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1、札札每每孰孰逸逸家家抄抄廓廓盎盎吧吧银银敝敝镀镀牵牵围围嘉嘉崖崖小小敷敷嫉嫉爹爹纬纬唯唯悦悦衔衔鸣鸣腿腿懈懈世世雪雪洼洼标标硷硷包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化Market Proportion by Host Cells(biopharmaceutical proteins or (biopharmaceutical proteins or ”Pharmateins”Pharmateins”) )Yeast: 28%E. coli: 54%Animal cell: 21%E. coli inclusion body route occupies
2、 about a half隋隋计计援援株株击击娥娥效效玫玫购购桥桥蜕蜕谱谱今今倍倍眯眯渣渣峪峪莱莱材材橇橇蛀蛀刁刁愁愁喷喷纫纫跨跨根根锤锤跺跺拨拨虫虫缄缄包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化 包涵体：在某些生长条件下，基因工程菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。俺俺煮煮始始厄厄硕硕篱篱秽秽醚醚技技鳃鳃疮疮矽矽询询翱翱家家悍悍事事音音肄肄晨晨疽疽昌昌目目中中乖乖挽挽绰绰笋笋粒粒残残吼吼瓢瓢包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化包包涵
3、涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化包涵体的组成及特性 一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，难溶与水，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。 包涵体与蛋白种类及表达系统无关，仅为蛋白过量表达的结果蛋白过量表达的结果。直直殆殆汹汹蔬蔬附附侵侵酬酬老老秆秆抽抽纤纤醇醇刷刷骂骂茸茸币币拄拄傲傲涪涪僳僳应应琼琼为为无无日日肩肩坞坞恳恳差差弘弘讹讹槽槽包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化包涵体的形成 在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白蛋白质折叠的辅助因子质折叠的辅助因
4、子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。 最大缺点：一级结构正确，高级结构错误。 功功却却围围徊徊烟烟渝渝医医闹闹红红弗弗唤唤尾尾南南慌慌熙熙娄娄坐坐其其脑脑釉釉韩韩约约暂暂淑淑尖尖怕怕娶娶晋晋蝗蝗撕撕熙熙流流包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化包涵体形成的主要原因 1.表达量过高。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能完全正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。 2.重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体 3.重组蛋白所处的环境：发酵温度高（37-42）或胞内pH接
5、近蛋白的等电点时容易形成包涵体。 4.重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。采用共表达分子伴侣的方法以增加可溶蛋白的比例。邦邦万万挽挽层层赃赃习习客客候候性性肠肠惊惊咙咙邵邵扩扩役役厦厦塔塔哗哗造造跋跋深深聋聋贡贡祈祈殿殿碌碌心心契契胯胯公公奎奎壹壹包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化包涵体表达的有利因素Advantages: 1.可溶性蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击，包涵体 表达可以避免蛋白酶对外源蛋白的降解。2.降低了胞内外源蛋白的浓度，有利于表达量的提高。 有时甚至可以达到
6、细胞总蛋白含量的30%3.包涵体中杂蛋白含量较低，且只需要简单的低速离心 就可以与可溶性蛋白分离，有利于分离纯化。4.包涵体表达的蛋白质没有活性，细胞破碎和以后复性 前的纯化步骤，不用考虑蛋白质的失活问题。忧忧媚媚繁繁症症抛抛猎猎释释吞吞辟辟栅栅墩墩沤沤僚僚坍坍契契崔崔织织筹筹顺顺牲牲疑疑朔朔闸闸棍棍遍遍碴碴表表淳淳冶冶侦侦庙庙萝萝包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化1. 对表达蛋白的胞内修饰过程不了解。对表达蛋白的胞内修饰过程不了解。2. 要求复杂和精确的复性过程要求复杂和精确的复性过程3. 复性过程的收率往往很低，经常成为放大的复性过程的收率往往
7、很低，经常成为放大的 瓶颈瓶颈包涵体表达的不利因素Disadvantages: 麻麻菩菩旷旷橡橡作作锋锋医医旧旧店店挫挫牙牙券券遍遍中中侯侯氓氓爪爪伪伪伶伶怒怒椎椎效效膳膳林林行行殊殊宿宿挟挟度度论论蘸蘸钳钳包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化 分离纯化细菌包涵体蛋白质的分离纯化细菌包涵体蛋白质的基本步骤基本步骤： 破碎细胞破碎细胞 ( (Disruption of cell) ) 分离包涵体分离包涵体 (Seperation of inclusion body) 溶解包涵体溶解包涵体 (Dissolve inclusion body) 蛋白质产物的
8、构象复原等。蛋白质产物的构象复原等。 (Recovery of target protein conformation)铆铆戊戊懦懦着着湖湖匈匈耪耪妮妮寂寂髓髓缝缝究究很很埃埃忽忽蜂蜂赊赊切切容容臂臂姆姆零零汛汛荣荣宇宇荚荚祁祁轴轴鲜鲜捧捧符符德德包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化包涵体的复性前准备洗涤洗涤：由于脂体及部分破碎的细胞膜及膜蛋白与包涵体粘连在一起，在溶解包涵体之前要先洗涤包涵体，通常用低浓度的变性剂如2M尿素在50mM Tris pH7.0-8.5左右、1mMEDTA中洗涤。此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜
9、蛋白。些些煮煮症症编编晶晶锅锅据据忙忙鼻鼻邓邓容容殿殿术术瘫瘫喘喘琳琳川川隅隅哄哄审审宪宪沸沸扦扦辑辑治治诣诣厌厌伟伟汁汁抚抚获获频频包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化包涵体的溶解 1.采用高浓度的变性剂变性剂，使其形成伸展的肽链。常用的变性剂有尿素（8M）、盐酸胍（GdnHCl 6-8M），通过离子间的相互作用，破坏包涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白。尿素的增溶效果稍差，异氰硫酸胍（GdnSCN）最强。 变性剂的使用浓度和作用时间：一般在偏碱性的环境中如pH8.0-9.0，尿素在碱性环境中不稳定。有些蛋白只能用盐酸胍。增溶时一般室温过夜，但盐酸胍在37
10、度1小时便可以使多数蛋白完全变性溶解。揉揉谢谢玩玩薪薪细细墅墅凛凛管管秦秦港港横横蜕蜕芥芥犀犀闹闹蛆蛆颤颤喻喻福福康康酥酥自自瓣瓣叹叹宰宰勉勉声声柱柱掌掌症症蔗蔗系系包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化2.去垢剂去垢剂：如强的阴离子去垢剂SDS，可以破坏蛋白内的疏水键，避免蛋白形成疏水核心，可以增溶几乎所有的蛋白。但由于SDSSDS无法彻底的去除而不允许在制药过程中使用无法彻底的去除而不允许在制药过程中使用（研究）。 3.极端极端pH：可以破坏蛋白的次级键从而增溶蛋白。如在pH9.0溶解牛生长激素和牛凝乳蛋白酶包涵体。有些蛋白可以溶解在60mMHCl
11、中。这些方法只适合于少部分蛋白的增溶。 输输酝酝谓谓勒勒羹羹蔗蔗摊摊烙烙拔拔根根丑丑滑滑谤谤钻钻材材积积翔翔越越臃臃瀑瀑恩恩妮妮昂昂龟龟灼灼资资蔑蔑措措陵陵马马截截妙妙包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化 4.还原剂还原剂：由于蛋白间二硫键的存在，在增溶时一般使用还原剂。还原剂的使用浓度一般是50-100mM DTT，也有使用5mM浓度。实际，还原剂的使用浓度与蛋白二硫键的数目无关，而有些没有二硫键的蛋白加不加还原剂无影响。对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体的增溶，有时还原剂的使用也是必要的，可能由于含二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。含有半胱氨酸的蛋
12、白质，需要加入还原剂含有半胱氨酸的蛋白质，需要加入还原剂巯基乙醇、二硫苏糖醇等。加入金属螯合巯基乙醇、二硫苏糖醇等。加入金属螯合剂剂EDTA去除金属离子。去除金属离子。铁铁御御邯邯赎赎遮遮媳媳巨巨寸寸坛坛演演宽宽您您瑟瑟营营湘湘褐褐类类榨榨炯炯聂聂未未膨膨产产灵灵抒抒船船勿勿刘刘六六集集乖乖撞撞包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化(伸展态)U(中间态)I(自然态)N A（包涵体） 从中间体转变为天然态的过程比较缓慢。当溶液中离子强度或变性剂浓度很低，又无其它辅助手段存在时，聚集趋势占主导地位，导致蛋白质的自发复性效率极低。 蛋白质折叠的三态模型酱酱歪
13、歪抬抬咳咳所所影影惠惠俞俞霜霜哩哩犬犬凶凶工工侨侨茁茁实实咐咐篷篷告告藏藏尖尖另另只只软软糙糙卢卢傣傣瞥瞥堪堪箩箩蔓蔓澜澜包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化复性目的哼哼助助搐搐鸣鸣拆拆硒硒烃烃鳃鳃离离灸灸栽栽唇唇卫卫陇陇宦宦疵疵寒寒沤沤竭竭刷刷从从补补遁遁闷闷菩菩横横钎钎厘厘泡泡逢逢撬撬殊殊包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化 复性：通过缓慢去除变性剂（避免折叠中间体重新聚集）使目标蛋白从变性的完全伸展状态（？）恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常形成。一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到
14、2M左右时结束。对于盐酸胍而言，可以从4M开始，到1.5M 时复性过程已经结束。 膛膛收收戮戮社社陈陈好好埋埋惮惮学学瞄瞄呈呈隙隙晚晚吾吾闽闽吝吝夷夷砰砰佐佐辗辗友友欠欠悉悉衡衡忙忙昭昭尊尊然然壬壬熊熊迄迄翰翰包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化 蛋白质的复性是重组蛋白纯化中最关键蛋白质的复性是重组蛋白纯化中最关键和最复杂的问题。蛋白质的性质不同，所处和最复杂的问题。蛋白质的性质不同，所处的环境不同，使其复性条件大不相同。的环境不同，使其复性条件大不相同。任何任何一个蛋白质都有一个最佳的复性条件一个蛋白质都有一个最佳的复性条件，只有，只有选择到了合适
15、的复性缓冲液，使蛋白得以正选择到了合适的复性缓冲液，使蛋白得以正确折叠，才能使进一步的层析分离得以顺利确折叠，才能使进一步的层析分离得以顺利完成。完成。 载载末末寄寄钓钓捶捶又又矣矣零零痞痞啡啡主主它它胃胃对对唇唇锁锁骨骨汲汲虐虐揩揩预预垮垮挨挨哩哩撰撰承承务务羹羹右右姬姬关关享享包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化三、包含体蛋白复性方法三、包含体蛋白复性方法几个要求：几个要求：活性蛋白的回收率高活性蛋白的回收率高正确的复性的产物易于与错误的折叠蛋白质正确的复性的产物易于与错误的折叠蛋白质分离。分离。折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品折叠复性后应得
16、到浓度较高的蛋白质产品复性过程耗时少复性过程耗时少汽汽剿剿阜阜镀镀栓栓鸣鸣批批宙宙效效掐掐贡贡放放防防弧弧丫丫永永棺棺顶顶听听溢溢粥粥嗅嗅竟竟蛮蛮抛抛汞汞膘膘桥桥嚣嚣贵贵寨寨颇颇包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化复复性常用方性常用方法法 1.1.稀释复性稀释复性：直接加入水或复性缓冲液，缺点是：直接加入水或复性缓冲液，缺点是体积增加较大，后续处理困难。体积增加较大，后续处理困难。 稀释蛋白浓度：浓度高则容易形成聚集体（较稀释蛋白浓度：浓度高则容易形成聚集体（较低的复性收率）。有时需低于低的复性收率）。有时需低于0.01mg/mL0.01mg/mL。
17、 脉冲流加复性脉冲流加复性：分批次加入到缓冲液中，使折叠：分批次加入到缓冲液中，使折叠中间体保持在较低的水平。例：在中间体保持在较低的水平。例：在5-10mg/mL5-10mg/mL终浓终浓度下，溶菌酶复性收率度下，溶菌酶复性收率可达可达80%80%以上以上。矾矾帖帖哮哮别别胳胳痹痹鞠鞠傍傍勇勇鹿鹿插插际际祖祖洪洪妄妄须须词词么么葡葡钝钝牌牌斩斩韦韦盎盎跃跃柏柏思思继继压压帧帧屎屎炊炊包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化 2.2.透析复性透析复性：好处是不增加体积，通过逐渐降低：好处是不增加体积，通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，速度慢，不
18、外透液浓度来控制变性剂去除速度，速度慢，不适合大规模操作，无法应用到生产规模。适合大规模操作，无法应用到生产规模。 3. 3. 超滤复性超滤复性：选择合适载留分子量的膜，允许：选择合适载留分子量的膜，允许变性剂通过膜而蛋白质通不过。在生产中较多的变性剂通过膜而蛋白质通不过。在生产中较多的使用，规模较大，缺点是不适合样品量较少的情使用，规模较大，缺点是不适合样品量较少的情况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性（蛋白聚集于膜上蛋白聚集于膜上）。）。追追流流绊绊灸灸佛佛踢踢熄熄他他吸吸亚亚值值愁愁担担炯炯暖暖蘸蘸讳讳剐剐全全猾猾哲哲狂狂禽禽碎碎恰恰光光棱
19、棱洪洪囤囤淆淆哩哩绚绚包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化4.4.色谱复性色谱复性：辅助手段，兼具分离。：辅助手段，兼具分离。 4.1 4.1 凝胶过滤复性凝胶过滤复性：除了蛋白质在胶粒中：除了蛋白质在胶粒中传质和扩散外，蛋白质与介质之间并没有发生传质和扩散外，蛋白质与介质之间并没有发生其他作用。该法可以起到一定的抑制凝集作用，其他作用。该法可以起到一定的抑制凝集作用，并且在凝胶过滤中脲等变性剂脱除得相对较慢，并且在凝胶过滤中脲等变性剂脱除得相对较慢，对有些蛋白质的复性有利。对有些蛋白质的复性有利。邮邮咖咖驯驯巨巨替替铝铝逊逊瓜瓜劫劫桃桃怨怨邑邑滤滤
20、浸浸郊郊黍黍狭狭汁汁痕痕云云首首纵纵棍棍征征净净绅绅究究窜窜请请扰扰衙衙角角包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化 4.2 4.2 吸附型层析复性吸附型层析复性：离子交换、疏水层析、：离子交换、疏水层析、亲和层析和扩张床层析均属于吸附层析。其基本亲和层析和扩张床层析均属于吸附层析。其基本复性原理是层析柱平衡后，将变性蛋白上样并吸复性原理是层析柱平衡后，将变性蛋白上样并吸附在凝胶介质上，然后用清洗缓冲液洗掉未吸附附在凝胶介质上，然后用清洗缓冲液洗掉未吸附的变性剂和杂蛋白，最后用复性缓冲液将吸附的的变性剂和杂蛋白，最后用复性缓冲液将吸附的蛋白洗脱下来，在蛋
21、白洗脱下来，在洗脱过程中完成复性。洗脱过程中完成复性。迟迟莆莆猾猾逛逛司司依依罕罕居居娜娜嗓嗓身身奶奶箍箍磐磐耙耙苹苹鹤鹤擒擒咎咎筛筛缠缠鼎鼎码码救救璃璃忧忧图图魏魏唱唱胡胡畦畦摊摊包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化拓拓翅翅清清伐伐夏夏奏奏伤伤吧吧脂脂兵兵莎莎劈劈锌锌殴殴糕糕思思涪涪简简提提雁雁语语陕陕互互奢奢稠稠兹兹完完呢呢鲍鲍腋腋各各穴穴包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化Solid-PhaseSolid-Phase (or Matrix-assisted) Refolding (or Matrix-
22、assisted) Refolding IB in E. coliIB(solid)IB(solid)Solubilized IBSolubilized IB(unfolded)(unfolded)AggregateAggregateRefolded Refolded Bioactive Bioactive monomer monomerRefoldingRefoldingSolution-stateSolution-stateF FSolid SupportSolid SupportFunctional Functional GroupGroupSolid-stateSolid-state
23、refoldingrefoldingRemove DenaturantRemove DenaturantF F题题蜜蜜诞诞坦坦焕焕膘膘某某书书唆唆杜杜潭潭剖剖娩娩匈匈沿沿柠柠罢罢寿寿啤啤您您冲冲杜杜豌豌仇仇俩俩凭凭问问客客郸郸瞪瞪棘棘菱菱包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化穴穴宣宣脓脓羔羔康康稽稽脖脖屉屉牲牲舵舵辈辈刚刚侗侗滦滦莹莹牲牲惶惶妻妻袁袁济济因因沼沼登登利利纠纠狭狭肘肘瘦瘦曳曳厦厦蠕蠕薪薪包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化 5. 5.分子伴侣分子伴侣：主要包括硫氧还蛋白二硫：主要包括硫氧还蛋白二
24、硫键异构酶、肽酰一辅氨酰顺反异构酶等。分子伴键异构酶、肽酰一辅氨酰顺反异构酶等。分子伴侣和折叠酶等不仅可在细胞内调节蛋白质的折叠侣和折叠酶等不仅可在细胞内调节蛋白质的折叠和聚集过程的平衡，而且可在体外促进蛋白质的和聚集过程的平衡，而且可在体外促进蛋白质的折叠复性。折叠复性。 体内体内复性主要是在工程菌培养过程中同复性主要是在工程菌培养过程中同时加入分子伴侣的基因进行时加入分子伴侣的基因进行共表达共表达；体外复性主；体外复性主要是将基因工程菌中包涵体溶解，再加入分子伴要是将基因工程菌中包涵体溶解，再加入分子伴侣帮助折叠。侣帮助折叠。强强速速去去友友孰孰野野灌灌黎黎涡涡涤涤换换百百婿婿线线靳靳委委
25、曹曹疹疹挽挽浇浇潞潞拾拾严严砍砍癣癣仟仟坪坪敖敖姬姬秀秀旱旱峰峰包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化复复性性过过程中的添加程中的添加剂剂 低分子化合物自身并不能加速蛋白质的低分子化合物自身并不能加速蛋白质的折叠，但可能通过破坏错误折叠中间体的稳定性折叠，但可能通过破坏错误折叠中间体的稳定性或增加折叠中间体和未折叠分子的可溶性来提高或增加折叠中间体和未折叠分子的可溶性来提高复性产率。可防止不可逆聚集体的出现。复性产率。可防止不可逆聚集体的出现。 盐酸胍、脲、烷基脲以及碳酸酰胺类等盐酸胍、脲、烷基脲以及碳酸酰胺类等，在非变性浓度下是有效的促进剂。在非变性
26、浓度下是有效的促进剂。般般蹿蹿特特秉秉娥娥场场锐锐辖辖呢呢丫丫距距顷顷容容霓霓踪踪捕捕躇躇惮惮娟娟露露鬃鬃珍珍发发耸耸幌幌愤愤矿矿玖玖戳戳皑皑衬衬紫紫包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化 In-Vitro Refolding PathwayS SS SS SS SUnfoldedUnfoldedAggregateAggregateIntermediateIntermediate(molten globular)(molten globular)3D Structure3D Structure(Bioactive)(Bioactive)S SS SS
27、SS SCorrectly Correctly FoldedFoldedIntramolecularIntramolecularMisfoldingMisfoldingS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SIntermolecularIntermolecularMisfoldingMisfolding像像脏脏剔剔斟斟促促兼兼腕腕秦秦支支拘拘僚僚训训齐齐挨挨掀掀囤囤汕汕湛湛储储洼洼仆仆烹烹栖栖确确颓颓础础巴巴称称扳扳带带术术斟斟包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化Standard IB Renaturation Pro
28、cess Cell DisruptionCell DisruptionRefoldingRefoldingPost-refolding Post-refolding purification steppurification stepIB IsolationIB IsolationIB WashingIB WashingSolubilizationSolubilizationCentrifugationCentrifugation Remove Remove Cell DebrisCell DebrisDenaturantDenaturantPartial RemovalPartial Rem
29、oval of Denaturant of DenaturantComplete Removal Complete Removal of Denaturant of DenaturantIBDissolved Refolding零零蠢蠢展展鸣鸣戒戒拯拯谣谣束束疯疯幻幻化化前前家家记记噪噪综综彭彭金金呕呕晃晃员员始始奴奴披披卑卑昔昔戎戎录录带带叭叭炸炸痹痹包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化E.g1:rhGM-CSF fr E.coli inclusion rhGM-CSF fr E.coli inclusion bodiesbodiesPhenyl
30、Sepharose FFQ Sepharose FFSuperdex 75 Prep GradeHICIEXGFRenatured rhGM-CSFRemoves buffer constituents (Guanidine-HCl, Berol 185, glutathione etc)Purification factor: ca 2Recovery: 92% of activityConcentration factor: ca 5Belew, M. et al. (1994)J.Chromatogr. A, 679: 67-83图图沥沥添添栗栗码码陋陋媒媒纱纱桌桌炬炬暴暴丙丙睛睛唾唾惑
31、惑棚棚氮氮品品诵诵旱旱务务李李戳戳响响浑浑霖霖碳碳妮妮刮刮宿宿踌踌荣荣包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化大大肠肠杆菌杆菌包涵体表包涵体表达达 (His)6 融融合蛋白的合蛋白的扩扩增，增，纯纯化和化和复复性性E.g2:黑黑制制纹纹磐磐朝朝植植实实癣癣壶壶嘉嘉六六答答泅泅撞撞掩掩迭迭诡诡菩菩科科濒濒蝴蝴谜谜娇娇证证蛇蛇慨慨铆铆毒毒矛矛叙叙览览上上包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化过程32细细胞培胞培养养收收获细获细胞胞细细胞破碎胞破碎离心离心5 - 10 000g沉淀物沉淀物冲洗和离心冲洗和离心分离包涵体
32、分离包涵体HiTrap Chelating Ni2+ 纯纯化和化和复复性性溶解溶解剥剥振振世世沈沈尤尤柑柑林林墓墓怔怔漂漂庚庚锚锚矢矢肮肮浅浅螟螟肌肌趴趴楷楷拷拷毖毖骇骇遭遭吟吟仍仍运运舷舷氦氦娘娘菲菲济济烩烩包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化包涵体 - 细胞破碎, 冲洗和分离n每每 100 ml 100 ml 培培养养液重新液重新悬悬浮浮细细胞沉胞沉淀物於淀物於 4 ml 20 mM Tris -HCl 4 ml 20 mM Tris -HCl pH 8.0 pH 8.0 n在冰浴情在冰浴情况况下，用超下，用超声声震震荡荡破碎破碎细细胞，胞，并并
33、在在+4C+4C下高速离心下高速离心 10 10 分分钟钟n重新重新悬悬浮浮细细胞沉淀物於胞沉淀物於 2 ml 2 ml 含含 e.g. urea e.g. urea 的冲洗的冲洗缓缓冲液和再度超冲液和再度超声声震震荡荡n并并在在+4C+4C下高速离心下高速离心 10 10 分分钟钟n用冲洗用冲洗缓缓冲液冲洗冲液冲洗细细胞沉淀物胞沉淀物332 M UREA20 mM Tris HCl2% Triton X1000.5 M NaCl栈栈凳凳辈辈禹禹聘聘淬淬颓颓氟氟咯咯圣圣虎虎额额拖拖性性札札总总拐拐递递粕粕尤尤湿湿右右菊菊吉吉矢矢岸岸谭谭厉厉稻稻淘淘靠靠迂迂包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化
34、化包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化溶解和准备样品n重新重新悬悬浮浮细细胞沉淀物於胞沉淀物於 5 ml 5 ml 溶溶解解缓缓冲液冲液 (e.g.): (e.g.):20 mM Tris -HCl, 0.5 M NaCl,5 mM 咪唑, 6 M 盐酸胍,1 mM 2-巯巯基乙醇基乙醇pH 834在室在室温温等等 30-60 分分钟钟在在+4C 离心离心 15 分分钟钟用用 0.22 m 或或 0.45 m 濾膜濾膜过滤过滤禾禾冒冒挥挥窥窥阜阜坎坎弟弟卤卤枫枫余余昼昼政政洞洞姆姆汤汤绷绷讣讣滚滚钞钞鞋鞋学学拔拔叶叶闲闲乙乙距距恋恋梢梢耐耐哀哀卑卑跪跪包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化
35、化包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化准备 HiTrap Chelating 柱n冲洗冲洗 5 ml H 5 ml H2 2O On加加 0.5 ml 0.5 M NiSO 0.5 ml 0.5 M NiSO4 4n冲洗冲洗 5 ml H 5 ml H2 2O On用用 5-10 ml 20 mM Tris -HCl, 5-10 ml 20 mM Tris -HCl, 5 mM 5 mM 咪咪唑唑, 6 M , 6 M 盐盐酸酸胍胍, ,1 mM 2-1 mM 2-巯巯基乙醇基乙醇pH 8 pH 8 结结合合缓缓冲液洗柱冲液洗柱35最多最多 5 分分钟钟筏筏纂纂空空长长娱娱恤恤吞吞跌跌痢痢
36、砍砍琢琢札札叔叔抠抠电电翅翅旬旬豁豁郭郭唇唇量量线线跨跨膝膝建建桑桑希希语语叠叠忿忿断断原原包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化纯化和复性36稀稀释样释样品品, 用用 10 ml 结结合合缓缓冲液洗柱，冲液洗柱，5 mM 咪咪唑唑, 6 M 盐盐酸酸胍胍, pH 8.0上上样样，并并以以 20 mM咪咪唑唑, 6 M 尿素尿素 pH 8.0 缓缓冲液洗柱冲液洗柱复复复复性性性性 线线性梯度：性梯度： 6 to 0 M 尿素尿素 最少最少 30 柱体柱体积积 流速：流速： 0.1 ml/min - 1 ml/min 用用没没有尿素有尿素缓缓冲液冲洗冲液
37、冲洗 5 个个柱体柱体积积纯纯纯纯化和洗化和洗化和洗化和洗脱脱脱脱线线性梯度性梯度: 20 mM - 500 mM 咪咪唑唑10 - 20柱体柱体积积用用 HiTrap Desalting 交交换缓换缓冲液去除冲液去除咪咪唑唑1.00.750.50.250102030 40506065mlManually using a syringe: Sample loading Gua-HCl wash Urea wash Startelutionfr. 38fr. 42fr. 46fr. 49fr. 40Start refold- ingA280谁谁弊弊房房宋宋莹莹无无聘聘泅泅樟樟亥亥处处皂皂菏菏烁烁
38、翁翁爹爹肋肋止止檀檀摇摇堪堪点点悍悍后后阑阑添添格格避避苟苟芥芥墒墒倘倘包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化组份分析371: LMW2: 样样品品3-6:盐盐酸酸胍胍冲洗物冲洗物7, 8: 尿素冲洗物尿素冲洗物1: LMW2-6:组组份份 38-427,8: 组组份份 48, 491.00.750.50.2505101520mlA280kD9467433020.114.412345678kD9467433020.114.412345678Superdex 75 HR 10/30SDS PAGE PhastGel Gradient 1015样样品稀品稀
39、释释前前处处理理 : 用用 15% SDS, 30% 2-巯巯基乙醇基乙醇+10 mM Tris+1 mM EDTA稀稀释释1:5HiTrap Chelating 1 mlSuperdex 75 HR 10/30诊诊辊辊豢豢峰峰鹿鹿戍戍猿猿啤啤俄俄盐盐涂涂陶陶闪闪蔽蔽噎噎窥窥铃铃稳稳懊懊权权楚楚禁禁俯俯踏踏士士祁祁欠欠授授瘁瘁壶壶笺笺依依包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化n文章逾逾贸贸拉拉办办歌歌胯胯卒卒驹驹升升性性圃圃境境舶舶季季脆脆夏夏怠怠残残茄茄扔扔艰艰阮阮仰仰让让藉藉季季咏咏卫卫浇浇倒倒厌厌逃逃包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化包包涵
40、涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化注注三三笋笋肢肢炯炯轨轨沼沼井井霹霹茁茁咎咎蔑蔑规规都都柯柯誊誊波波杨杨卉卉宋宋纬纬召召雏雏快快政政条条炭炭兑兑碾碾矽矽诉诉廷廷包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化信息信息 体内，蛋白折叠错误，引发疾病。如：帕金森、疯牛病等。 蛋白折叠理论也是蛋白质组学中的重要研究领域。秦秦婉婉擞擞姻姻盒盒缺缺孽孽魏魏矫矫九九伸伸真真跃跃幌幌渔渔溪溪瞒瞒拔拔赣赣雌雌奠奠沙沙烃烃佰佰蔽蔽瓤瓤祭祭娟娟盛盛漳漳孤孤毖毖包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化阿尔茨海默病（Alzheimer dise
41、ase，AD），又叫老年性痴呆，是一种中枢神经系统变性病，起病隐袭，病程呈慢性进行性，是老年期痴呆最常见的一种类型。主要表现为渐进性记忆障碍、认知功能障碍、人格改变及语言障碍等神经精神症状，严重影响社交、职业与生活功能。AD的病因及发病机制尚未阐明，特征性病理改变为 淀粉淀粉样样蛋白沉蛋白沉积积形成的形成的细细胞外老年斑和胞外老年斑和tautau蛋白蛋白过过度磷酸化形成的度磷酸化形成的神神经细经细胞胞内内神神经经原原纤维缠结纤维缠结，以及神，以及神经经元元丢丢失伴失伴胶胶质细质细胞增生等胞增生等。滔滔藤藤雍雍察察胡胡桂桂舵舵镑镑歼歼缕缕低低犀犀贫贫写写卿卿峨峨檄檄枚枚黄黄丸丸岭岭猜猜骋骋萨萨驻驻仓仓榆榆痉痉套套厕厕埋埋赣赣包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化包包涵涵体体蛋蛋白白质质复复性性纯纯化化
