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1、一起不典型症状宋内志贺菌暴发疫情的实验室诊断 摘要 目的 分析本实验室对 1 起由宋内志贺菌引起的不典型临床症状、疑似不明原因发热暴发疫情的实验室检测过程，为类似事件的实验室诊断提供参考。探讨通过增菌前后 Ct值变化，荧光 PCR 用作病原菌确诊方法的可能性。方法 采用总大肠菌群酶底物法测定总大肠菌群和大肠埃希菌，常规培养法和荧光 PCR 法测定患者咽拭和肛拭样品以及水样中病原微生物，用 MIC 法对分离菌株进行体外药敏试验。结果 10 份饮用水中 6 份总大肠菌群和大肠埃希菌，不符合 GB5749-2006 的要求。常规培养 9 份肛拭均检出宋内志贺菌，而 10 份水样均未检出肠道致病菌。荧
2、光 PCR 结果 9 份肛拭和 5 份水样检出志贺菌核酸，5 份水样增菌后 Ct 值较增菌前有明显下降。肛拭中分离的 9 株菌对青霉素类抗生素中的阿莫西林、哌拉西林、替卡西林 100%耐药，对磺胺类、 -内酰胺类、头孢菌素类（1-4 代） 、氨基糖苷类等存在不同程度耐药。结论 实验室应用指标菌检测、常规培养和荧光 PCR 技术，48h 即找到引起疫情暴发的原因， 为疫情的控制提供了及时科学的依据。 药敏试验为患者治疗提供了正确的药物选择依据。 状和流行病学调查， 实验室进行了呼吸道病毒的核酸检测， 均为阴性， 诊断为不明原因发热。采取针对呼吸道传播疾病的控制措施后，疫情未得到有效控制，发病范围
3、继续扩大，发病人数快速增长，累计诊断报告病例 201 例（其中镇四小 71 人，五小 33 人，一小 32 人，镇初级中学 26 人，其余 5 所学校均 10 人以下） 。进一步流行病学调查后，怀疑可能与供水污染有关，因此采集了乡镇水厂和发病学校的自备水以及患者咽拭和肛拭， 进行肠道病毒和细菌的检测，现报道如下。 1 材料方法 1.1 标本来源 患者肛拭 9 份， 咽拭 12 份； 该镇水厂进厂水 1 件、 出厂水 1 件 （各约 300ml） ，5 所学校管网末梢水 5 件以及 3 所学校自备水各 1 件（各约 300ml） 。 1.2 仪器试剂 全自动微生物鉴定/药敏分析系统（VITEK3
4、2，法国生物梅里埃公司） ，程控定量封口机（美国 IDEXX 公司） ，核酸纯化仪（Promega Maxwell16，美国 Promega 公司） ，实时荧光定量 PCR 仪（ABI7500，美国爱普拜斯应用生物系统公司） 。 1%氯化钠肉汤、亚硒酸胱氨酸肉汤、碱性蛋白胨水、Mac 琼脂、HE 琼脂、TCBS 琼脂、4号琼脂、三糖铁琼脂（北京陆桥技术有限责任公司） ，51 孔定量盘（美国 IDEXX 公司） ；GNI+鉴定卡、API20E、氧化酶试剂、ATBG-5 药敏卡（法国生物梅里埃公司） 。 Maxwell16 Tissue LEV Total RNA 纯化试剂盒（Promega） ；
5、产毒素大肠埃希菌、沙门菌、志贺菌、副溶血弧菌、诺瓦克病毒、流感病毒核酸测定试剂盒（荧光 PCR 法） （上海之江生物科技有限公司） 。 1.3 方法 1.3.1 指标菌检测 用 51 孔定量盘法，按 GB/T5750.12-2006 规定测定水样中总大肠菌群和大肠埃希菌。 1.3.2 肠道致病菌分离鉴定 1.3.2.1 直划分离 患者肛拭现场直接划线接种于 Mac、HE、TCBS、4 号琼脂平板，同时接种 1%NaCl 肉汤。 1.3.2.2 增菌后分离 水样及患者肛拭均用 1%氯化钠肉汤、亚硒酸胱氨酸肉汤、碱性蛋白胨水增菌 7h 后划线接种 Mac 琼脂、HE 琼脂、TCBS 琼脂、4 号琼
6、脂平板。 1.3.2.3 鉴定 挑选选择性平板上可疑菌落转种三糖铁琼脂斜面上，将三糖铁上可疑菌落用GNI+鉴定卡、API20E 鉴定，同时做血清学凝集。 1.3.2.4 药敏试验：用 MIC 法测定 9 株分离的宋内志贺菌对 21 种抗菌药物的敏感性。 1.3.3 核酸提取 1.3.3.1 RNA 提取 咽拭子按 RNA 纯化试剂盒说明书，于试剂条样品孔加入 100 l 经混悬后样品液，再加入 266 l 裂解液，134 l 裂解缓冲液，收集管中加入 60 l 无酶水。试剂条置于核酸提取仪，约 37min 后获得溶于无酶水的病毒核酸。 1.3.3.2 DNA 提取 患者肛拭经 1%氯化钠肉汤
7、4h 增菌后提取，6 份水样（其中混合水样 1 为镇水厂出厂水、镇五小学生宿舍管网水、镇四小过道管网水混合，混合水样 2 为镇一、二小管网水混合）则经抽滤富集后不经增菌直接提取，5 份重点可疑水样增菌 8h 后再次分别提取核酸。 按照细菌核酸测定试剂盒说明书，取水样增菌液 3ml，13000rpm 离心 2min；弃去上清，沉淀中直接加入 100 lDNA 提取液充分混匀，金属浴 10010min，13000rpm 离心 5min，收集上清即为核酸模板。 1.3.4 呼吸道病毒核酸检测 照试剂盒说明书，对 12 份咽拭进行流感病毒核酸检测。 1.3.5 肠道病毒核酸检测 按照试剂盒说明书，对
8、12 份咽拭核酸进行诺瓦克病毒检测。 1.3.6 肠道细菌核酸检测 按照试剂盒说明书，对经 4h 增菌的 9 份肛拭与未经增菌的水样进行肠道致病菌（产毒素大肠埃希菌、沙门菌、志贺菌、副溶血弧菌）检测。水样增菌 8h 后再次进行志贺菌检测。 2 结果 2.1 指标菌检测与肠道致病菌分离 根据菌落形态、生化反应、血清学试验结果，所有水样均未分离到肠道致病菌，9 份患者肛拭菌均分离到宋内志贺菌，结果见表 1。 2.2 呼吸道病毒核酸检测 阴性对照为“undet” ，阳性对照 Ct25，试验成立。按试剂盒说明书，流感病毒 Ct38 为阳性，而 12 份咽拭样品均为“undet” ，据此判断，所有咽拭样
9、品未检出流感病毒。 2.3 肠道病毒核酸检测 阴性对照为“undet” ，阳性对照 Ct35，试验成立。12 份咽拭样品为“undet” ，按试剂盒说明书，诺瓦克病毒 Ct38 为阳性，据此判断，所有咽拭样品未检出诺瓦克病毒。 2.4 肠道致病菌核酸检测 2.4.1 患者肛拭及未经增菌水样检测 阴性对照为“undet” ，阳性对照 Ct35，试验成立。按照试剂说明书，产毒素大肠埃希菌、沙门、志贺、副溶血性弧菌 Ct35 为阳性，3540重复测定，若仍为灰区，则为阴性。结果所有样品均为“undet” ，未检出产毒素大肠埃希菌、沙门菌和副溶血弧菌，而混合水样和 9 例患者肛拭 4h 增菌液均为志贺
10、菌阳性，镇水厂进厂水、镇初级中学自备水为志贺菌阴性（图 1） 。 图 1 肛拭子增菌液、水样志贺菌检测荧光曲线图 19：病例肛拭子增菌液；11：镇水厂进厂水；12：镇一小自备水； 10：镇水厂出厂水、镇五小学生宿舍管网水、镇四小过道管网水混合水样； 13：镇三小自备水；14：镇初级中学自备水；15：镇一、二小管网水； P：阳性对照；N：阴性对照。 2.3.2 5 份重点可疑水样经 1%氯化钠肉汤增菌 8h 后，再次检测志贺菌，均为阳性。见图 2。且 Ct 均明显下降，见表 2。 2.4 抗菌药物体外药敏试验结果 对从 9 名患者肛拭中分离的宋内志贺菌作临床常用的 21种抗生素药敏试验，结果 9
11、 株菌对阿莫西林、哌拉西林、替卡西林、替卡西林+克拉维酸、头孢噻吩、头孢呋辛 6 种抗生素均耐药，对哌拉西林+三唑巴坦、美诺培南、亚胺培南、阿米卡星、环丙沙星 5 种抗生素菌敏感，对阿莫西林+克拉维酸、头孢西丁、头孢他啶、头孢噻肟、头孢吡肟、复方新诺明、头孢他啶 1、妥布霉素、庆大霉素、奈替米星 10 种抗生素则有不同程度耐药。 3 讨论 自 19 世纪末志贺菌作为细菌性痢疾的病原开始被人们认识和了解1。志贺菌常通过被污染的食物和水以及人-人传播，志贺菌引起的暴发就时有发生，尤其是卫生条件受限的地区，常因饮水卫生状况不良引发较大范围的痢疾流行2，其典型症状一般开始是水样腹泻伴发热和腹部痉挛性疼
12、痛，而后排少量含有血、黏液和脓的粪便。而本次由宋内志贺菌引起的暴发中，多数患者开始症状只是发热，只有少数患者出现腹泻，由于疫情又发生在学校这种人群聚集的地方， 因此流行病学调查开始怀疑为呼吸道病毒引起的疾病， 而实验室检测结果却未能支持流调的怀疑，于是界定为不明原因发热，并采取了相应的控制措施，但未能有效控制疫情。3d 中，发病范围陆续扩大，发病人数快速增长，多数患者均有发热伴腹泻、腹痛、呕吐、头晕等症状，血常规检查白细胞升高，大便查见脓细胞和红细胞，并有部分患者由初期的单纯发热，出现腹泻症状。进一步流行病学调查后，排除食物传播，怀疑可能与供水污染有关， 实验室对采集的样品进行了指标菌检测和相
13、关肠道病毒及致病细菌的常规培养分离和核酸检测。10 份水样指标菌检测结果为 6 份水样总大肠菌群和大肠埃希菌均超过生活饮用水卫生标准3，提示水样已受到温血动物粪便污染。常规培养则仅在患者肛拭中分离到宋内志贺菌，核酸检测结果显示在 9 份患者肛拭和 5 份水样（镇水厂出厂水和进厂水、镇初级中学自备管网水食堂洗碗处、 镇四小教学楼过道管网水及镇五小宿舍管网水） 中均检测到志贺菌核酸，显示该镇无论是水厂水源还是自备水源普遍受到志贺菌污染。9 所学校中镇四小、五小、一小、镇中病例相对较多（镇四小 71 人，五小 33 人，一小 32 人，镇初级中学26 人，其余 5 所学校均 10 人以下） ，指标菌
14、、常规培养及核酸检测结果与各学校发病情况一致，表明此次暴发疫情是由宋内志贺菌污染饮用水引起的。 实时荧光 PCR 能够快速准确地检测和分析是否存在特异的病原微生物 DNA 或 RNA 核酸片段， 但死的微生物也可能包含可扩增的 DNA 或 RNA， 因而分子技术得到的一个阳性结果则不一定表示在样品中存在活的病原体， 使得结果在疫情判断和处理中的应用变得困难。 培养结果阳性则明确代表样品中存在活的病原体， 可以确定微生物和疾病之间的关系， 但其较长的检测周期，亦使结果无法及时应用。在因致病微生物污染水源、食品或环境等引起的暴发疫情中，由于在非病原样品如水样、食品或环境涂抹样等致病菌通常含量较少、
15、非致病菌的竞争抑制等影响因素，常规培养法通常无法分离到致病菌，志贺菌尤其不容易分离到4-5，其敏感性远较 PCR 低6，因此在此次疫情中我们采用对水样进行 2 次志贺菌核酸检测（增菌前和增菌后） ，结果混合水样增菌后 Ct 值显著下降，而镇水厂进厂水和镇中学的自备水由阴性转为阳性，表明增菌后志贺菌数量增加。研究表明，实时荧光 PCR 技术中，每个模板的 Ct 值与该模板起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct 值越小7。是否可以通过对样品增菌前后进行两次荧光 PCR 检测，根据其 Ct 值的变化，分析样品中是否存在活的病原体，从而确定其与疾病的因果关系，使得荧光 PCR 技术和培养法
16、一样可以作为确证病原体的金标准，值得进一步探讨和研究。 在抗生素耐药不断增加的时代， 获得细菌的药物敏感度测定与病原体鉴定同等重要。 敏感性试验除帮助临床医师为正确选择抗生素提供参考外， 还可以帮助对抗感染药物及其耐药机制进行研究。 在对本试验中 9 株菌的药敏试验显示， 所有菌株对青霉素类抗生素中的阿莫西林、哌拉西林、替卡西林 100%耐药，对磺胺类、 -内酰胺类、头孢菌素类（1-4 代） 、氨基糖苷类等存在不同程度耐药，对碳青霉烯类抗生素美诺培南、亚胺培南 100%敏感，与其他地区报道的耐药情况有一定差异8-9， 提示不同地区宋内志贺菌的抗菌谱可能不同。 本次疫情中从不同患者分离的菌株耐药
17、情况亦不尽相同， 提示不同人群肠道微生态系统可能对致病菌耐药产生影响。 志贺菌病的典型症状为开始是水样腹泻伴发热和腹部痉挛性疼痛， 继而转为排含有血、 黏液和脓的粪便。而此次疫情暴发初期，由于患者症状是以发热为主，并未出现志贺菌感染引起的腹泻症状，实验室进行了流感病毒的核酸检测，结果为阴性，而被定义为不明原因发热。当针对呼吸道传播疾病采取的措施未能有效控制疫情的情况下， 根据进一步的流行病学调查情况，实验室采用酶底物法和荧光 PCR 技术，在 24h 内即得到指标菌和致病菌的核酸检测结果，结合水样增菌前后志贺菌核酸检测 Ct 值变化（增菌后下降） ，快速准确地找出了疫情暴发的病原因子，并据此分析出暴发是由志贺菌污染饮用水引起的，根据这一结果，现场立刻采取了设立多个监测点， 加强饮水消毒， 并逐日采样检测出厂水、 末梢水和学校自备水等，直至 10d 后所有管网水和自备水连续两次监测合格，疫情得到了彻底控制。
