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1、质粒转化大肠杆菌1质粒转化质粒转化大肠杆菌大肠杆菌1、重组质粒的鉴定 当质粒的重组或其他载体重组后，通常会发生质粒的重组失败，包括质粒的本身环化。因而要求进行筛选，把重组成功的质粒找出来。 在目前常用的质粒和其他载体中含有相应的抗生素抗性基因，若重组成功，或不含质粒的自身环化，抗生素抗性基因表达，被转化的大肠杆菌便具备抵抗相应抗生素的能力，可以在含该抗生素的培养基上生长传代。若重组失败，大肠杆菌便不能抵抗该抗生素而死亡。2、为扩增质粒和其他载体作准备 由于大肠杆菌繁殖快，在适宜的条件下繁殖一代仅需要20-30min，而且常用质粒可以在大肠杆菌中增殖达到几百个拷贝。因此，通过对转化成功的大肠杆菌
2、培养，可以在短时间内极大的扩增目的质粒。一、实验一、实验目的目的二、实验原理二、实验原理 通过CaCl2对特定的大肠杆菌处理，制备感受态的细菌。这些细菌可使每微克超螺旋质粒DNA，如一些插入目的DNA片段的重组质粒，产生51062107个转化的菌落。 当质粒与这些大肠杆菌混合后，质粒粘附在大肠杆菌的表面，在42时，大肠杆菌出现热休克，质粒可通过大肠杆菌细胞膜上形成的空隙进入菌体内。随后，加入LB培养液，于37振动培养可使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性基因，提高转化效率。转化成功的大肠杆菌可以在相应抗生素培养皿中传代，形成菌落。三、实验流程：三、实验流程：灭活灭活物物/ /质粒质粒转化大
3、肠杆菌转化大肠杆菌挑菌挑菌摇菌摇菌菌液菌液PCRPCR四、实验方法四、实验方法-冻融法冻融法连接产物灭活连接产物灭活7 700，10min10min（冰上解冻）大肠杆菌感受态细胞（冰上解冻）大肠杆菌感受态细胞5 50 0l l、灭火物灭火物1010l l混合物，冰上放置混合物，冰上放置3 30min0min42,42,9 90sec0sec冰上冰上2min2min加入加入10001000ulLBulLB液体（无抗）液体（无抗）3737，振荡，振荡1h1h离心离心10000rpm,1min,RT10000rpm,1min,RT去上清去上清800800l l留下留下200200l l上清于上清于1
4、.5ul1.5ul离心管中重悬离心管中重悬涂板涂板3737恒温箱，倒置培养恒温箱，倒置培养12h(12h(时间不得超过时间不得超过20h)20h)1、无菌落，失败，或培养条件不充分。2、菌落布满如苔样，失败，可能是抗生素浓度不够或失效。3、菌落布满，抗生素浓度太高，失败。4、出现菌落，符合要求。（1）（2）（3）（4）五、结果分析和失败原因五、结果分析和失败原因（1）有菌落，说明转化成功，但有两种可能性：其一，质粒自身环化；其二，重组成功。（2）无菌落，说明实验没成功。（3）菌落布满如苔样，可能是抗生素浓度不够或失效。（4）出现大菌斑，大多数是霉菌污染所致。1 1、结果分析、结果分析1、平板中
5、的抗生素部分失效，长出的克隆是杂菌。2、倒Ka平板时，培养基太烫，应冷却到50以下加Ka抗生素。2、涂板时来回用力过大，涂布环或者涂布棒灼烧过热，或不待冷却就涂布。3、感受态细胞长时间处在常温状态，会严重影响其转化，操作时动作迅速。4、操作时动作过于剧烈，减少对细胞的机械损伤。切记感受态细胞比较娇嫩。5、操作过程不规范，染菌。2 2、转化失败的原因、转化失败的原因六、大肠杆菌感受态细胞的制备六、大肠杆菌感受态细胞的制备（1 1）从从LBLB平板上挑取新活化的平板上挑取新活化的E.coliE.coli TOP10TOP10单菌落单菌落于于50ml LB50ml LB培养基中，培养基中，3737振
6、荡过夜；振荡过夜；（2 2）将该菌悬液以）将该菌悬液以1:100-1:501:100-1:50的比例接种于的比例接种于100ml LB100ml LB液体培养基中，液体培养基中，3737振荡培养振荡培养2-32-3小时至小时至OD600OD6000.50.5左右；左右；（3 3）将培养液转入离心管中，冰上放置）将培养液转入离心管中，冰上放置1010分钟，然后于分钟，然后于44下下4100rpm4100rpm离离心心1010min。（4 4）弃掉上清）弃掉上清, ,加入加入3 30ml0.1mol/L预冷的预冷的CaClCaCl2 2 溶液，重悬，冰上放置溶液，重悬，冰上放置15-15-30mi
7、n30min后，后，44下下41004100rpm离心离心1010min；（5 5）弃掉上清，加入）弃掉上清，加入2ml2ml预冷的预冷的0.1mol/L0.1mol/L的的CaClCaCl，加入无菌甘油，加入无菌甘油300300l，重悬混匀重悬混匀, ,冰上放置几分钟；冰上放置几分钟；（6 6）分装，每管）分装，每管100l100l，液氮冷冻后，液氮冷冻后, ,保存于保存于-70-70冰箱。冰箱。 七、挑菌、摇菌七、挑菌、摇菌 （1）离心管标号（2）每个管内吸入650l l LB+Ka 抗生素（3）用牙签挑取单个菌（4）摇床上摇菌（时间大于8h）准备：离心管、牙签、镊子、LB+抗生素八、八、
8、蓝白斑筛选原理蓝白斑筛选原理 蓝白斑筛选-筛选重组子：根据载体的遗传特征筛选重组子，如-互补、抗生素基因等。 现在许多载体都含有一个大肠杆菌DNA的短区段，其中有-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS）。 受体菌则含编码-半乳糖苷酶C端aa的序列。当外源基因插入时，二者溶为一体后，有-半乳糖苷酶表达，在生色底物5-溴-4-氯-3吲哚-D-半乳糖苷（X-gal）培养基中形成蓝色菌落。 而当有外源基因插入到多克隆原点，从而造成插入失活，而使lacZ基因不表达而形成白色菌斑。通过颜色不同而区分重组子和非重组子。 蓝白斑筛选：（1
9、）未转化的菌不具有抗性，不生长；（2）转化了空载体，即未重组质粒的菌，长成蓝色菌落；（3）转化了重组质粒的菌，即目的重组菌，长成白色菌落。九、菌液九、菌液PCRPCR验证验证 加样： easy buffer:2.5l样数 DNTP：1.5l样数 M13R:1l样数 M13F:1l样数 easy Taq:0.2ll样数 混匀、离心 分装样品 跑电泳 跑PCR 混匀、离心 加菌液1l l（酒精灯前）（酒精灯前）电泳图电泳图：感谢您的阅览感谢您的阅览【此课件下载后可自行编辑修改此课件下载后可自行编辑修改此课件下载后可自行编辑修改此课件下载后可自行编辑修改关注我关注我关注我关注我每天分享干货每天分享干货每天分享干货每天分享干货】16
