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1、优化ESI和APCI进行在线LC/MS分析溶液化学课程1 1pptppt课件课件. .在这一部分，你将学习：n n什么类型的样品最适合电喷雾和APCI。n n流动相的pH值和离子添加剂如何影响电喷雾和APCI模式的离子化。n n对APCI如何选择离子对试剂和缓冲液。n n当使用挥发性缓冲液TFA Fix时如何克服离子抑制。2 2pptppt课件课件. .含杂原子的样品通过引入可接受一个电荷的化合物在溶液中是多电荷的样品在溶液中是离子的化合物适用于热喷雾的样品当不能引入电荷时避免极其非极性的样品适合电喷雾的样品3 3pptppt课件课件. .影响电喷雾离子化的因素n n溶液的化学性质溶液的化学性
2、质n n流速流速n n样品样品pKpKa an n溶液溶液pHpHn n溶液导电性溶液导电性n n针的设置针的设置n n内部针的位置内部针的位置n n针的状况针的状况n n喷雾压力喷雾压力n n高电压电极高电压电极n n毛细管和喷雾室电压设置毛细管和喷雾室电压设置n n毛细管和喷雾室高压的条件毛细管和喷雾室高压的条件n n绝缘体的条件绝缘体的条件4 4pptppt课件课件. .电喷雾要求在溶液中预先形成离子溶液化学性质5 5pptppt课件课件. .正离子检测：正离子检测：碱性样品（例如，含有精氨酸和/或赖氨酸的多肽）降低pH乙酸pH (3-4)甲酸pH (2-3)三氟乙酸(TFA)pH (1
3、-2)pH至少低于样品pKa2个单位负离子检测：负离子检测：酸性样品（例如，含有天冬氨酸和/或冬氨酸的多肽）增加pH（氢氧化铵）pH至少高于样品pKa2个单位中性样品：阳离子化，电荷交换，中性样品：阳离子化，电荷交换，APCI（以后讨论）离子检测极性和pH选择的一般规则ESI6 6pptppt课件课件. .pH影响溶菌酶（ MW 14306 ）7 7pptppt课件课件. .溶液中离子的形成：负离子检测8 8pptppt课件课件. .API-MS添加剂pH乙酸，甲酸，TFA，氢氧化铵一般的缓冲液一般的缓冲液/离子配对试剂离子配对试剂乙酸铵/甲酸铵三氟乙酸 (TEA)七氟丁酸 (HFBA)四乙基
4、或四丁基氢氧化铵 (TBAH)阳离子化试剂阳离子化试剂20-50 mM的乙酸钠或乙酸钾一般考虑一般考虑挥发性（污染喷雾室，堵塞喷嘴）导电性（对离子气化过程减少小液滴的形成）离子配对（进入气相时中和预带电离子）不能使用在不能使用在HPLC中常使用的磷酸盐，硫酸盐或硼酸盐中常使用的磷酸盐，硫酸盐或硼酸盐9 9pptppt课件课件. .使用挥发性离子对试剂典型的离子对试剂形成离子配对络合物变成不挥发物。 不挥发的物质不能离子化。 使用挥发性离子对试剂。离子化取决于分析物，离子对试剂和离子化模式TIC1010pptppt课件课件. .正离子ESI模式中的离子对试剂因为在ESI过程中不挥发性离子对阻碍了
5、分析物从液滴中逸出，HAS对所有分析物都会严重抑制。挥发性离子对试剂（ VA和PFHA ）的存在使降肾上腺素得到提高。1111pptppt课件课件. .挥发性缓冲液浓度对ES信号的影响ESI0.00E+006.00E+061.20E+07050100150200250300350Concentration (mM)AreaReserpineCaffeinen nESIESI：在较高缓冲液浓度时，由于离子配对的原因，分析在较高缓冲液浓度时，由于离子配对的原因，分析物从液滴中逸出较困难。如咖啡因这样的较小的分子，物从液滴中逸出较困难。如咖啡因这样的较小的分子，在离子化过程的早期被解吸。在离子化过程
6、的早期被解吸。1212pptppt课件课件. .缓冲液对ESI信号的影响流动相条件：流动相条件：8%甲醇在甲醇在 (B) 0.2%乙酸；乙酸；(C) 50 mM磷酸铵；或磷酸铵；或(D) 50 mM磷酸钠中磷酸钠中0.E+001.E+062.E+063.E+064.E+065.E+066.E+067.E+06AreaBCD正离子模式正离子模式LincomycinSulfachlorapyr.Caffeine0.E+005.E+031.E+042.E+042.E+04AreaCD负离子模式负离子模式LincomycinSulfachlorapyr.1313pptppt课件课件. .min0.51
7、1.522.5Injection #1Injection #300Injection #5000100002000030000400005000060000Abundance用不挥发性盐基体，进样635次后的ESI信号ESI Signal Relative to UV Signal01020304050600200400600800MS Amount/UV Amountn n在信号中最初的衰减可能是由于不导电层沉积在电极上在信号中最初的衰减可能是由于不导电层沉积在电极上导致电场强度的变化，这个不导电层形成后，信号就稳导致电场强度的变化，这个不导电层形成后，信号就稳定了。定了。n n与与APCI
8、APCI源中看到的白色粉末相反，在喷射防护屏上看到源中看到的白色粉末相反，在喷射防护屏上看到的棕色物质，这可能是来自于平衡的盐溶液中的葡萄糖。的棕色物质，这可能是来自于平衡的盐溶液中的葡萄糖。1414pptppt课件课件. .不适合的流动相：不适合的流动相：甲苯苯苯乙烯烃CCl4CS2环烃在不同比例乙腈中青霉素的响应1515pptppt课件课件. .对比对比TFA，使用使用HOAc的流动注射的流动注射 为什么需要挥发性缓冲液TFA Fix？1616pptppt课件课件. .标准标准M+H+ + CF3COO- M+H CF3COO (有利)与酸根阴离子成强离子对TFA Fix依据挥发性（蒸馏法
9、）溶液RCOOH（丙酸）代替CF3COOH。RCOOH柱后添加（例如， 20%酸, 80%异丙醇，流速0.1mL/min。M+H+ + RCOO- M+H RCOO (有利)与丙酸成弱离子对何时进行工作：何时进行工作：bp 弱离子对离子 bp 强离子对离子例如， bp 丙酸 bp HFBA TFATFA Fix1717pptppt课件课件. .信号增强（在最后溶液中20% ）气味小为什么用丙酸？1818pptppt课件课件. .在在IPA中中75%丙酸的丙酸的1:2柱后添加柱后添加用优化的TFA Fix 100%水相，信号增强1919pptppt课件课件. .丙酸的柱后添加，改善使用25 mM
10、 HFBA分离的b-内酰胺的响应2020pptppt课件课件. .电喷雾中的阳离子具有键合质子倾向的中性分子会与铵或碱金属离子具有键合质子倾向的中性分子会与铵或碱金属离子形成加合离子形成加合离子例如;甲醇碳水化合物加入乙酸铵或乙酸钠缓冲液便于离子化。加入乙酸铵或乙酸钠缓冲液便于离子化。2121pptppt课件课件. .通过柱后添加对电喷雾产生最佳的化学效果2222pptppt课件课件. .LC溶剂的柱后修正以优化API-MS响应(1)pH调节优化正或负离子检测。(2)加入异丙醇有助于水溶剂的去溶剂化和稀释离子缓冲液，获得满意的API-MS性能。(3)柱后添加乙酸钠（ 50 mM ）有助于样品的
11、阳离子化（用于缺少或具有弱质子化位置的样品）。 *(4) 使用“TFA FIX”提高多数离子的灵敏度。 *(5)增加流速得到适合ES的离子流（例如，对毛细管电泳分离）。(6)降低流速得到适合ES的操作（例如，制备LC）。(7)衍生化以提高电喷雾灵敏度，例如，阳离子类、胺。2323pptppt课件课件. .小分子，极性到非极性含杂原子的样品适合于离子束的样品（具相当的挥发性）和大部分适合于热喷雾的样品避免典型的在溶液中带电荷的样品 避免非常热不稳定或光敏的样品适合APCI的样品2424pptppt课件课件. .关键参数关键参数离子化离子化气相 CI质子化（例如， H3O+ ）（碱）电荷交换去质子
12、化（酸）电子捕获（卤素，芳族化合物）探针温度探针温度较高温度利于去溶剂化和气化样品。太高温度导致样品分解。通常：通常：使用高纯水和有机溶剂。在APCI中甲醇是比乙腈好的选择。APCI2525pptppt课件课件. .Compound Number10050Relative Intensity10050400 C200 CP enicillin GC lo xa cillinT etrac yclineSulfam e tha zineSu lfa m ethizo leAm ino C hlo roben za m ideV itam in D3M eth yle ne B lueFu ro
13、se m ideS pe ctinom y cinG en tam icinS trep to ny cinD isperse O ra n ge 13Ba sic Y e llo w 2B as ic V io let 1 0D is pe rse Blue 31P e nicillin G2C lo xa cillin3T etra cycline4S ulfam ethazine5Su lfam e th izo leAm ino C hloroben zam id e67Vitam in D38M ethyle ne B lue9Fu rose m ide10S pectin o m
14、ycin11G e n tam ic in12Strepto nycin13D isp erse O ran ge 1 314B a sic Y ellow 215B asic Violet 1016D ispe rse Blue 3APCIElectrosprayAPCI蒸发温度2626pptppt课件课件. .挥发性缓冲液浓度对APCI信号的影响APCI0.E+005.E+061.E+072.E+072.E+07050100150200250300350Concentration (mM)AreaReserpineCaffeinen nAPCIAPCI：乙酸钠最初有助于利血平质子的转移，增
15、加乙酸钠最初有助于利血平质子的转移，增加“ “挥挥发性盐发性盐” ”的浓度，使有效挥发分析物更困难。咖啡因是的浓度，使有效挥发分析物更困难。咖啡因是比利血平更弱的碱，氨会争夺质子。比利血平更弱的碱，氨会争夺质子。2727pptppt课件课件. .流动相条件：流动相条件：8%甲醇在甲醇在(A)水；水；(B) 0.2%乙酸；乙酸；(C) 50 mM磷酸铵；或磷酸铵；或(D) 50 mM磷酸钠中磷酸钠中不挥发缓冲液对APCI信号的影响0.E+001.E+062.E+063.E+064.E+06AreaABCD正离子模式正离子模式LincomycinSulfachlorapyr.Caffeine0.E
16、+001.E+052.E+053.E+054.E+055.E+05AreaABCD负离子模式负离子模式LincomycinSulfachlorapyr.Caffeine2828pptppt课件课件. .AbundancemAU1020 sulfa in water sulfa in water sulfa in water sulfa in HBSS sulfa in HBSS sulfa in HBSS5000010000015000020004000min12340UVEIC, m/z 285TICScan modeSignal suppression! 在有盐在有盐在有盐在有盐存在时氯吡
17、嗪磺胺的信号被抑制！存在时氯吡嗪磺胺的信号被抑制！存在时氯吡嗪磺胺的信号被抑制！存在时氯吡嗪磺胺的信号被抑制！用APCI做氯吡嗪磺胺的流动注射分析2929pptppt课件课件. .600次盐溶液进样后的APCI喷雾室完全流入喷雾室进行分析注意毛细管的入口是清洁的完全流入喷雾室进行分析注意毛细管的入口是清洁的3030pptppt课件课件. .min0.511.522.5050000100000150000200000250000300000350000AbundanceInjection #1Injection #300Injection #600600次盐溶液进样后的APCI信号APCI Si
18、gnal Relative to UV Signal01020304050600100200300400500600Injection #MS Amount/UV Amountn n信号中最初的不稳定可能是由于当盐沉积在源里时，信号中最初的不稳定可能是由于当盐沉积在源里时，电场的变化引起的。电场的变化引起的。n n当盐的薄层形成后，信号就稳定了，显示出稳定的当盐的薄层形成后，信号就稳定了，显示出稳定的衰减流速。衰减流速。3131pptppt课件课件. .600次带有自动转换的进样后的APCI喷雾室进样后流动转向废液进样后流动转向废液1分钟合喷雾室干净得多分钟合喷雾室干净得多3232pptppt
19、课件课件. .在APCI模式中离子对试剂对LC/MS分析的影响对降肾上腺素（挥发性很好的分析物）， VA和PFHA作为强的气相酸有助于离子化过程。HAS不会提高信号，因为它不挥发。MGBG强烈离子配对，表现出极大地降低响应。 3333pptppt课件课件. .灵敏度如果样品用两种技术都可以离子化，电喷雾通常较灵敏，且背景噪音低。基质和流动相影响电喷雾对样品和溶剂基质比APCI更灵敏（例如，信号抑制）相对于APCI，电喷雾要求较低的挥发性缓冲液浓度有机溶剂选择极大地影响APCI的离子化流速电喷雾在低流速（750 L/min），APCI比电喷雾更灵敏，且具有低噪音电喷雾和APCI的比较3434pp
20、tppt课件课件. .参考文献会议 美国质谱协会： www.asms.orgMontreux LC/MS专题研讨会： 点击Montreux LC/MS书籍电喷雾离子化质谱：基础，仪器和应用，RichardCole,JohnWileyandSons编(ISBN#0-471-14564-5)，1997.LC/MS综述，RossWilloughby,EdwardSheehan,SamMitrovich,GlobalViewPublishing(ISBN#0-9660813-0-7)Pittsburgh，PA，1998.液相色谱质谱法（第二版），W.M.A.Niessen,MarcelDekkerPublishing(ISBN#0-8247-1936-0)，1999.3535pptppt课件课件. .此课件下载可自行编辑修改，供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！
