尿，泳道中：肾小管性蛋白尿，泳道4 4示混合性蛋白尿，肾小管性蛋白尿为主型；示混合性蛋白尿，肾小管性蛋白尿为主型；右：混合型蛋白尿右：混合型蛋白尿医用检验技术及应用 电泳技术一个条带中仍是混合着多种蛋一个条带中仍是混合着多种蛋白质，如何再把它们分开呢？白质，如何再把它们分开呢？医用检验技术及应用 电泳技术第四节第四节 二维电泳二维电泳图图 6-9 6-9 二维电泳原理及流程图二维电泳原理及流程图医用检验技术及应用 电
12、泳技术第四节第四节 二维电泳二维电泳 基本原理基本原理第一第一维电泳泳，即等，即等电聚焦聚焦电泳泳(isoelectric focusing，IEF)其基本原理是利用蛋白其基本原理是利用蛋白质分分子等子等电点的不同点的不同对其其进行分离；行分离；第二第二维电泳泳，即，即SDS-聚丙稀聚丙稀酰胺凝胶胺凝胶电泳泳(SDS-PAGE)，使，使电泳迁移率主要取决于蛋泳迁移率主要取决于蛋白白质或或亚基分子量的大小。基分子量的大小。 医用检验技术及应用 电泳技术第四节第四节 二维电泳二维电泳检验医学中的医学中的应用用医用检验技术及应用 电泳技术一个问题：如何确定某个条带一个问题：如何确定某个条带是什么蛋白
13、质？是什么蛋白质？图图 6-1 6-1 正常血清蛋白电泳图谱正常血清蛋白电泳图谱上图：箭头示电泳方向，右侧示各条带的主要组分；上图：箭头示电泳方向，右侧示各条带的主要组分；下图：光密度扫描后电泳图谱；下图：光密度扫描后电泳图谱；HPHP：触珠蛋白；：触珠蛋白；CPCP：铜蓝蛋白：铜蓝蛋白医用检验技术及应用 电泳技术第五节第五节 印迹技术印迹技术免疫印迹法基本原理免疫印迹法基本原理图图 6-13 6-13 免疫印迹法的原理免疫印迹法的原理医用检验技术及应用 电泳技术第五节第五节 印迹技术印迹技术免疫印迹法（免疫印迹法（Immunoblotting）又称蛋白又称蛋白质印迹印迹(Western bl
14、ot) ，因与早先，因与早先建立的建立的检测核酸的核酸的Southern blot 相相类似，亦被似，亦被称称为Western blot，是一种借助特异性抗体，是一种借助特异性抗体鉴定抗原的有效方法。定抗原的有效方法。被被检测物是蛋白物是蛋白质，“探探针”是抗体是抗体，“显色色”用用标记二抗二抗。医用检验技术及应用 电泳技术第五节第五节 印迹技术印迹技术共分三个共分三个阶段段进行行SDS-PAGE电转移移酶免疫定位免疫定位 医用检验技术及应用 电泳技术第五节第五节 印迹技术印迹技术免疫印迹法在免疫印迹法在检验医学中的医学中的应用用自身抗体自身抗体检测中的中的应用用医用检验技术及应用 电泳技术第
15、五节第五节 印迹技术印迹技术 图图 6-14 6-14 免疫印迹法在自身抗体免疫印迹法在自身抗体ENAENA检测中的应用检测中的应用医用检验技术及应用 电泳技术第六节第六节 免疫电泳免疫电泳 电泳技泳技术与与免疫技免疫技术相相结合，大大合，大大扩大了大了其其临床床应用的范用的范围，于，于1953年年Grabar和和Williams首次将凝胶首次将凝胶扩散置于直流散置于直流电场中中进行，行，让电流来加速抗原与抗体的流来加速抗原与抗体的扩散并散并规定其运行定其运行方向，并与免疫沉淀反方向，并与免疫沉淀反应相相结合合,该技技术有两有两大大优点，点，一是加快了沉淀反一是加快了沉淀反应的速度的速度，二是
16、将二是将某些蛋白某些蛋白组分利用其分利用其带电荷的不同而将其分离荷的不同而将其分离开，再分开，再分别与其与其对应抗体反抗体反应，以此作更，以此作更细微微的分析的分析。 医用检验技术及应用 电泳技术第六节第六节 免疫电泳免疫电泳 对流免疫流免疫电泳泳(CIEP) 图图 6-15 6-15 对流免疫电泳示意图及应用（对流免疫电泳示意图及应用（1 1：阳性；：阳性；2 2：弱阳性；：弱阳性；3/43/4：强阳性）：强阳性）医用检验技术及应用 电泳技术第六节第六节 免疫电泳免疫电泳 火箭免疫火箭免疫电泳泳(RIE) 实验原理原理：在含抗体的在含抗体的琼脂板一端打一排抗原孔；加脂板一端打一排抗原孔；加入
17、待入待测标本后，将抗原置阴极端，用横距本后，将抗原置阴极端，用横距23mA/cm的的电流流强度度进行行电泳。抗原泳向阳极，泳。抗原泳向阳极，在抗原抗体比例恰当在抗原抗体比例恰当处发生生结合沉淀。随着泳合沉淀。随着泳动抗原的减少，抗原泳抗原的减少，抗原泳动的基底区越来越窄，的基底区越来越窄，抗原抗体复合物形成的沉淀抗原抗体复合物形成的沉淀线逐逐渐变窄，形成窄，形成一个状如火箭的沉淀峰。一个状如火箭的沉淀峰。 医用检验技术及应用 电泳技术第六节第六节 免疫电泳免疫电泳 火箭免疫火箭免疫电泳泳(RIE)图图 6-16 Laurell 技术示意图及火箭免疫电泳图谱技术示意图及火箭免疫电泳图谱Ag：抗原
18、；：抗原；1、2、3为待测标本；为待测标本；4、5、6为标准为标准医用检验技术及应用 电泳技术第六节第六节 免疫电泳免疫电泳 火箭免疫火箭免疫电泳泳(RIE)检验医学中的医学中的应用用火箭火箭电泳放射自泳放射自显影定量甲胎蛋白影定量甲胎蛋白图图 6-17 6-17 火箭电泳放射自显影定量检测火箭电泳放射自显影定量检测AFPAFP图谱图谱医用检验技术及应用 电泳技术第六节第六节 免疫电泳免疫电泳 火箭免疫火箭免疫电泳泳(RIE)检验医学中的医学中的应用用血清脂蛋白血清脂蛋白ApoA1和和ApoB火箭火箭电泳泳 图图 6-18 血清脂蛋白血清脂蛋白ApoA1和和ApoB火箭电泳分析图谱火箭电泳分析
19、图谱1、2、3、4、5示标准；示标准；6、7、8示待测标本示待测标本 医用检验技术及应用 电泳技术第六节第六节 免疫电泳免疫电泳免疫免疫电泳泳(IEP )技技术是是区区带电泳泳与与免疫双免疫双扩散散相相结合的一种免疫合的一种免疫化学分析技化学分析技术。 医用检验技术及应用 电泳技术第六节第六节 免疫电泳免疫电泳免疫免疫电泳泳(IEP)技技术基本原理基本原理医用检验技术及应用 电泳技术第六节第六节 免疫电泳免疫电泳免疫免疫电泳泳(IEP )技技术检验医学中的医学中的应用用 表表1 1 血浆免疫电泳各区带所含蛋白成分血浆免疫电泳各区带所含蛋白成分Alb12前白蛋白前白蛋白白蛋白白蛋白1 1- -抗
20、胰蛋白酶抗胰蛋白酶1 1- -酸糖蛋白酸糖蛋白1 1- -抗糜蛋白酶抗糜蛋白酶1 1- -脂蛋白脂蛋白甲胎蛋白甲胎蛋白触珠蛋白触珠蛋白铜蓝蛋白铜蓝蛋白2 2- -巨球蛋白巨球蛋白转铁蛋白转铁蛋白C3C3、C4C4脂蛋白脂蛋白2 2- -微球蛋白微球蛋白纤维蛋白原纤维蛋白原C C反应蛋白反应蛋白免疫球蛋白免疫球蛋白医用检验技术及应用 电泳技术第六节第六节 免疫电泳免疫电泳医用检验技术及应用 电泳技术第六节第六节 免疫电泳免疫电泳免疫固定免疫固定电泳泳(IFE)检验医学中的医学中的应用用图图 6- 21 6- 21 血清免疫固定电泳图血清免疫固定电泳图左：左：IgA-型型M蛋白；右：双蛋白；右：双
21、M蛋白（蛋白（IgG-、IgA-）医用检验技术及应用 电泳技术第六节第六节 免疫电泳免疫电泳免疫固定免疫固定电泳泳(IFE)技技术优势 周期短周期短敏感性高敏感性高分辨率好分辨率好结果易分析果易分析 医用检验技术及应用 电泳技术第七节第七节 高效毛细管电泳技术高效毛细管电泳技术 基本原理基本原理电电 渗渗 流流电电电电 流流流流蛋白泳动蛋白泳动蛋白泳动蛋白泳动+ 电电电电 源源源源检检检检 测测测测 器器器器泳泳泳泳 动动动动温温温温 度度度度 控控控控 制制制制 器器器器 缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液+ 缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液图图 6-23 6-23 高效毛细管电泳原理图高效毛细管电泳原理图医
22、用检验技术及应用 电泳技术第七节第七节 高效毛细管电泳技术高效毛细管电泳技术高效毛高效毛细管管电泳的分离模式泳的分离模式毛毛细管区管区带电泳泳 (capillary zone electrophoresis, CZE)毛毛细管凝胶管凝胶电泳（泳（capillary gel electrophoresis, CGE）胶束胶束电动力学毛力学毛细管色管色谱（micellar electrokinetic capillary chromatography, MECC) 等等电聚焦聚焦电泳（泳（isoelectric focusing, IEF)等速聚焦等速聚焦电泳泳 (isotachophoresis
23、, ITP)毛毛细管管电色色谱（capillary electrochromatography, CEC）亲和毛和毛细管管电泳（泳（affinity capillary electrophoresis, ACE） 电动色色谱(electrokinetic chromatography, EKC) 非水相毛非水相毛细管管电泳（泳（non-aqueous capillary electrophoresis, NACE） 医用检验技术及应用 电泳技术第八节第八节 电泳分析仪电泳分析仪 电泳分析泳分析仪的基本的基本结构构电源源 可分可分为稳流、流、稳压、稳功率功率电泳槽泳槽电泳区泳区带分析装置分析装置
24、医用检验技术及应用 电泳技术医用检验技术及应用 电泳技术医用检验技术及应用 电泳技术第八节第八节 电泳分析仪电泳分析仪 半自半自动电泳分析泳分析仪图图 6-26 HELANA6-26 HELANA半自动电泳分析仪半自动电泳分析仪医用检验技术及应用 电泳技术第八节第八节 电泳分析仪电泳分析仪 全自全自动电泳分析泳分析仪图图 6-27 Sebia6-27 Sebia全自动电泳仪全自动电泳仪医用检验技术及应用 电泳技术医用检验技术及应用 电泳技术医用检验技术及应用 电泳技术 谢谢 谢谢医用检验技术及应用 电泳技术思考题思考题1.二二维电泳中，分泳中，分别是哪二是哪二维电泳，分泳，分别根据蛋白根据蛋白质的什么性的什么性质进行分离？行分离？2.免疫印迹法分哪几个步免疫印迹法分哪几个步骤？
