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1、色谱分析在海洋真菌活性成色谱分析在海洋真菌活性成分筛选中的应用分筛选中的应用答辩人答辩人答辩人答辩人: : : :专专专专 业业业业: : : :环境科学环境科学环境科学环境科学 071071071071导导导导 师师师师: : : :论文框架论文框架研究研究背景背景研究课题研究课题论文要点论文要点结论结论1234研究背景研究背景色谱技术是分析化学领域最重要的分离分析手段。随着色谱研究工作的迅猛发展，各种新的色谱方法和检测技术日趋成熟，色谱联用技术因其具有高速、高效、高分辨、微量检测及分析自动化的性能和技术优势，而显示出广阔的应用前景。u在线光谱分析在线光谱分析uHPLC/UVuHPLC/MS
2、uHPLC/NMRu常规光谱分析常规光谱分析uUVuMSuNMR真菌代谢产物是非常复杂的混合物，其所含化合物可达数百种之多。对其中每一个成分进行分离、纯化及结构鉴定是一项既耗钱又耗力的工作。液相色谱/光谱（紫外、质谱及核磁共振）联用新技术主要就是针对这种情形，为了节约时间、经费和无谓的重复性劳动而出现的。研究课题研究课题l 研究内容研究内容本论文实验主要是针对一株海洋真菌的培养条件进行优化，然后进行初步的柱色谱分离与纯化，配以TLCHPLC/UV检测，渴望得到含有目标化合物的真菌培养条件。l课题意义课题意义海洋微生物代谢产物多样且具有药物活性、且微生物培养方便。利用这些丰富的海洋天然产物可用来
3、生产高活性的海洋药物。本次研究为后续的专性研究提供有利的基础保障。论文要点论文要点l试验方法试验方法l菌株的培养条件优化菌株的培养条件优化l真菌代谢产物的化学筛选真菌代谢产物的化学筛选l结果与分析结果与分析l结论结论菌株培养条件优化菌株培养条件优化l培养基配制：培养基配制：nPDB培养基：培养基：葡萄糖葡萄糖20g/L，酵母粉，酵母粉3g/L，蛋白胨蛋白胨5g/L，味精，味精5g/L,pH6.0，50%陈海水陈海水煮土豆（煮土豆（200g/L），蒸馏水定容至），蒸馏水定容至1L。 nH1培养基：培养基：山梨醇山梨醇20g/L，麦芽糖，麦芽糖20g/L，味，味精精10g/L，色氨酸，色氨酸0.5
4、g/L，酵母粉，酵母粉3g/L，K2HPO40.5g/L，MgSO47H2O 0.3g/L,50%陈海水配制陈海水配制,pH6.5，蒸馏水定容至，蒸馏水定容至1L。 n寡营养培养基（寡营养培养基（GMPY）：）：葡萄糖葡萄糖6.7g/L，蛋白胨蛋白胨5g/L，酵母粉，酵母粉3g/L，甘露醇，甘露醇20 g/L，自来水配制，自来水配制，pH7.0，蒸馏水定容至，蒸馏水定容至1L。n大米培养基（大米培养基（RICE）：）：大米大米100 g/L，蛋白，蛋白胨胨0.3g/L，海水，海水130 mll培养方法：培养方法：n液体培养基选用摇床动态培养，固体培养基液体培养基选用摇床动态培养，固体培养基选用
5、静态培养，于生化培养箱中选用静态培养，于生化培养箱中28光照条光照条件下分别静置培养件下分别静置培养n摇床培养在摇床培养在4、6、8、10、12、14天灭菌；天灭菌；固体静态培养在固体静态培养在7、10、14、17、21、25、30天灭菌。天灭菌。菌株培养条件优化菌株培养条件优化真菌代谢产物的分离提纯真菌代谢产物的分离提纯u真菌代谢产物的分离纯化通过柱层析色谱的梯真菌代谢产物的分离纯化通过柱层析色谱的梯度洗脱来实现度洗脱来实现化学检测化学检测TLC检测检测HPLC/UV检测检测仪器为仪器为Dionex HPLC仪仪(P680 HPLC 蠕动泵蠕动泵,UVD 340U紫外可见发光二极管阵紫外可见
6、发光二极管阵列检测器列检测器,C18柱柱(5m,8.0250mm)结果与分析结果与分析u培养条件优化培养条件优化结果与分析结果与分析u真菌代谢产物的化学筛选真菌代谢产物的化学筛选TLC 检测检测结果与分析结果与分析u真菌代谢产物的化学筛选真菌代谢产物的化学筛选 TLC TLC 检测检测结果与分析结果与分析u真菌代谢产物的化学筛选真菌代谢产物的化学筛选HPLC检测检测结果与分析结果与分析u真菌代谢产物的化学筛选真菌代谢产物的化学筛选lHPLC/UV检测检测n目标化合物（五种标准物质）的化学结构和目标化合物（五种标准物质）的化学结构和色谱图色谱图真菌代谢产物的化学筛真菌代谢产物的化学筛选选262.
7、2 nm15.173min261.5 nm17.902min260.8 nm19.228min261.1 nm18.890min262.2 nm18.812min目标化合物A1-A5的化学结构的碳骨架基本一致，属于同一类物质，这决定了五种物质基本一致的紫外吸收曲线。但是五种物质的1、2、3位取代基稍有不同，所以保留时间和紫外吸收的最大吸收波长稍有差别。结果与分析结果与分析u真菌代谢产物的化学筛选真菌代谢产物的化学筛选n四种培养基的四种培养基的HPLC/UV分析分析nRICE培养基中主要色谱峰培养基中主要色谱峰结果与分析结果与分析u真菌代谢产物的化学筛选真菌代谢产物的化学筛选nPBD培养基中主要
8、色谱峰培养基中主要色谱峰结果与分析结果与分析u真菌代谢产物的化学筛选真菌代谢产物的化学筛选nGMPY培养基中主要色谱峰培养基中主要色谱峰结果与分析结果与分析u真菌代谢产物的化学筛选真菌代谢产物的化学筛选nH1培养基中主要色谱峰培养基中主要色谱峰结论结论u真菌培养条件优化真菌培养条件优化n真菌在培养真菌在培养一周一周左右时，次级代谢最为旺盛左右时，次级代谢最为旺盛n培养时间对于真菌的次级代谢产物的种类影培养时间对于真菌的次级代谢产物的种类影响不大，对于产物产量稍有影响。响不大，对于产物产量稍有影响。n真菌的培养基成分即培养基的营养物质配比真菌的培养基成分即培养基的营养物质配比对于真菌的次级代谢产物丰富度和成分含量对于真菌的次级代谢产物丰富度和成分含量均有显著影响。均有显著影响。RICE培养基所产生的代谢培养基所产生的代谢产物种类和产量最大。产物种类和产量最大。结论结论u目标化合物的化学筛选目标化合物的化学筛选nRICE和和PDB培养基培养条件下，各检出一培养基培养条件下，各检出一种目标化合物种目标化合物nGMPY和和H1培养基培养条件下，各检出一培养基培养条件下，各检出一种新型化合物，以前未曾分离得到的双紫外种新型化合物，以前未曾分离得到的双紫外吸收峰类型的化合物吸收峰类型的化合物
