第十一章 DNA文库的构建和目的基因的筛选Construction of DNA Library and Screening of Target Gene1 定义和分类•基因文库指某个生物的基因组DNA或cDNA片段与适当的载体在体外通过重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落（或噬菌体），所有菌落或噬菌体的集合•按照外源DNA片段的来源，可将基因文库分为：基因组DNA文库（genomic DNA library）和cDNA文库（complementary DNA library）•基因组文库：分离特定的基因、分析特定基因的结构、研究基因的起源与进化、基因的表达调控•cDNA文库：大规模基因测序、发现和寻找新基因、基因注释、基因表达谱分析、基因功能研究2 DNA文库构建的基本程序•1、提取研究对象基因组DNA，制备合适大小的DNA片段，或提取组织或器官的mRNA并反转录成cDNA ；•2、DNA片段或cDNA与经特殊处理的载体连接形成重组DNA；•3、重组DNA转化宿主细胞或体外包装后侵染受体菌；•4、阳性重组菌落或噬菌斑的选择3 目标基因筛选方法•表型筛选法•杂交筛选和 PCR 筛选•免疫筛选法•酵母双杂交系统筛选4 第一节第一节 基因组基因组 DNA DNA 文库的构建文库的构建•定义：指将某生物体的全部基因组 DNA 用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的 DNA 片段，与合适的载体体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落。
5 文库的代表性和随机性•代表性是指文库中所有克隆所携带的DNA片段重新组合起来可以覆盖整个基因组，即可以从该文库中分离任何一段DNA•引用两个策略：•一是采用部分酶切或随机切割的方法来消化染色体DNA，以保证克隆的随机性，保证每段DNA在文库中出现的频率均等；•二是提高文库所含基因组DNA的总容量，通常用覆盖基因组的倍数来衡量文库的总容量由外源片段的平均长度和重组克隆的数量共同决定6 •为预测一个完整基因组文库应包含克隆的数目，Clark和Carbon于1975年提出如下的计算公式：N=ln（1-p）/ln（1-f）•N：代表一个完全基因组文库所应该包含的重组克隆个数 p：表示所期望的目的基因在文库中出现的几率 f：表示重组克隆平均插入片段的大小和基因组DNA大小的比值7 •哺乳动物：3*109bp 若p=99%，平均克隆片段长度20kb f=20kb/3*107kb N=690773.2•E.Coli：4639221kb p=99%，f=20kb/4600kb N=1056.9 p=99%，f=10kb/4600kb N=21168 载体的选择载体的选择•构建大片段基因组DNA文库使用的载体主要有λ噬菌体（λphage）、粘粒载体（cosmid）、细菌人工染色体（Bacterial Artificial Chromosomes, BAC）、酵母人工染色体 YAC（Yeast Artificial Chromosomes, YACs）、 P1 （Bacteriophage P1）和 PAC 。
•根据特征，这些载体可以分为两类: •一类是基于噬菌体改建的，利用了噬菌体的包装效率高和杂交筛选背景低的优点； •另一类经改造的质粒载体或人工染色体，其主要优点在于可容纳超过 100kb 以上的外源片段9 基因组基因组DNADNA文库的构建流程文库的构建流程 •基因组DNA文库的构建程序包含5个部分：•① 载体的制备；•② 高纯度大分子量基因组DNA（High Molecular Weight DNA, HMW DNA）的提取；•③ HMW DNA的部分酶切与脉冲电泳分级分离（PFGE size selection）；•④ 载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞；•⑤ 重组克隆的挑取和保存10 11 •1 1、基因组、基因组DNADNA文库的载体制备文库的载体制备• 载体的好坏是影响连接成功与否的关键，载体的制备要求两点，一是纯度高；二是去磷酸化好 •2 2、高质量大分子量基因组、高质量大分子量基因组DNADNA的提取和部分的提取和部分酶切酶切 构建不同大小插入片段的基因组文库对 DNA 质量要求不同，一般所提取的 DNA 分子量至少应该是文库最终平均插入片段长度的 3～5 倍。
实践表明，提取的基因组 DNA 分子量越大，所得到的重组克隆的插入片段越大12 •3 3、文库的连接转化或包装侵染、文库的连接转化或包装侵染 一般在构建大片段基因组 DNA 文库时，大量连接前都要先使用小体系连接来寻找最适的比例 在电转化和包装侵染过程中，首先最好选择转化效率高的进口感受态细胞或效价高且质量稳定的包装蛋白，同时，研究表明对连接产物进行脱盐处理也可以明显地提高其效率•4 4、文库的质量检测、文库的质量检测 文库的质量是由文库所含克隆的数目、平均插入片段的长度、插入效率、基因组覆盖度和覆盖倍数等因素所决定的 在文库的质量检测中，除了克隆子数目是可以确定的，其它值都是估算的13 •基因组覆盖倍数的计算方法一般包括两种：•一是公式计算法，基因组覆盖倍数＝平均插入片段长度×克隆数/基因组 DNA 的长度（一般是约数）；•另一种算法是结合基因组覆盖度的检测来进行的•基因组覆盖度是指文库中的克隆覆盖基因组的范围，检测时是通过选择一定数目的已知的单拷贝的基因作探针来筛选文库由于所使用的每个探针筛选的克隆数目即表明文库中对该基因位点的覆盖倍数，因此，基因组覆盖倍数又等于所有探针筛选到的阳性克隆的总个数/使用的总探针数的比值。
14 亚基因组文库的构建15 16 17 18 基因组基因组DNADNA文库克隆子的保存文库克隆子的保存•1、影印滤膜保存法影印滤膜保存法19 •2、文库在液体培养基中扩增保存文库在液体培养基中扩增保存•方法：从琼脂平板上挑取已长出的克隆子转入含方法：从琼脂平板上挑取已长出的克隆子转入含适当的抗生素培养基中，混合的细菌生长数代后，适当的抗生素培养基中，混合的细菌生长数代后，其培养物于其培养物于-70 -70 o oC C储存（加终浓度为储存（加终浓度为25%25%的甘油）的甘油）•缺点：因文库菌落生长的不均匀性而导致文库中缺点：因文库菌落生长的不均匀性而导致文库中某些特定的序列过多或过少某些特定的序列过多或过少•3 3、、保存单个克隆子于含有甘油的培养基中保存单个克隆子于含有甘油的培养基中•方法：从平板上挑选单个克隆子接种于合适的含方法：从平板上挑选单个克隆子接种于合适的含抗生素的培养基中，菌体生长到一定浓度后，加抗生素的培养基中，菌体生长到一定浓度后，加入终浓度为入终浓度为25%的甘油，于的甘油，于-70 oC或或-25 oC下保存•缺点：需保存的克隆子数过多，工作量大缺点：需保存的克隆子数过多，工作量大20 第二节第二节 cDNA cDNA 文库的构建文库的构建•定义：是指将某种生物体基因组转录的全部mRNA经反转录产生的cDNA片段分别与克隆载体重组，储存于某种受体菌中，该群体就称该生物基因组的cDNA文库。
•cDNA(complementary DNA，互补DNA)：是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的互补DNA21 •cDNA 文库的构建共分四步：•第一，细胞总 RNA 的提取和 mRNA 分离；•第二，第一链 cDNA 合成；•第三，第二链 cDNA 合成；•第四，双链 cDNA 克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖22 23 RNA 的分离的分离•cDNA 文库构建是以 mRNA 为起始材料的， mRNA 在总 RNA 中所占比例很小，因此从总 RNA 中富集 mRNA 是构建 cDNA 文库和其它应用所必需进行的步骤通过降低 rRNA 和 tRNA 含量，可大大提高筛选到目标基因的可能性•目前纯化 mRNA 的方法都是在固体支持物表面共价结合固定一段由脱氧胸腺嘧啶核苷组成的寡聚核苷酸[ oligo（dT）]链，由它与 mRNA 的 Poly（A）尾巴杂交，从而吸附固定住 mRNA ，进而将 mRNA 从其它组分中分离出来的24 •1、mRNA的来源:•选用mRNA含量高的组织材料，或通过药物等方法提高mRNA的含量•2、mRNA完整性的检测•1)mRNA分子的大小： 哺乳动物mRNA长度为500-8000bp，大部分mRNA位于1.5-2.0kb之间.•2)总mRNA指导合成cDNA第一链长分子的能力。
•3)指导合成高分子量蛋白质的能力，指导合成目的多肽的能力25 •3、 mRNA在细胞中的丰度•1) 高丰度mRNA•目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA量的50-90%,如珠蛋白，免疫球蛋白，卵清蛋白，该类mRNA在合成和克隆cDNA之前不需进一步纯化特定mRNA •2) 低丰度mRNA•目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA量的0.5%以下26 •4、 mRNA的富集方法•典型的哺乳动物细胞含有10,000-30,000种不同的mRNA分子,某些mRNA分子在细胞内的拷贝数很低甚至只有一个拷贝27 1) 按大小对mRNA进行分级分离•通过琼脂糖凝胶电泳分离大小不同的mRNA分子，该方法的分离效果最好，但从凝胶中回收的得率较低.•蔗糖梯度离心：加入破坏RNA二级结构的变性剂如氢氧化甲基汞等，再进行蔗糖梯度离心以分离不同分子量的mRNA.2) cDNA的分级分离•mRNA通过反转录形成cDNA，在插入到克隆载体前，通过琼脂糖凝胶电泳，将不同大小的cDNA分子分离开来• 优 点：•a）避免了分离过程中mRNA被污染的RNA酶降解•b）增加了获得全长cDNA克隆的概率•c）获得更准确的分级分离效果（分子量）28 •3）多聚核糖体免疫学纯化法•使用抗体来纯化合成目的多肽的多聚核糖体。
将正在合成的新生多肽链的多聚核糖体结合到免疫亲和柱（A蛋白-Sepharose柱）上，随后用EDTA将多聚核糖体解离下来，并通过Oligo(dT)层析分离mRNA, 利用该方法可将目的mRNA纯化数千倍目的mRNA在细胞中的含量可为数十拷贝29 30 第一链cDNA的合成Øoligo(dToligo(dT) )引导的引导的DNADNA合成法：合成法：•利用真核利用真核mRNAmRNA分子所具有的分子所具有的poly(A)poly(A)尾巴的特尾巴的特性，加入性，加入12-2012-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dToligo(dT) )短片段，由反转录酶合成短片段，由反转录酶合成cDNAcDNA的第的第一链•缺陷：缺陷：cDNAcDNA 末端存在较长的末端存在较长的 polypoly（（A A））而影响而影响 cDNAcDNA 测序；测序；因为逆转录酶无法到达因为逆转录酶无法到达mRNAmRNA分子分子的的5’5’－末端，必须从－末端，必须从3’3’－末端开始合成－末端开始合成cDNA对于大分子量的较长的对于大分子量的较长的mRNAmRNA分子而言，特别麻分子而言，特别麻烦。
烦31 mRNA32 Ø随机引物引导的随机引物引导的cDNA合成法合成法 (randomly primed cDNA synthesis) ： 根据许多可能的序列，合成出根据许多可能的序列，合成出6-10个核苷酸长个核苷酸长的寡核苷酸短片段（混合物），作为合成第一链的寡核苷酸短片段（混合物），作为合成第一链cDNA的引物在应用这种混合引物的情况下，的引物在应用这种混合引物的情况下，cDNA的合成可以从的合成可以从mRNA模板的许多位点同时发模板的许多位点同时发生，而不仅仅从生，而不仅仅从3’-末端的末端的oligo(dT)引物一处开始引物一处开始 随机引物随机引物 cDNA 合成的方法不适合构建合成的方法不适合构建 cDNA 文库，文库，一般用于克隆特定一般用于克隆特定 mRNA 的的 5' 末端，如末端，如 RT-PCR 和和 5'-RACE 33 第二链第二链cDNAcDNA的合成的合成•cDNAcDNA第二链的合成就是将上一步形成的第二链的合成就是将上一步形成的mRNA-cDNAmRNA-cDNA杂合双链变成互补双链杂合双链变成互补双链cDNAcDNA的的过程。
过程•cDNAcDNA第二链的合成的方法大致第二链的合成的方法大致4 4种：种： 自身引导合成法、置换合成法、引导合 自身引导合成法、置换合成法、引导合成法、引物－衔接头合成法成法、引物－衔接头合成法34 •1 1）自身引导合成法：）自身引导合成法：•获得的单链获得的单链cDNA3’cDNA3’端会形成发夹结构的能力，以此端会形成发夹结构的能力，以此作为第二链合成的引物，在大肠杆菌聚合酶作为第二链合成的引物，在大肠杆菌聚合酶I I KlenowKlenow或反转录酶的作用下，合成或反转录酶的作用下，合成cDNAcDNA的第二链的第二链再利用再利用 S1 S1 核酸酶将连接处（仅该位点处为单链结核酸酶将连接处（仅该位点处为单链结构）切断形成平端结构可以进行连接构）切断形成平端结构可以进行连接•缺点：缺点：在以在以S1S1核酸酶切割核酸酶切割cDNAcDNA的发夹状结构时，会的发夹状结构时，会导致对应于导致对应于mRNA 5’mRNA 5’端的地方的序列出现缺失和重端的地方的序列出现缺失和重排 S1S1核酸酶的纯度不够时，会偶尔破坏合成的双核酸酶的纯度不够时，会偶尔破坏合成的双链链cDNAcDNA分子。
分子35 36 •2 2）置换合成法）置换合成法：获得的双链：获得的双链cDNA 5’cDNA 5’端也会有几端也会有几对碱基缺失对碱基缺失•原理：•以第一链合成产物cDNA：mRNA杂交体作为切口平移的模板，RNA酶H在杂交体的mRNA链上造成切口和缺口，产生一系列RNA引物，在大肠杆菌DNA聚合酶I 的作用下合成cDNA的第二链37 优点：优点：a a））合成合成cDNAcDNA的效率高的效率高 b b））直接利用第一链的反应产物，不需纯化直接利用第一链的反应产物，不需纯化 c c））避免使用避免使用S1S1核酸酶来切割双链核酸酶来切割双链cDNAcDNA38 •3 3）引导合成法：）引导合成法：获得的双链获得的双链cDNA cDNA 能保留完整的能保留完整的5’5’端序列端序列•首先是制备带有Poly（dT）的载体片段Ⅰ和一端带有Poly（dG）的片段Ⅱ，并用片段Ⅰ来代替Oligo（dT）进行cDNA第一链的合成，在第一链cDNA合成后直接采用末端转移酶（TdT）在第一链cDNA的 3'-端加上一段Poly（dC）的尾巴，同时进行酶切创造出另一端的粘端，与片段Ⅱ一起形成环化体，这种环化了的杂合双链在RNA酶H、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ和DNA连接酶的作用下合成与载体联系在一起的双链cDNA 。
•主要特点：合成全长cDNA的比例较高，但操作比较复杂，形成的cDNA克隆中都带有一段Poly（dC）/（dA），对重组子的复制和测序都不利39 40 •4 4）引物）引物- -衔接头法衔接头法：引导合成法改进而来：引导合成法改进而来•第一链合成后直接采用末端转移酶（第一链合成后直接采用末端转移酶（TdTTdT））在第一在第一链链 cDNA cDNA 的的 3'- 3'-端加上一段端加上一段 PolyPoly（（dCdC））的尾巴，然的尾巴，然后用一段带接头序列的后用一段带接头序列的 PolyPoly（（dGdG））短核苷酸链作引短核苷酸链作引物合成互补的物合成互补的 cDNA cDNA 链，接头序列可以是适用于链，接头序列可以是适用于 PCR PCR 扩增的特异序列或用于方便克隆的酶切位点的序列扩增的特异序列或用于方便克隆的酶切位点的序列这一方法目前已经发展成这一方法目前已经发展成 PCR PCR 法构建法构建 cDNA cDNA 文库的文库的常用方法常用方法41 42 双链双链cDNAcDNA克隆进质粒或噬菌体载克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖体并导入宿主中繁殖•cDNA末端的处理–由于大片段的平末端连接效率非常低，因此为了避免用平末端与载体连接，对双链cDNA的末端进行加工是十分必要的–方法：添加特异性核酸接头以形成适合于克隆的黏性末端–末端转移酶—可以向cDNA末端加上与克隆载体末端互补的尾部43 44 •双链双链cDNAcDNA的克隆：的克隆： 双链平头的双链平头的cDNAcDNA通常可以使用下列三种方法通常可以使用下列三种方法克隆入载体中：克隆入载体中：•1>1>平头末端直接与载体连接，但插入的片段无平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收法回收•2>2>平头两端分别接同聚物尾，最好是平头两端分别接同聚物尾，最好是ATAT同聚物同聚物尾，这样重组分子可通过加热局部变性和尾，这样重组分子可通过加热局部变性和S1S1核核酸酶处理回收插入片段酸酶处理回收插入片段•3>3>加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收收45 46 47 cDNA 文库构建的其它类型 •1、均一化 cDNA 文库 •它是指某一特定组织或细胞的所有表达基因均包含其中，且在 cDNA 文库中表达基因对应的 cDNA 的拷贝数相等或接近。
•均一化 cDNA 文库是克服基因转录水平上巨大差异给文库筛选和分析带来障碍的有效措施，有利于研究基因的表达和序列分析 48 •现在，在构建均一化的 cDNA 文库中至少有2种主要的观点： •一种是基于基因组 DNA 在拷贝数上具有相对均一化的性质，通过 cDNA 与基因组 DNA 饱和杂交而降低在文库中高拷贝存在的 cDNA 的丰度；•另一种是基于复性动力学的原理，高丰度的 cDNA 在退火条件下复性的速度快，而低丰度的 cDNA 复性要很长时间，从而可以通过控制复性时间来降低丰度 49 •均一化 cDNA 文库具有以下4方面的优点：•第一，在经济上具有广泛的应用空间，可以节约大量试验成本•第二，增加克隆低丰度 mRNA 的机会，适用于分析各种发育阶段或各种组织的基因表达及突变检测•第三，与原始丰度的 mRNA 拷贝数相对应的 cDNA 探针与均一化的 cDNA 文库作杂交，可以估计出大多数基因的表达水平及发现一些组织特异的基因而以往的文库构建，忽略了 mRNA 丰度的影响•第四，可以用于遗传图谱的制作和进行大规模的原位杂交，作为优化的文库系统还可以用于大规模的测序或芯片制作等研究。
50 •2、 差减 cDNA 文库 (Subtractive cDNA library) •差减文库也称扣除文库，扣除杂交法的本质是除去那些普遍共同存在的、或是非诱发产生的cDNA序列，从而使欲分离的目的基因的序列得到有效的富集，提高了分离的敏感性 •抑制性扣除杂交基本原理：SSH技术利用抑制性PCR能选择性扩增不同丰度差异基因和cDNA 消减杂交特点,运用杂交二级动力学原理（即高丰度序列退火时产生同源杂交的速度大于低丰度序列）,使原本不同丰度的DNA序列相对含量趋于一致然后利用抑制性PCR特点,两端接上同一接头的非目的基因片段由于具有反向重复序列,在退火时容易形成发夹互补结构,在PCR中不能作为模板与引物配对扩增,从而选择性扩增目的基因而抑制非目的基因片段扩增消减杂交扣除了实验组和对照组之间同源序列,再结合抑制性PCR的动力学富集,实现高效分离低丰度特异性非同源片段 51 52 基因组DNA文库与cDNA文库的比较53 基因组DNA文库的优点相对于相对于cDNAcDNA文库，基因组文库的优点：文库，基因组文库的优点：•cDNAcDNA克隆只能反映克隆只能反映mRNAmRNA的分子结构，没有包括基因组的间的分子结构，没有包括基因组的间隔序列隔序列; ;•cDNAcDNA文库中，不同克隆的分布状态总是反映文库中，不同克隆的分布状态总是反映mRNAmRNA的分布状的分布状态，即：高丰度态，即：高丰度mRNAmRNA的的cDNAcDNA克隆，所占比例较高，分离基克隆，所占比例较高，分离基因容易；低丰度因容易；低丰度mRNAmRNA的的cDNAcDNA克隆，所占比例较低，分离基克隆，所占比例较低，分离基因困难；因困难；•从从cDNAcDNA克隆中，不能克隆到基因组克隆中，不能克隆到基因组DNA DNA 中的非转录区段序中的非转录区段序列，不能用于研究基因编码区外侧调控序列的结构与功能。
列，不能用于研究基因编码区外侧调控序列的结构与功能54 cDNAcDNA文库的主要优点文库的主要优点①①cDNAcDNA文库以文库以mRNAmRNA为材料，特别适用于某些为材料，特别适用于某些RNARNA病毒病毒等的基因组结构研究及有关基因的克隆分离等的基因组结构研究及有关基因的克隆分离②②cDNAcDNA文库的筛选比较简单易行文库的筛选比较简单易行③③每一个每一个cDNAcDNA文库都含有一种文库都含有一种mRNAmRNA序列，这样在目的序列，这样在目的基因的选择中出现假阳性的概率就会比较低，因此基因的选择中出现假阳性的概率就会比较低，因此阳性杂交信号一般都是有意义的，由此选择出来的阳性杂交信号一般都是有意义的，由此选择出来的阳性克隆将会含有目的基因阳性克隆将会含有目的基因④④cDNAcDNA文库可用于在细菌中能进行表达的基因的克隆，文库可用于在细菌中能进行表达的基因的克隆，直接应用于基因工程操作直接应用于基因工程操作⑤⑤cDNAcDNA克隆还可用于真核细胞克隆还可用于真核细胞mRNAmRNA的结构和功能研究的结构和功能研究55 cDNAcDNA克隆的主要的缺点克隆的主要的缺点•cDNAcDNA文库所包含的遗传信息要远远少于基因组文库所包含的遗传信息要远远少于基因组DNADNA文库，并且受细胞来源或发育时期的影响。
文库，并且受细胞来源或发育时期的影响•cDNAcDNA文库虽能反映文库虽能反映mRNAmRNA的分子结构和功能信息，的分子结构和功能信息，但不能直接获得基因内含子序列和基因编码区但不能直接获得基因内含子序列和基因编码区外大量调控序列的结构与功能方面信息外大量调控序列的结构与功能方面信息•在在cDNAcDNA文库中，相应于高丰度文库中，相应于高丰度mRNAmRNA的的cDNAcDNA克隆克隆所占的比例比较高，分离起来比较容易，而相所占的比例比较高，分离起来比较容易，而相应于低丰度应于低丰度mRNAmRNA的的cDNAcDNA克隆所占的比例则比较克隆所占的比例则比较低，因此分离也就比较困难低，因此分离也就比较困难56 第三节 基因克隆的筛选策略•表型筛选法•杂交筛选和 PCR 筛选•免疫筛选 •酵母双杂交系统筛选57 表型筛选法•表型筛选法是根据目的基因编码比较特殊的功能，并且其与载体作用可以在宿主菌（如大肠杆菌）中表达该基因，表现出其特殊的功能所决定的表型性状来，这样就很容易通过导入的基因带来新的功能或恢复其缺失的功能来确定目的基因 •表型特征一般要求是直接的形态学特征或比较容易检测的生化酶学的特征，比如营养缺陷型相关的基因和抗性基因（类似抗逆性基因）等。
•对于表型筛选法来说，其对所使用的宿主有相应的要求，宿主为不携带该种基因或是该基因的缺失突变体 58 •(1)抗药性筛选:这是利用载体DNA分子上的抗药性选择标记进行的筛选方法59 (2)(2)插入失活筛选法插入失活筛选法 经经过过上上述述抗抗药药性性筛筛选选获获得得的的大大量量转转化化子子中中既既包包括括需需要要的的重重组组子子，，也也含含有有不不需需要要的的非非重重组组子子为为了了进进一一步步筛筛选选出出重重组组子子，，可可利利用用质质粒粒载载体体的的双双抗抗药药性性进行再次筛选进行再次筛选60 (3)(3)显色反应选择法显色反应选择法( (α-α-互补法互补法) ) 将将含含有有β-β-半半乳乳糖糖苷苷酶酶基基因因（（LacZLacZ））的的调调控控序序列列和和氨氨基基端端（（N N端端））146146个个氨氨基基酸酸编编码码序序列列的的质质粒粒转转化化至至可可编编码码β-β-半半乳乳糖糖苷苷酶酶羧羧基基端端（（C C端端））部部分分序序列列的的宿宿主主细细胞胞中中，，可可使使各各自自无无活活性性的的片片段段实实现现互互补补，，融融为为一一体体，，产产生生具具有有酶酶学学活活性性的的蛋蛋白白，，从从而而使使转转化化的的宿宿主主菌菌在在含含有有IPTG/X-gal(IPTG/X-gal(异异丙丙基基- -β-D-β-D-硫硫代代半半乳乳糖糖苷苷/5-/5-溴溴-4--4-氯氯- -3-3-吲吲哚哚- -β-D-β-D-硫硫代代半半乳乳糖糖苷苷) )的的培培养养基基上上产产生生蓝蓝色色菌菌落落，，这种现象就称为这种现象就称为α-α-互补。
互补61 62 杂交筛选和杂交筛选和 PCR PCR 筛选筛选•当目标基因是未知功能的基因或一些不能在原核生物中表达的真核生物的基因，可以利用的可能只是该基因的部分序列、同源基因片段或不完整的蛋白质产物，此时就必须考虑其它的方法来筛选杂交筛选法是应用最为广泛的筛选目标基因克隆的一种方法 •用已知序列的基因的筛选保存于 384 孔培养板的大片段 DNA 文库时，还可以采用更加简单快捷的方法——混合池 PCR 筛选法63 列混合池行混合池64 免疫筛选免疫筛选•免疫筛选法和核酸杂交的方法类似，只是其使用的探针不是核酸，而是特异性的抗体•适合免疫杂交法筛选的外源基因首先要在宿主细胞中存在抗原蛋白的表达，用于筛选的 DNA 文库必须是表达文库，通常是原核生物的基因组 DNA 文库和真核生物的 cDNA 表达文库而且，所检测的对象为宿主中不编码的基因或宿主中缺失表达的基因•根据检测方法的不同，可以分为原位检测和免疫沉淀检测65 滤膜（固定抗原）滤膜（固定抗原）+66 免疫沉淀检测法免疫沉淀检测法菌落菌落沉淀素沉淀素67 酵母双杂交系统筛选•酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。
•典型的真核生物转录因子，如GAL4、GCN4等都含有二个不同的结构域：DNA结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)•前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录68 69 •这两个结合域将它们分开时仍分别具有功能，但不能激活转录，只有当被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的转录因子活性，并可激活上游激活序列（upstream activating sequence, UAS）的下游启动子，使启动子下游基因得到转录•单独的DB能和启动子结合，但是不能激活转录而不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能如酵母细胞的Gal4蛋白的DB与大肠杆菌的一个酸性激活结构域B42融合得到的杂合蛋白仍然可结合到Gal4结合位点并激活转录70 •双杂交系统的另一个重要的元件是报道株报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞最常用的是酵母细胞。
•酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: 〈1〉 易于转化、便于回收扩增质粒〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合71 •原理：•在以上研究的基础上，将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质Bait protein的基因构建在同一个表达载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白BD-Bait protein•将编码AD的基因和cDNA文库的基因构建在AD-LIBRARY表达载体上•同时将上述两种载体转化改造后的酵母，这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生GAL4，又不能合成LEU、TRP、HIS、ADE，因此，酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长当上述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的报告基因HIS、ADE、LACZ等，从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落72 73 酵母双杂交系统的优点•⑴ 作用信号是在融合基因表达后， 在细胞内重建转录因子的作用而给出的， 省去了纯化蛋白质的繁琐步骤•⑵检测在活细胞内进行， 可以在一定程度上代表细胞内的真实情况•⑶ 检测的结果可以是基因表达产物的积累效应， 因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。
•⑷ 酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库， 能分析细胞质、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白74 酵母双杂交系统局限性和存在的问题•⑴ 双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内， 而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等， 这些反应在核内无法进行 另外有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助，这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究；•⑵ 酵母双杂交系统的一个重要的问题是"假阳性"由于某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用， 使DNA结合结构域杂交蛋白在无特异激活结构域的情况下可激活转录另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域， 能与其他蛋白形成稳定的复合物， 从而引起报告基因的表达， 产生"假阳性"结果75 重组重组DNADNA导入宿主导入宿主的方式•转化•转导•转染•感染76 转化转化•1928， Grffith 在观察肺炎链球菌（Diplococcus pneumoniae）有毒株和无毒株在活体内的相互作用时发现：把加热杀死的 S 型菌株和活的 R 型菌株混合培养时，能从中分离出活的 S 型菌，并能继续传代。
•定义：来自一个细菌细胞（供体）的 DNA （片段）被另一个细胞（受体）所吸收（随后同受体染色体一起进行重组）77 •对 DNA 的吸收，仅在受体生长周期中的一个短暂阶段•能够吸收 DNA 的细胞，称作感受态细胞（competent cell）•在转化中有功能的 DNA 是 ds 或 ssDNA， 线状或环状78 •（一）CaCl2 转化法核心：目标细胞在 CaCl2·H2O 溶液中浸泡一段时间， 转化效率 107-109 cell/μgDNA E.coli: DH5α, TG1, XL-1Blue, JM105 （1）冰上 30min （2）热激 42℃ 90" （3）恢复 1～2min （4）复苏 37℃ 45-60 min79 •（二）原生质体转化法 protoplast适用于 G+ 细菌，特别是芽孢杆菌、酵母过程： （1）等渗环境下，脱细胞壁（溶菌酶、溶壁酶、蜗牛酶、纤维素酶、果胶酶） （2）细胞壁再生•（三）电转化法（electroporation）缓冲液：10% 甘油或蔗糖，含（或不含） Mg2+ 离子转化条件：2.5 KV/0.2cm80 转导（转导（transductiontransduction））•定义：由噬菌体将细菌基因由一个细菌（供体）转移到另一个细菌（受体）的过程。
•1、普遍性转导 （generalized transduction）：供体的单个或紧密连锁的少数几个基因被噬菌体因错误装配而转移给相应受体的现象•2、局限性转导 Specialized （or restricted） transduction）：只能使供体的一个或少数几个基因以噬菌体为媒介转移到受体的转导作用 81 转染（转染（transfection））•定义：感受态细胞经分离出来的噬菌体核酸所感染，随后能产生出正常噬菌体后代 82 感染（感染（infectioninfection））•定义：病原微生物在寄主组织内立足的状态如细菌的感染， Virus/phage 的感染83 概念比较 •转染：病毒核酸的转移 •转化：普通 DNA 的转移 •感染：病毒的侵染 •转导：强调转移方式84 其它转移方式•注射•基因枪•花粉管导入85 •显微注射：在显微镜下操作的微量注射技术可将细胞的某一部分(如细胞核、细胞质或细胞器)或外源物质(如外源基因、DNA片段、信使核糖核酸、蛋白质等)通过玻璃毛细管拉成的细针，注射到细胞质或细胞核内•优缺点：以显微注射法转外源基因没有长度上的限制，目前已证明数百kb的DNA片段均可以成功产生转基因动物。
其缺点是设备精密而昂贵、操作技术需要长时间的练习，以及每次只能注射有限的细胞 86 87 88 •基因枪：用火药爆炸或者高压气体加速将包裹了DNA的球状金粉或者钨粉颗粒直接送入完整的植物组织或者细胞中，这一加速设备称为基因枪•基本原理 ：经适当处理后，使DNA液均匀地吸附在或包裹于微小的钨粉或金粉颗粒表面，利用基因枪的火药爆炸、高压放电或高压气体作驱动力，发射出微弹与DNA的复合体，击中并高速穿透真空室中受体细胞的细胞壁及细胞膜，进入细胞内，从而达到将吸附于微弹上的外源DNA导入细胞或原生质体，获得整合与表达的目的微弹复合体对受体细孢造成的损伤可以修复 89 90 91 •1、什么叫基因工程（Gene Engineering），试从理论和技术两个方面谈谈 Gene Engineering 诞生的基础？ •2、试回答影响限制性内切核酸酶（Restriction endonuclease）切割效率的因素？ •3、何谓 Star activity？简述 Star activity 的影响因素及克服方法？ •4、何为载体？一个理想的载体应具备那些特点？ •5、何为α-complement？如何利用α-complement 来筛选插入了外源 DNA 的重组质粒？•6、用 λ 噬菌体载体进行 gene cloning 时，主要利用 λ 噬菌体的生物学特性作选择标记，其中有 cI 失活和 Spi 筛选，请问什么叫cI筛选？什么叫 Spi 筛选？ •7、琼脂糖凝胶电泳中，简述影响 DNA 在凝胶中迁移速率的因素？ •8、小量制备质粒 DNA ，用质粒中特定的酶切发现切割不动，试分析可能原因及克服方法？ 92 •9、Primer 是 PCR 反应体系的四大要素之一， PCR 的许多应用都是通过 primer 设计来实现的，请问 primer 设计的一般原则是什么？ •10、在 PCR 反应的后期，或者循环次数过多时，反应体系中就会出现一种所谓的平台效应（Plateau effect），请问什么叫 Plateau effect ？产生 Plateau effect 的原因有哪些？ •11、简述化学降解法测序的基本原理以及主要应用范围。
•12、何谓测序酶？与 Klenow 片段相比，它有何优点？ •13、简述以质粒为载体构建 Gene library 的基本步骤？ •14、基因克隆筛选的几种方法和相关的技术特征有哪些？ •15、基因组DNA文库有哪些类型?其相关的特点是什么？ •16、PCR 引物设计引入酶切位点时，为什么需在酶切位点后加上一些碱基？ •17、天然的质粒载体（plasmid vectors）通常需经改造后才能应用，包括去除不必要的片段，引入多克隆位点等试问在此过程中如何增减酶切位点？ 93 •18、当向细菌培养基中加入氯霉素时，可以使细菌质粒的拷贝数得到扩增，试分析其原理？ •19、抗性基因（Resistant gene）是目前使用的最广泛的选择标记，常用的抗生素抗性有哪几种？并举两例说明其原理？ •20、以 pUC18 系列为载体，外源基因经酶切和载体连接后，将其导入处于感受态的宿主细胞中，筛选菌落，设计一个实验证明外源基因能在宿主细胞中转录表达 •21、核酸分子的标记有哪些方法，各有何特点？ •22、通过双向蛋白质电泳发现某蛋白质与某植物的一种表型密切相关，若要利用编码该蛋白质的基因来转基因植物，试问如何分离得到该基因？ •23、构建大片段基因组文库过程中需要注意哪些问题？ •24、苏云金芽胞杆菌的基因组大小为 5×106bp，若 p＝99％ ，平均克隆片段为 100kb ，计算构建这样一个完全的基因文库所需的克隆数。
•25、克隆 cDNA 常见的问题？ 94 •26、如何理解 gene 及其产物的共线性和非共线性？ •27、什么是 gene cloning ？什么是亚克隆（subcloning）？ •28、用 T4 phage DNA polymerase 可进行末端标记，试简述其原理？ •29、简述 T4 多核苷酸激酶的活性和用途？ •30、均一化cDNA文库构建的基本原理是什么？ •31、DNA片段序列测定的策略有哪些？并简述其原理•32、Sanger酶法测序和焦磷酸测序技术的基本原理•33、以任意一种探针为例，说明实时定量荧光PCR原理95 •Gene manipulation •Isoschizomer , Isocaudiners , Site preferences •Plasmid incompatibility , α-complementation , Shuttle vector ，Vehicle ，Cosmid •Colony hybridization ，Dot hybridization ，Primer extension •Plateau effect ，Amplified fragment length polymorphism ，Random amplified polymorphic DNA ， Inverse PCR •Universal primer ，Random primer ，Primer walking •Genomic DNA library ，cDNA library ，Subtractive hybridization ，Two-hybrid system •Transformation ，Competent cell 96 。