基因表达的检测

《基因表达的检测》由会员分享，可在线阅读，更多相关《基因表达的检测（75页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、基因表达水平的检测基因表达水平的检测苏苏 川川南京医科大学病原生物学系南京医科大学病原生物学系 86862774江苏省病原生物学重点实验室江苏省病原生物学重点实验室 86862773一、基因表达的概述：一、基因表达的概述： 1.1.从基因到蛋白质从基因到蛋白质中心法则中心法则： DNAmRNA蛋白质蛋白质转录转录逆转录逆转录翻译翻译复制复制1.2. 教学目的：教学目的：1.了解检测基因表达主要方法的原理及大概操了解检测基因表达主要方法的原理及大概操作要点作要点2.理解各检测方法的优缺点理解各检测方法的优缺点3.懂得合理选择实验方法及对各实验结果的合懂得合理选择实验方法及对各实验结果的合理解释理

2、解释二、基因表达调控的基本概念与原理：二、基因表达调控的基本概念与原理：1.基因表达调控的概念及方式：基因表达调控的概念及方式：1)基因：基因：一个遗传单位，是一段可表达的一个遗传单位，是一段可表达的DNA序列。序列。2)基基因因组组：一一个个单单倍倍体体细细胞胞或或病病毒毒颗颗粒粒的的全全套套基基因因。人人类类基基因因组含约组含约4万个基因。万个基因。3)基基因因表表达达：基基因因所所包包含含的的遗遗传传信信息息通通过过转转录录生生成成RNA，再再经经过过翻翻译译生生成成蛋蛋白白质质的的过过程程。一一般般而而言言，在在某某一一特特定定时时刻刻，高等生物仅有不到高等生物仅有不到15%的基因表达

3、。的基因表达。4)基基因因表表达达调调控控：基基因因表表达达有有其其特特定定的的规规律律，并并受受到到机机体体各各种种因因素素的的调调节节和和控控制制。对对基基因因的的表表达达实实施施精精确确的的控控制制，使使细细胞胞适适应应不不同同阶阶段段、不不同同环环境境条条件件下下的的生生长长与与发发育育的的需需要要，维维持持机体正常生命活动，有着重要意义。机体正常生命活动，有着重要意义。可诱导基因：基因表达的时间特异性可诱导基因：基因表达的时间特异性 基因表达的空间特异性（组织特异性）基因表达的空间特异性（组织特异性）看家基因看家基因:2. 基因表达调控的基本原理：基因表达调控的基本原理：原原核核生生

4、物物和和真真核核生生物物的的基基因因表表达达调调控控尽尽管管在在细细节节上上差差异异很大，但两者的调控模式和原理极为相似。很大，但两者的调控模式和原理极为相似。调调节节作作用用主主要要包包括括核核酸酸之之间间的的相相互互作作用用、核核酸酸与与蛋蛋白白质质之间的相互作用以及蛋白质之间的相互作用。之间的相互作用以及蛋白质之间的相互作用。调控作用可能是正向的或负向的。调控作用可能是正向的或负向的。调调控控点点可可以以位位于于基基因因表表达达过过程程的的各各个个环环节节，如如基基因因的的激激活活、转转录录起起始始、转转录录后后加加工工、mRNA降降解解、蛋蛋白白质质翻翻译译、翻译后加工和蛋白质降解等。

5、翻译后加工和蛋白质降解等。1)特异特异DNA序列对基因表达的影响：序列对基因表达的影响：真真（原原）核核生生物物DNA分分子子上上的的特特定定序序列列构构成成了了基基因因表表达达的的基基本本信信号号：起起始始密密码码、调调控控序序列列、编编码码序序列列、终终止止密密码码、单单拷拷贝贝序序列、重复序列等。列、重复序列等。2)DNA与蛋白质之间相互作用对基因表达的影响：与蛋白质之间相互作用对基因表达的影响：A.DNA上上的的特特定定序序列列可可以以与与相相应应的的蛋蛋白白质质结结合合，这这些些蛋蛋白白质质依依其其作作用用分分为：为：阻遏蛋白（阻遏蛋白（repressor）：）：与操纵序列结合，阻遏

6、基因的转录。与操纵序列结合，阻遏基因的转录。激活蛋白（激活蛋白（activator）：）：与启动子中的特定序列结合，增强转录。与启动子中的特定序列结合，增强转录。特异因子特异因子转转录录因因子子（transcription factor, TF）也也称称反反式式作作用用因因子子（trans-acting factor）：）：通过与顺式作用元件结合，调节转录活性通过与顺式作用元件结合，调节转录活性B.DNA-蛋蛋白白质质之之间间的的结结合合通通常常是是非非共共价价键键的的形形式式，通通过过蛋蛋白白质质分分子子中中特特殊殊的的结结构构域域与与DNA分分子子中中双双螺螺旋旋结结构构的的大大沟沟结结合

7、合，调调节节基基因因的的转转录录。常见的常见的DNA-蛋白质结合域有：蛋白质结合域有：螺旋转角螺旋（螺旋转角螺旋（helix-turn-helix）锌指（锌指（zinc fingers）3)蛋白质之间相互作用对基因表达的影响：蛋白质之间相互作用对基因表达的影响：A.调调节节蛋蛋白白通通常常通通过过二二聚聚体体（dimer）或或多多聚聚体体（polymer）的的形形式与式与DNA结合结合B.不不同同的的调调节节蛋蛋白白也也可可以以相相互互作作用用或或结结合合后后，再再与与DNA特特定定部部位位结合，调节同一基因的不同转录水平，尤其多见于真核生物。结合，调节同一基因的不同转录水平，尤其多见于真核生

8、物。C.蛋白质之间相互作用的典型特征包括：蛋白质之间相互作用的典型特征包括：亮氨酸拉链（亮氨酸拉链（leucine zipper）螺旋转角螺旋（螺旋转角螺旋（helix-loop-helix）4)RNA聚合酶对基因表达的影响：聚合酶对基因表达的影响：A.转转录录起起始始是是通通过过RNA聚聚合合酶酶与与启启动动子子的的结结合合来来实实现现的的，转转录录起始的调控是基因表达调控中最重要、最基础的调控点之一。起始的调控是基因表达调控中最重要、最基础的调控点之一。B.不不同同启启动动子子的的序序列列不不同同，因因而而影影响响它它们们与与RNA聚聚合合酶酶结结合合的的亲和力，亲和力的不同继而直接影响转

9、录起始的频率。亲和力，亲和力的不同继而直接影响转录起始的频率。C.RNA聚聚合合酶酶和和启启动动子子的的结结合合也也会会受受到到调调节节蛋蛋白白的的影影响响,阻阻遏遏蛋蛋白白、激激活活蛋蛋白白、特特异异因因子子、转转录录因因子子等等均均可可通通过过增增强强或或者者干干扰扰RNA聚合酶与启动子之间的结合，调节基因的起始。聚合酶与启动子之间的结合，调节基因的起始。三、原核生物的基因表达调控：三、原核生物的基因表达调控： 原原核核生生物物结结构构简简单单、无无细细胞胞核核，转转录录和和翻翻译译过过程程耦耦联联在在一一起起，对对环环境境条条件件的的变变化化反反应应迅迅速速，可可以以根根据据环环境境因因

10、素素的的变变化化迅迅速速调调整整自自身身基基因因的的表表达达，满满足足其其生生长长和和繁繁殖殖的的需需要要。原原核核基基因因表达调控的特点为：表达调控的特点为：普遍存在操纵子调控模式普遍存在操纵子调控模式通过特异的阻遏蛋白或激活蛋白调节基因的转录通过特异的阻遏蛋白或激活蛋白调节基因的转录转录与翻译的耦联转录与翻译的耦联1.转录水平的调控：转录水平的调控：1)乳糖操纵子的调控：乳糖操纵子的调控：阻遏阻遏蛋白对乳糖操纵子的调节蛋白对乳糖操纵子的调节2） 其它转录调控机制：其它转录调控机制：转录衰减：转录衰减：基因重组：基因重组：2.翻译水平的调控：翻译水平的调控：1)SD序序列列对对翻翻译译的的影

11、影响响：SD序序列列是是原原核核生生物物mRNA起起始始密密码码子子AUG上上游游3-10碱碱基基的的由由3-9个个碱碱基基组组成成的的一一个个富富含含嘌嘌呤呤核核苷苷酸酸的的序序列列，能能与与核核糖糖体体小小亚亚基基16s rRNA3末末端端富富含含嘧嘧啶啶的的序序列列互互补补，从从而使核糖体与而使核糖体与mRNA结合，开始翻译。结合，开始翻译。2)mRNA的的稳稳定定性性：原原核核细细胞胞内内mRNA通通常常很很快快被被降降解解。例例如如：E. coli的许多的许多mRNA在在37时的平均寿命只有大约时的平均寿命只有大约2分钟。分钟。3)翻翻译译产产物物对对翻翻译译的的影影响响：有有些些m

12、RNA编编码码的的蛋蛋白白质质，本本身身就就是是在在蛋蛋白白翻翻译译过过程程中中发发挥挥作作用用的的因因子子。这这些些因因子子可可对对自自身身的的翻翻译译产产生生调调控控作作用用。如如起起始始因因子子3（IF-3），当当它它合合成成过过多多时时，能能有有效效地地校校正正和和抑抑制制其其自自身身的的起起始始密密码码子子与与起起始始tRNA的的配配对对而而抑抑制制翻翻译译的的起起始。另外还有核糖体蛋白、翻译终止因子等均可影响翻译过程。始。另外还有核糖体蛋白、翻译终止因子等均可影响翻译过程。四、真核生物的基因表达调控：四、真核生物的基因表达调控：真核生物基因表达调控与原核不同点在于：真核生物基因表达

13、调控与原核不同点在于：1.1.转录激活与染色体转录区特定结构相适应转录激活与染色体转录区特定结构相适应2.2.正性调节占主导正性调节占主导3.3.转录与翻译在空间上的分离转录与翻译在空间上的分离4.4.更多、更复杂的调控蛋白更多、更复杂的调控蛋白（一）、DNADNA水平的调控（真核生物表达调控的次水平的调控（真核生物表达调控的次要和辅助手段）：要和辅助手段）：1.染色质（染色质（chromatin）结构对基因表达的调控作用：结构对基因表达的调控作用：真真核核基基因因通通常常与与组组蛋蛋白白（histone）结结合合形形成成核核小小体体，从从而而保保护护DNA免免受受损损伤伤，维维持持基基因因组

14、组稳稳定定，抑抑制制基基因因的的表表达达。影影响响基基因因表达水平的主要有：表达水平的主要有：组蛋白的含量组蛋白的含量组蛋白的结构组蛋白的结构调调节节蛋蛋白白与与组组蛋蛋白白H1和和H5竟竟争争和和DNA的的结结合合，从从而而解解除除组组蛋白对基因表达的抑制作用。蛋白对基因表达的抑制作用。2.基因修饰对基因表达的调控作用：基因修饰对基因表达的调控作用：胞胞嘧嘧啶啶经经甲甲基基化化为为5-甲甲基基胞胞嘧嘧啶啶（常常出出现现在在5端端侧侧翼翼序序列列的的GC丰丰富富区区），影影响响DNA特特异异序序列列与与转转录录因因子子的的结结合合，使使基基因因不不能能转录或阻止转录复合物的形成。转录或阻止转录

15、复合物的形成。3.3.基因丢失：基因丢失：1)1)在在细细胞胞分分化化过过程程中中，可可以以通通过过丢丢失失掉掉某某些些基基因因而而去去除除掉掉某某些基因的活性。些基因的活性。2)2)染色体破碎所致的不均等分配。染色体破碎所致的不均等分配。3)3)仅仅发发生生在在低低等等生生物物中中（原原生生动动物物、线线虫虫、昆昆虫虫、甲甲壳壳类类动动物等），此现象在高等生物中迄今尚未发现。物等），此现象在高等生物中迄今尚未发现。4.4.基因扩增：基因扩增：细细胞胞内内某某些些特特定定基基因因的的拷拷贝贝数数专专一一性性地地大大量量增增加加的的现现象象，它它是是细细胞胞在在短短期期内内为为满满足足某某种种需

16、需要要（发发育育需需要要、外外界界环环境境因因素）而产生足够的基因产物的一种调控手段。素）而产生足够的基因产物的一种调控手段。 5.5.基因重排：基因重排：基基因因重重排排是是指指某某些些基基因因片片段段改改变变原原来来的的存存在在顺顺序序，通通过过调调整整有有关关基基因因片片段段的的衔衔接接顺顺序序，重重新新组组成成为为一一个个完完整整的的转转录录单单位位。一一种种熟熟知知的的以以基基因因重重排排来来调调节节不不同同基基因因表表达达的的例例子子是是哺哺乳乳动动物物免免疫球蛋白各编码区的连接：疫球蛋白各编码区的连接：1)1)一个免疫球蛋白分子包括两条相同的轻链和重链。一个免疫球蛋白分子包括两条

17、相同的轻链和重链。2)2)轻轻链链：可可变变区区、恒恒定定区区、连连接接区区都都由由位位于于同同一一染染色色体体不不同同位位置置的的DNADNA片片段段编编码码，在在形形成成活活性性基基因因前前，上上述述各各一一个个基基因因通过染色体内重组成连到一起。通过染色体内重组成连到一起。3)3)重链：可变区、恒定区、连接区、歧化区重链：可变区、恒定区、连接区、歧化区（二）、转录水平的调控：（二）、转录水平的调控： 转转录录水水平平的的调调控控是是真真核核基基因因表表达达调调控控中中最最重重要要的的环环节节，大大多多数数生生物物基基因因在在转转录录水水平平的的调调控控是是决决定定细细胞胞质质中中mRNA

18、mRNA水水平平的的一一个个最最重重要要方方式式，调调控控主主要要通通过过反反式式作作用用因子和因子和RNARNA聚合酶的相互作用来实现。聚合酶的相互作用来实现。反反式式作作用用因因子子是是一一类类细细胞胞核核内内存存在在的的蛋蛋白白质质，是是与与特特异异的的DNADNA序序列列（顺顺式式作作用用元元件件）结结合合的的调调控控蛋蛋白白。它它通通过过识识别别并并结结合合上上游游启启动动子子元元件件和和增增强强子子中中的的顺顺式式元元件件，激激活活或或阻阻遏遏基基因因的的表表达达。它它包括三个功能域：包括三个功能域：DNADNA识别结合域（常有锌指结构）识别结合域（常有锌指结构）转录活性域（富含某

19、些特定氨基酸如谷氨酰氨）转录活性域（富含某些特定氨基酸如谷氨酰氨）蛋蛋白白质质相相互互作作用用结结构构域域（常常具具有有亮亮氨氨酸酸拉拉链链结结构构和和螺螺旋旋环螺旋结构等）。环螺旋结构等）。转录起始复合物转录起始复合物: :转录起始复合物的形成过程有三步：转录起始复合物的形成过程有三步：TATATATA因子结合因子结合TATATATA盒（形成盒（形成TATATATA因子因子DNADNA复合物）复合物）RNARNA polpol识识别别并并结结合合TATATATA因因子子DNADNA复复合合物物（闭闭合合复复合合物物，DNADNA双链没有打开，不能启动转录）双链没有打开，不能启动转录）转转录录

20、起起始始因因子子与与RNARNA polpol结结合合，形形成成转转录录起起始始复复合合物物（开开放复合物，放复合物，DNADNA双螺旋已打开，可以合成双螺旋已打开，可以合成RNARNA）转录起始的调控：转录起始的调控：基基因因表表达达的的转转录录水水平平调调控控主主要要通通过过反反式式作作用用因因子子、顺顺式式作作用用元元件件和和RNARNA聚聚合合酶酶的的相相互互作作用用来来完完成成。调调控控机机制制涉涉及及反反式式作作用用因因子的激活及反式作用因子的作用等。子的激活及反式作用因子的作用等。1.1.反式作用因子的活性调节：反式作用因子的活性调节：1)1)表达调节：迅速合成、迅速降解表达调节

21、：迅速合成、迅速降解2)2)共价修饰：磷酸化去磷酸化、糖基化共价修饰：磷酸化去磷酸化、糖基化3)3)配体结合：激素激素受体（是核内的反式作用因子）配体结合：激素激素受体（是核内的反式作用因子）4)4)蛋蛋白白质质与与蛋蛋白白质质相相互互作作用用：maxmax蛋蛋白白c-c-mycmyc蛋蛋白白（核核内内的反式作用因子）的反式作用因子）2.2.反式作用因子与顺式元件结合的调节：反式作用因子与顺式元件结合的调节：顺式作用元件包括：顺式作用元件包括：上游启动子元件上游启动子元件远远距距离离的的增增强强子子元元件件（上上游游增增强强子子元元件件、下下游游增增强强子元件）子元件）3.3.反式作用因子作用

22、方式的调节：反式作用因子作用方式的调节：反反式式作作用用因因子子通通过过下下列列不不同同的的方方式式作作用用到到RNARNA聚聚合合酶酶结结合合位点从而影响其转录活性：位点从而影响其转录活性：成环成环扭曲扭曲滑动滑动连锁反应连锁反应4.4.反式作用因子的组合式调节：反式作用因子的组合式调节：几种不同的反式作用因子组合，发挥特定的作用。几种不同的反式作用因子组合，发挥特定的作用。（三）、转录后水平的调控：（三）、转录后水平的调控： 转录后水平的调控一般是指基因转录后对转录产物转录后水平的调控一般是指基因转录后对转录产物进行一系列修饰、加工过程，主要包括进行一系列修饰、加工过程，主要包括mRNAm

23、RNA选择性选择性剪切、胞内定位以及剪切、胞内定位以及mRNAmRNA稳定性调节：稳定性调节： DNADNA（核内）核内）转录转录 mRNAmRNA前体前体 加工加工成熟成熟mRNAmRNA 运输运输细胞质细胞质 1.1.mRNAmRNA前体加帽、加尾以调控其稳定性：前体加帽、加尾以调控其稳定性：55加帽（加帽（cappingcapping）：）：7 7甲基鸟苷三磷酸甲基鸟苷三磷酸33端加尾（端加尾（tailingtailing）：）：多聚多聚A A（Poly APoly A）2.2.mRNAmRNA前体的选择性剪接（前体的选择性剪接（splicingsplicing）与拼接：与拼接：1)1)

24、选择性剪切：去除选择性剪切：去除mRNAmRNA前体中的内含子前体中的内含子2)2)选选择择性性拼拼接接：从从同同一一基基因因产产生生若若干干种种有有部部分分相相同同结结构构的的蛋蛋白白质质，即即通通过过MrnauMrnau前前性性的的选选择择性性拼拼接接而而产产生不同的成熟生不同的成熟mRNAmRNA，然后翻译成不同的蛋白质。然后翻译成不同的蛋白质。3)3)选选择择性性表表达达：多多基基因因的的基基因因家家族族中中的的各各成成员员在在特特定定的的细细胞胞中中，在在一一定定的的发发育育阶阶段段和和在在一一定定的的生生理理条条件件下选择性的表达。下选择性的表达。 3.RNA编辑的调控：编辑的调控

25、：RNA编编辑辑（editing）：是是指指转转录录后后的的mRNA前前体体在在编编码码区区发发生生核核苷苷酸酸改改变变的的现现象象，从从而而产产生生出出氨氨基基酸酸序序列列不同的蛋白质。包括：不同的蛋白质。包括：核苷酸的替换核苷酸的替换核苷酸的插入或缺失核苷酸的插入或缺失4.mRNA转运的调控：转运的调控：mRNA前前体体经经过过加加帽帽、加加尾尾、剪剪切切等等加加工工后后通通过过核核膜膜孔孔从从核核内运至胞浆。内运至胞浆。大大约约只只有有20%的的mRNA进进入入胞胞浆浆，留留在在核核内内的的mRNA约约50%会在会在1小时内降解。小时内降解。（四）、翻译水平的调控： 翻翻译译水水平平的的

26、调调控控主主要要是是控控制制mRNAmRNA的的稳稳定定性性和和mRNAmRNA翻翻译译的的起起始始频频率率，是是一一种种迅迅速速控控制制基基因因表表达达的的方方式式，是是各各种种高高等等生生物物广广泛泛采采用的调控方式。用的调控方式。1.1.mRNAmRNA的稳定性，取决于：的稳定性，取决于：1)1)mRNAmRNA的二级结构（不易受外切酶攻击）的二级结构（不易受外切酶攻击）2)2)帽子及其种类帽子及其种类3)3)polyApolyA尾的长短尾的长短4)4)与与mRNAmRNA结合的蛋白质的种类结合的蛋白质的种类2.2.mRNAmRNA翻译起始的调控（即控制翻译起始的调控（即控制mRNAmR

27、NA的可翻译性）：的可翻译性）：1)1)许许多多蛋蛋白白质质因因子子可可以以影影响响蛋蛋白白质质合合成成的的起起始始，如如真真核核生生物物起起始始因因子子2 2（eukaryotic eukaryotic initiation initiation factorfactor，eIFeIF-2-2）的的磷磷酸酸化化会会使使其活性降低，从而减少蛋白质合成。其活性降低，从而减少蛋白质合成。2)2)Recruitment Recruitment factorfactor可可使使maskedmasked mRNAmRNA与与核核糖糖体体、氨氨酰酰基基- -tRNAtRNA、蛋白质结合。蛋白质结合。3.3

28、.真核生物蛋白质合成的自体调控：真核生物蛋白质合成的自体调控：某些蛋白可抑制其自身某些蛋白可抑制其自身mRNAmRNA的翻译的翻译 （五）、翻译后水平的调控：mRNA翻译的产物新生多肽链大多是没有生物翻译的产物新生多肽链大多是没有生物学活性的，必须经过加工、修饰才能成为有活性的学活性的，必须经过加工、修饰才能成为有活性的蛋白质，加工、修饰过程包括：蛋白质，加工、修饰过程包括：1.信号肽的切除：由信号肽的切除：由1530个疏水氨基酸组成的信个疏水氨基酸组成的信号肽可使蛋白质从内质网膜进入高尔基体。号肽可使蛋白质从内质网膜进入高尔基体。2.新生肽链的修饰：磷酸化、羟基化、糖基化、乙新生肽链的修饰：

29、磷酸化、羟基化、糖基化、乙酰化等。酰化等。3.肽链的剪切与正确折叠肽链的剪切与正确折叠五、蛋白表达水平的检测方法及选择五、蛋白表达水平的检测方法及选择1.DNA水平的检测：水平的检测：Southern blotPCRDNA测序测序2.蛋白质表达水平的检测：蛋白质表达水平的检测：SDSPAGE与与Western blotELISA流式细胞仪（流式细胞仪（FACS）检测检测免疫组化免疫组化蛋白质芯片蛋白质芯片3.mRNA水平的检测：水平的检测：Northern blot基因芯片基因芯片Nuclei run-on原位杂交原位杂交RT-PCR实时荧光定量实时荧光定量RTPCR半定量半定量RTPCRSo

30、uthern Blot1.原理：原理：DNADNA杂交杂交2.操作过程：操作过程：1)基因组基因组DNA经过一种或多种限制性内切酶消化经过一种或多种限制性内切酶消化2)消化后的消化后的DNA片段在标准的琼脂糖凝胶上经电泳按照大小片段在标准的琼脂糖凝胶上经电泳按照大小进行分离进行分离3)DNA经原位变性后从凝胶中转移到固定支持物上（通常为经原位变性后从凝胶中转移到固定支持物上（通常为尼龙膜或硝酸纤维素膜）尼龙膜或硝酸纤维素膜）4)变性的变性的DNA可以与标记的可以与标记的DNA、RNA或寡核苷酸探针杂交或寡核苷酸探针杂交5)通过特定的检测方法（如放射自显影）来确定与探针互补的通过特定的检测方法（

31、如放射自显影）来确定与探针互补的带的位置；或通过对经过不同限制性内切酶（单一或联合使带的位置；或通过对经过不同限制性内切酶（单一或联合使用的）消化过的基因组用的）消化过的基因组DNA产生的带的大小及数量的估计产生的带的大小及数量的估计来判断结果来判断结果 重物（重物（400克）克）琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶滤纸滤纸滤纸桥滤纸桥尼龙膜尼龙膜滤纸滤纸吸水纸吸水纸玻璃板玻璃板支持物支持物20XSSC上行毛细管转移示意图上行毛细管转移示意图Polymerased Chain Reaction (PCR)1.原理：原理：高温下双链高温下双链DNA变性为单链变性为单链DNA低温下单链低温下单链DNA与引物寡核苷

32、酸复性与引物寡核苷酸复性中温下由中温下由DNA聚合酶进行互补链的修复复聚合酶进行互补链的修复复制过程制过程2. 方法方法1)10 X 反应缓冲液：反应缓冲液： PH8.8-8.3Mg2+ 0.5-5.0mmol/L，K+ 50-100mmol/L，2)dNTPs（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）3)模板模板DNA4)引物（引物是引物（引物是PCR反应成功与否的关键之一）反应成功与否的关键之一）上游引物上游引物下游引物下游引物5)TaqDNA聚合酶聚合酶6)ddH2O95 C 1min55 C 1min72 C 1min4 C 35XDNA 序列测定1.Sanger双脱氧未端终止法测序原

33、理：双脱氧未端终止法测序原理： 聚聚合合酶酶扩扩增增：PCR扩扩增增的的同同时时在在部部分分产产物物末末端端掺掺入入四四色色荧荧光光标标记记的四种的四种ddNTPs电泳分离、激光读序电泳分离、激光读序 2.ABI 377全自动测序仪进行全自动测序仪进行DNA核苷酸序列测定核苷酸序列测定方法：方法： 1)引物准备：引物准备：纯度：须事先用纯度：须事先用PAGE胶纯化过胶纯化过浓度：配制成浓度：配制成5-105-10pmolpmol/ /uLuL 2)模板准备：模板准备：纯度：推荐使用试剂盒进行纯化纯度：推荐使用试剂盒进行纯化模板量：模板量：PCR产物产物 100-200bp 2-4ng 单链单链

34、 50-100ng 200-500bp 4-10ng 双链双链 200-500ng 500-1000bp 6-20ng 粘粒、粘粒、BAC 0.5-1ug 1000-2000bp 10-40ng 细菌基因组细菌基因组DNA 2-3ug 2000bp 80-2000ng3)测序测序PCR：用于用于PCR产物，单、双链产物，单、双链加样：加样： Terminator Ready Reaction Mix 8.0ul模板模板 不定量不定量引物引物 3.2pmolddH2O 不定量不定量 合计合计 20ul反应：反应：96 C 10sec50 C 5sec60 C 4min4 C 70X4)纯化测序产

35、物：纯化测序产物：加加50ul 95%乙醇，混匀乙醇，混匀置室温（置室温（25度）度）15分钟，分钟，12000g离心离心20分钟，弃上清分钟，弃上清加加150ul 75%乙醇洗乙醇洗1-2次，同上离心次，同上离心10分钟。分钟。弃上清，抽干。弃上清，抽干。5)5)制备测序电泳用制备测序电泳用PAGPAG变性胶变性胶 6)6)预电泳（预电泳（Pre-runPre-run） 7)7)电泳电泳8)8)数据分析数据分析 SDSPAGE与与Western blot(蛋白凝胶电泳及免疫印迹法蛋白凝胶电泳及免疫印迹法)1.原理：原理：1)确保蛋白质解离为单个多肽确保蛋白质解离为单个多肽亚基（亚基（SDS）

36、2)通过分离胶的筛分作用，将通过分离胶的筛分作用，将蛋白质多肽按分子量的大小蛋白质多肽按分子量的大小不同得到分离不同得到分离3)将将蛋白质固定于尼龙膜上蛋白质固定于尼龙膜上4)以抗体识别待检蛋白（抗原）以抗体识别待检蛋白（抗原）固定物1Ab2AbE 蛋白质蛋白质（抗原）（抗原）2. 操作过程操作过程1)样品制备：样品制备：A.收集细胞收集细胞B.PBS洗涤并离心沉淀细胞洗涤并离心沉淀细胞C.加入适量细胞裂解液重悬细胞，置冰上加入适量细胞裂解液重悬细胞，置冰上30分钟分钟D.高速离心，取上清（蛋白溶液）高速离心，取上清（蛋白溶液）E.加入等量加入等量2XSDSPAGE样品缓冲液样品缓冲液F.煮沸

37、煮沸5分钟后上样（或保存于分钟后上样（或保存于20）2)制胶（不连续缓冲胶系统）：制胶（不连续缓冲胶系统）：A.胶的成份：胶的成份：压缩胶压缩胶分离胶分离胶B.胶胶浓度的选择：浓度的选择：丙烯酰氨丙烯酰氨浓度浓度蛋白线性分离范围蛋白线性分离范围/KDa1512107.551043126020803694572123)加样与电泳：加样与电泳：A.加适量的样品（加适量的样品（2001000ug总蛋白量）、对照及蛋白总蛋白量）、对照及蛋白分子量分子量markerB.180200volts电泳直到溴酚蓝跑出凝胶（电泳直到溴酚蓝跑出凝胶（Bio-Rad电泳电泳装置）装置）4)凝胶染色：凝胶染色：A.考马

38、斯亮蓝（考马斯亮蓝（R250）染色染色B.银染银染5)印迹转移：印迹转移：A.原理：带正电荷的蛋白质在电场作用下从负极（凝胶）原理：带正电荷的蛋白质在电场作用下从负极（凝胶）向正极（尼龙膜或硝纤膜）迁移，蛋白质通过疏水作用向正极（尼龙膜或硝纤膜）迁移，蛋白质通过疏水作用结合到膜上结合到膜上B.4条件下，条件下，300mA电泳电泳13小时（小时（Bio-Rad电泳装置）电泳装置）6)封闭：封闭：5%脱脂牛奶或脱脂牛奶或5%BSA，室温下室温下1小时（或小时（或4过夜）过夜）7)一抗反应：一抗反应：A.选择合适的第一抗体选择合适的第一抗体B.适量抗体以适量抗体以5%脱脂牛奶或脱脂牛奶或5%BSA稀

39、释稀释C.室温下室温下1小时（或小时（或4过夜）反应过夜）反应8)二抗反应：二抗反应：A.选择合适的酶标第二抗（第一抗体）体选择合适的酶标第二抗（第一抗体）体B.适量抗体以适量抗体以5%脱脂牛奶或脱脂牛奶或5%BSA稀释稀释C.室温下室温下1小时（或小时（或4过夜）反应过夜）反应9)加生色底物显色加生色底物显色A.HRP的底物：的底物：生色：生色：4氯氯1萘酚萘酚/H2O2发光：发光：ECL溶液（鲁米诺溶液（鲁米诺/4碘代酚碘代酚/ H2O2 ）B.AP的底物：的底物：生色：氮蓝四唑生色：氮蓝四唑/5溴溴4氯吲哚磷酸氯吲哚磷酸发光：发光：AMPPD10)拍片或曝光、洗片拍片或曝光、洗片0 hr

40、2 hr4 hr6 hr8 hr10 hr12 hr14 hrp53p21-TubulinTime after irradiationDNA damage induces down-regulation of histone gene transcription which parallels cell cycle arrest3.优缺点：优缺点：1)优点：优点：不须纯化而直接反映其中单个蛋白表达水平的变化不须纯化而直接反映其中单个蛋白表达水平的变化用于观察细胞处理后最后一步变化，结果最可靠、真实用于观察细胞处理后最后一步变化，结果最可靠、真实实验简单可靠、重复性好实验简单可靠、重复性好2)缺

41、点：缺点：不能反映蛋白质变化的中间过程不能反映蛋白质变化的中间过程灵敏度相对较低，多用于检测细胞表达量较大的蛋白质灵敏度相对较低，多用于检测细胞表达量较大的蛋白质的变化的变化对抗体的依赖度高对抗体的依赖度高4.应用应用：1)直接检测蛋白质的有无、变化直接检测蛋白质的有无、变化2)可直接检测部分蛋白的功能可直接检测部分蛋白的功能3)与其它方法结合后，可检测蛋白蛋白相互作用与其它方法结合后，可检测蛋白蛋白相互作用酶联酶联免疫吸附试验（免疫吸附试验（ELISA）1.原理：原理：1)将将可可溶溶性性蛋蛋白白质质（单单一一组组分分或或混混合合组组分分）固固定定于于酶酶标标板板壁壁上上抗抗原原或或抗体抗体

42、2)检检测测待待检检蛋蛋白白抗体或抗原抗体或抗原固定物1Ab2AbE 蛋白质蛋白质（抗原）（抗原）2. 操作过程（间接法、双抗体夹心法）操作过程（间接法、双抗体夹心法）1)样品处理：样品处理：A.已知样品必须是可溶性蛋白溶于已知样品必须是可溶性蛋白溶于PBS、水等水等B.样品可以是单一组分或混合组分样品可以是单一组分或混合组分2)包板：包板：A.适量的抗原以高适量的抗原以高PH溶液（溶液（PH7.67.8的碳酸盐缓冲液）或的碳酸盐缓冲液）或低低PH溶液（溶液（PH4.8枸椽酸盐缓冲液）稀释后包被酶标板枸椽酸盐缓冲液）稀释后包被酶标板B.4反应反应12天天C.PBS洗涤后，即可使用该板或可较长期

43、保存洗涤后，即可使用该板或可较长期保存3)封闭：封闭：4%脱脂牛奶或脱脂牛奶或4%BSA，室温下室温下1小时（或小时（或4过夜）过夜）4)一抗反应：一抗反应：A.选择合适的第一抗体选择合适的第一抗体B.适量抗体以适量抗体以4%脱脂牛奶或脱脂牛奶或4%BSA稀释稀释C.室温下室温下1小时（或小时（或4过夜）反应过夜）反应8)二抗反应：二抗反应：A.选择合适的酶标第二抗（第一抗体）体选择合适的酶标第二抗（第一抗体）体B.适量抗体以适量抗体以4%脱脂牛奶或脱脂牛奶或4%BSA稀释稀释C.室温下室温下1小时（或小时（或4过夜）反应过夜）反应9)加生色底物显色：加生色底物显色：HRP的底物：的底物： H

44、2O2/TMB10)终止：终止：2M H2SO411)结果判断：结果判断：目测法目测法仪器法仪器法3.优缺点：优缺点：1)优点：优点：用于观察细胞处理后最后一步变化，结果可靠、真实用于观察细胞处理后最后一步变化，结果可靠、真实方法简单（多样）、快速方法简单（多样）、快速可大批量检测标本可大批量检测标本敏感性较高敏感性较高2)缺点：缺点：不能反映蛋白质变化的中间过程不能反映蛋白质变化的中间过程多用于检测细胞表达量较大的可溶性蛋白质的变化多用于检测细胞表达量较大的可溶性蛋白质的变化特异性相对较低，重复性相对较差特异性相对较低，重复性相对较差对所用抗体的依赖度高对所用抗体的依赖度高4.应用应用：大批

45、量、直接检测可溶性蛋白质的有无、变化大批量、直接检测可溶性蛋白质的有无、变化What is Flow Cytometry?Flow Cytometry is a powerful technique for cell counting, sorting and surface marker analyzingFlow Cytometry can provide quantitative information about cell surface markersBased on immunofluorescence technique and computer-aided analysis流式

46、细胞仪（流式细胞仪（FACS）检测检测1.原理：基于单个细胞水平的检测原理：基于单个细胞水平的检测Fluorescence-activated cell sorter (FACS)FACS is one version of Flow Cytometry, which can sort cells by their surface markersIndividual cell is positively or negatively charged based on their fluorescence colorWhen charged cells pass through an electr

47、ic field, they are deflected and hence separated2. FASC的应用：的应用：1)细胞表面标志细胞表面标志2)细胞组分：细胞组分：DNA含量含量RNA含量含量蛋白质含量蛋白质含量3)细胞动力学参数细胞动力学参数细胞增殖细胞增殖细胞凋亡细胞凋亡细胞分化细胞分化4)其它：其它：1.白血病免疫分型白血病免疫分型2.造血干细胞造血干细胞3.血小板血小板4.机体免疫功能机体免疫功能5.各种基因各种基因1.癌基因和抑癌基因癌基因和抑癌基因2.调节基因调节基因3.肿瘤转移相关基因肿瘤转移相关基因4.多药耐药基因多药耐药基因Use Flow Cytometry

48、to examine CD4 and CD8 expression during T cell maturationTreat T cell population with anti-CD4 monoclonal antibody (coupled with dye 1) and anti-CD8 monoclonal antibody (coupled with dye 2) at different maturation stages, then subject the cell population to FACS. Flow Cytometry dot plots will be ge

49、nerated.0.111010010000.11101001000dye 1 intensity(for CD4)dye 2 intensity(for CD8)Double Negative(CD4-,CD8-)Doublepositive(CD4+,CD8+)Singlepositive(CD4-,CD8+)Singlepositive(CD4+,CD8-)die T cell(CD4-,CD8-)dieG2MGG0 0GG1 1s0 200 400 600 8001000GG0 0GG1 1sG2MDNA AnalysisDNA AnalysisDNA contentCount2N2N

50、4N4NNormal Cell CycleNormal Cell Cycle Purdue University Cytometry Laboratories4 hr, control28 hr, irradiatedG1: 94.1%S: 1.5%G2/M: 4.4%G1: 94.1%S: 1.1%G2/M: 4.8%G1: 60.6%S: 34.9%G2/M: 4.5%G1: 96.6%S: 1.6%G2/M: 1.8%10%1%90%4%28 hr, control28 hr, aphidicolin 免疫组织化学法免疫组织化学法1.原理：原理：组织细胞内蛋白质等组分被原位固定组织细胞内

51、蛋白质等组分被原位固定以特异性抗体识别待检蛋白并显色以特异性抗体识别待检蛋白并显色2.方法：方法：1)组织细胞固定：组织细胞固定：4%多聚甲醛，多聚甲醛，RT 10min2)通透性处理：通透性处理：0.5%Triton-X100，RT 10min3)封闭：封闭：5%马血清、马血清、5%羊血清等，羊血清等，37C 15min4)一抗：关键一抗：关键5)二抗：荧光标记二抗：荧光标记6)封片，观察封片，观察NPAT concentrates at a few foci in the nuclei of human cellsG0G1SG2PrometaphaseAnaphaseCell cycle-

52、dependent change of NPAT loci in WI38 cellsFigure 7: IR-induced dispersion of NPAT protein from histone gene loci depends on p53 and p21.Figure 8: Inhibition of Cdk2 activity prevents NPAT foci formation.3.优缺点：优缺点：1)优点：不仅可以定性，更重要的是可以定位优点：不仅可以定性，更重要的是可以定位2)缺点：缺点：无法检测表达量低的蛋白质无法检测表达量低的蛋白质难以定量难以定量高度依赖于抗

53、体高度依赖于抗体操作过程比较复杂操作过程比较复杂4.应用：应用：1)蛋白定位蛋白定位在哪里？在哪里？去哪里？去哪里？2)其它其它Northern Blot1.原理：原理：1)将将RNA固定于尼龙膜上固定于尼龙膜上2)以以DNA探针识别待检探针识别待检mRNA尼尼 龙龙 膜膜AEDCBRNABBB同位素标记的同位素标记的DNA探针探针2. 操作过程操作过程1)总总RNA提取：提取：A.用用Rneasy Mini Kit抽取总抽取总RNA （QIAGEN公司）公司）B.用用700ul SW1洗一次洗一次C.用用500ul RPE洗洗2次次D.用用50ul RNase free ddH2O洗脱两次洗

54、脱两次E.取取2ul加入加入98ul ddH2O，测取测取OD260/280并计算并计算RNA浓度及浓度及总总RNA得量得量2)制胶（变性制胶（变性11.5%Agarose胶）：胶）：A.制备制备100ml含有含有2.2mol/L甲醛的甲醛的1.5%的琼脂糖凝胶，加的琼脂糖凝胶，加1.5克克琼脂糖凝胶粉到琼脂糖凝胶粉到72ml灭菌水中，煮沸溶解后置灭菌水中，煮沸溶解后置55水浴，水浴，均衡后均衡后10ml MOPS电泳缓冲液和电泳缓冲液和18ml去离子甲醛，在化学去离子甲醛，在化学通风橱内灌胶通风橱内灌胶B.加入足够量的加入足够量的1XMOPS电泳缓冲液，预电泳约电泳缓冲液，预电泳约5分钟。备

55、用。分钟。备用。3)RNA样品预处理：样品预处理：A.在一灭菌在一灭菌EP管中建立变性反应：管中建立变性反应：RNA（多达多达20ug）2.0 ul10XMOPS电流缓冲液电流缓冲液2.0 ul甲醛甲醛4.0 ul甲酰氨甲酰氨10.0ul溴化乙淀溴化乙淀1.0 ulB.6520分钟变性，立即置冰上分钟变性，立即置冰上10分钟分钟C.简短离心后备用简短离心后备用4)电泳：电泳：A.上样：等量总上样：等量总RNA/样品样品B.45volts/cm电泳电泳57小时。小时。不能用过高的电压！不能用过高的电压！5)转移：转移：经典方法：搭建经典方法：搭建“金字塔金字塔”，转移过夜。，转移过夜。 重物（重

56、物（400克）克）琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶滤纸滤纸滤纸桥滤纸桥尼龙膜尼龙膜滤纸滤纸吸水纸吸水纸玻璃板玻璃板支持物支持物20XSSC上行毛细管转移示意图上行毛细管转移示意图6)DNA探针的制备：探针的制备：A.在一灭菌在一灭菌EP管中建立反应：管中建立反应：2.0ul模板模板GAPDH PCR产物产物（150bp,100ng/ul）6.0ul10 X EcoPol buffer6.0uldNTPs（无无dCTP）3.0ul5-GAPDH(100ng/ul)3.0ul3-GAPDH(100ng/ul)31.0ul ddH2OB.煮沸煮沸10分钟，立即置冰上分钟，立即置冰上10分钟：分钟：C.加入：加入

57、：2.5ulKlenow6.5ul32P-dCTPD.室温下孵育室温下孵育6小时小时E.过柱纯化已标记探针（过柱纯化已标记探针（Phamarcia试剂盒）试剂盒）A.取取相等相等CPM量量RNA，加入加入2ml TES/0.6M NaCL10mM TES10mM EDTA0.2%SDSB.在杂交炉中，在杂交炉中，68反应过夜反应过夜C.用用2XSSC/0.1%SDS洗膜三次洗膜三次D.用用0.1XSSC/0.1%SDS洗膜三次洗膜三次10)曝光于曝光于X光胶片光胶片7)Crosslink8)预预杂交杂交加入加入10ml杂交混合液，杂交混合液， 68反应反应45分钟分钟9)杂交杂交H2AH3H4

58、GAPDH0 hr2 hr4 hr6 hr8 hr10 hr12 hr14 hrTime after irradiationC.H2BH1DNA damage induces down-regulation of histone gene transcription which parallels cell cycle arrestHCT116（p53+/+,p21+/+)D.E.0 hr2 hr4 hr6 hr8 hr10 hr12 hr14 hr24 hrH2AH4GAPDHTime afer GFP-p21 inductionH1H2BH3Inhibition of CDK activi

59、ty disperses NPAT from histone gene promoters and down-regulates histone gene expressionA.0204060801001200468101214Time after irradiation (hr)% controlS phaseH1H2AH2BH4H2AH4GAPDHH2BH10 hr4 hr6 hr8 hr10 hr12 hr14 hrTime after irradiationHCT116（p53-/-,p21+/+)Down-regulation of histone gene expression

60、induced by DNA damage depends on p53 and p21S phaseH1H2AH2BH4BH2AH4GAPDHH2BH1Time after irradiation0 hr2 hr4 hr6 hr8 hr10 hr12 hr14 hr020406080100120% control0468101214Time after irradiation (hr)2HCT116（p53+/+,p21-/-)Down-regulation of histone gene expression induced by DNA damage depends on p53 and

61、 p213.优缺点：优缺点：1)优点：优点：真实反映细胞处理后真实反映细胞处理后mRNA水平的变化水平的变化敏感性较高敏感性较高2)缺点：缺点：使用同位素使用同位素不能反映蛋白质变化的最终结果及不能反映蛋白质变化的最终结果及mRNA变化的原因变化的原因多用于检测细胞内较高丰度多用于检测细胞内较高丰度mRNA的的变化变化实验过程较为复杂实验过程较为复杂4.应用应用：观察细胞处理后观察细胞处理后mRNA水平的变化，以印证蛋白质水平的变化，以印证蛋白质的变化的变化Nuclei Run-on1.原理：原理：1)迅速冷冻，使细胞核内正在转录的迅速冷冻，使细胞核内正在转录的mRNA复合体处于冻结状态复合体

62、处于冻结状态2)加入加入ATP/GTP/CTP/32P-UTP，重新恢复重新恢复mRNA的转录并使之结束（标记冻结时正的转录并使之结束（标记冻结时正在转录的在转录的mRNA)，提取提取mRNA3)以以cDNA探针及对照探针及对照cDNA标记尼龙膜后检标记尼龙膜后检测目标测目标mRNANuclei Run-on 原理图解原理图解基因基因ADNAmRNA基因基因B基因基因CFreeze加入加入ATP/GTP/CTP/32P-UTP并使并使中止的转录过程结束中止的转录过程结束Run offDNAmRNARNA isolation尼尼 龙龙 膜膜基因基因B（DNA）看家基因看家基因（DNA）Hybri

63、dization1)细胞核的提取细胞核的提取A.处理细胞（培养于处理细胞（培养于10厘米培养皿）厘米培养皿）B.吸去培养液，迅速将细胞放于冰上吸去培养液，迅速将细胞放于冰上C.用用10ml冰预冷的冰预冷的PBS洗细胞一次洗细胞一次D.加加10ml冰预冷的冰预冷的PBS，刮下刮下细胞，移入离心管细胞，移入离心管E.500g离心离心5分钟后弃去液体分钟后弃去液体F.边混悬边加入边混悬边加入4ml NP40裂解液裂解液10mM Tris-HCL, PH7.410mM NaCL3mM MgCL20.5% NP-40G.置冰上孵育置冰上孵育5分钟，同前离心，弃去上清分钟，同前离心，弃去上清2. 操作过程

64、操作过程H.以以4ml NP40裂解液重悬沉淀、洗涤，同前离心并弃去上裂解液重悬沉淀、洗涤，同前离心并弃去上清清I.以以200ul甘油储存液重悬沉淀，保存于液氮中甘油甘油储存液重悬沉淀，保存于液氮中甘油50mM Tris-HCL, PH8.340%甘油甘油5mM MgCL20.1mM EDTA2)Run-onA.将冻存的细胞核解冻将冻存的细胞核解冻B.加入加入200ul 2X反应缓冲液反应缓冲液10mM Tris-HCL, PH85mM MgCL20.3M KCL5mM DTT1mM ATP1mM CTP1mM GTP加入加入32P-UTP100uCi于于30反应反应30分钟，同时震荡分钟，同

65、时震荡2)总总RNA提取：提取：A.加入加入1.4ml RLT（QIAGEN公司）公司）B.用用Rneasy Mini Kit抽取总抽取总RNAC.用用700ul SW1洗一次洗一次D.用用500ul RPE洗洗4次次E.用用110ul RNase free ddH2O洗脱两次洗脱两次F.取取3ul加入液闪检测液测取加入液闪检测液测取CPM值值3)探针探针cDNA标记尼龙膜：标记尼龙膜：A.0.5N NaOH处理尼龙膜处理尼龙膜B.510ug/样点膜样点膜C.自然晾干自然晾干D.Crosslink4)杂交：杂交：A.取取相等相等CPM量量RNA，加入加入2ml TES/0.6M NaCL10m

66、M TES10mM EDTA0.2%SDSB.在杂交炉中，在杂交炉中，68反应过夜反应过夜C.用用2XSSC/0.1%SDS洗膜三次洗膜三次D.用用0.1XSSC/0.1%SDS洗膜三次洗膜三次5)曝光于曝光于X光胶片光胶片GAPDHH1H3Irradiation+-+-GAPDHH2BH4020406080100p21+/+p21-/-% controlH1H2BH3H4A.B.p21+/+p21-/-DNA damage induces down-regulation ofhistone gene transcription3.优缺点：优缺点：1)优点：优点：反映的是反映的是mRNA转录水平的变化转录水平的变化用于观察细胞处理后最早期蛋白合成的变化用于观察细胞处理后最早期蛋白合成的变化2)缺点：缺点：不能直接反映蛋白质的变化不能直接反映蛋白质的变化大剂量同位素应用大剂量同位素应用操作过程复杂，实验中同位素极易污染环境操作过程复杂，实验中同位素极易污染环境仅用于检测优势表达的蛋白变化仅用于检测优势表达的蛋白变化4.应用应用：检测检测mRNA水平变化是否发生在转录水平，即早期。水平变化是否发生在转录水平，即早期。原位杂交RTPCR