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1、食品质量安全检测新技术食品质量安全检测新技术讲课教师：讲课教师： 谢远红谢远红课程主要内容课程主要内容一一.现阶段存在的食品质量安全问题现阶段存在的食品质量安全问题二二.食品质量安全问题中检测技术食品质量安全问题中检测技术一一. 现阶段存在的食品质量安全问题现阶段存在的食品质量安全问题1. 转基因食品的安全性2. 食源微生物的安全性3. 生物毒素的安全性4. 食品原料中农药、兽药残留的安全性5. 抗生素、激素与有害物质残留转基因食品的安全性转基因食品的安全性转基因食品的概念转基因食品的概念“转基因” 是指利用分子生物学手段将外源性基因转移到某种特定生物体中，使其生物性状或机能发生部分改变。 转
2、基因食品（genetically modified foods, GM食品）：就是以转基因生物体直接作为食品或以其为原料加工生产的食品 。 转基因食品的发展史转基因食品的发展史n转基因食品的发展历史实际上就是基因工程、转转基因食品的发展历史实际上就是基因工程、转基因技术等生物技术的发展史。基因技术等生物技术的发展史。 n1982年年，将大鼠生长激素重组基因导入小鼠受精将大鼠生长激素重组基因导入小鼠受精原核内，获得了人类历史上第一个转基因动物原核内，获得了人类历史上第一个转基因动物转基因转基因“超级鼠超级鼠”，比一般的小白鼠大一倍。，比一般的小白鼠大一倍。 n1983年年，世界上第一例转基因植物
3、（一种含有抗，世界上第一例转基因植物（一种含有抗生素药类抗体的烟草）在美国成功培植。生素药类抗体的烟草）在美国成功培植。n1994年年，孟山都，孟山都(Monsanto)公司下属公司下属Calgene公司公司研制的研制的延熟保鲜转基因番茄延熟保鲜转基因番茄在美国批准上市，这在美国批准上市，这是发达国家批准商业化的第一个转基因作物。是发达国家批准商业化的第一个转基因作物。 转基因棉花 中国的转基因羊日本研发的转基因大豆各种各样的转基因水果浙江省种植的转基因油菜 自自1996年，转基因农作物获得批准进入田间年，转基因农作物获得批准进入田间试验以来，全球转基因作物研发和产业迅猛发展，试验以来，全球转
4、基因作物研发和产业迅猛发展，创造了巨大的经济、社会和生态效应。从此，世创造了巨大的经济、社会和生态效应。从此，世界上陆续有国家批准转基因作物的种植，转基因界上陆续有国家批准转基因作物的种植，转基因作物的种植面积、种类以及商业效应更是逐年攀作物的种植面积、种类以及商业效应更是逐年攀升，这就是转基因作物的商业化种植。自升，这就是转基因作物的商业化种植。自1996年年转基因作物首次商业化以来，转基因作物面积累转基因作物首次商业化以来，转基因作物面积累计达到近计达到近10亿公顷，增长了亿公顷，增长了80倍。倍。 n转基因农作物的种植是现代农业发展的重要手段和重要领转基因农作物的种植是现代农业发展的重要
5、手段和重要领域。域。2010年国际农业生物技术应用组织服务（年国际农业生物技术应用组织服务（ISAAA）在北京发表在北京发表2009年度全球生物技术年度全球生物技术/转基因作物商业化发转基因作物商业化发展态势报告，认为全球第二轮生物技术发展浪潮已经开始。展态势报告，认为全球第二轮生物技术发展浪潮已经开始。ISAAA报告认为，去年全球生物技术发展一个最显著的进报告认为，去年全球生物技术发展一个最显著的进步是中国一项里程式的决策步是中国一项里程式的决策转基因抗虫水稻转基因抗虫水稻和和植酸玉植酸玉米米获得生物安全发展证书。水稻和玉米分别是世界上最重获得生物安全发展证书。水稻和玉米分别是世界上最重要的
6、粮食作物和饲料作物，因此，对二者的生物安全的认要的粮食作物和饲料作物，因此，对二者的生物安全的认证对未来转基因作物在中国、亚洲乃至全世界的推广有巨证对未来转基因作物在中国、亚洲乃至全世界的推广有巨大的影响。大的影响。nISAAA报告显示，去年报告显示，去年25个个国家的国家的1400万万农民种植了农民种植了1.34亿亿公顷转基因作物，面公顷转基因作物，面积较上一年增长了积较上一年增长了7%，其中，其中90%来自发来自发展中国家的小型农户。性状面积或展中国家的小型农户。性状面积或“实际实际面积面积”达到达到1.8亿亿公顷，比公顷，比2008年增长了年增长了1400万万公顷。公顷。n美国（美国（6
7、400万万公顷）、巴西（公顷）、巴西（2140万万公公顷）、阿根廷（顷）、阿根廷（2130万万公顷）分列转基因公顷）分列转基因作物种植面积的前三位，中国（作物种植面积的前三位，中国（370万万公顷）公顷）列第六位。列第六位。 n截止截止2008年底，我国已经批准年底，我国已经批准22 种种国外转基因国外转基因作物进口许可证，分别是转基因大豆作物进口许可证，分别是转基因大豆GTS-40-3-2，转基因玉米（，转基因玉米（Mon810，Bt11，Bt176，Mon863，NK603，GA21，T25，MON59122，TC1507，MON88017），转基），转基因油菜（因油菜（Ms1Rf1、Ms
8、1Rf2、Ms8Rf3、GT73、T45、Oxy235、Tapos19/12）和转基因棉花）和转基因棉花（Mon531、Mon1445、Mon15985、Mon88913）。）。n20012008 年，中国进口转基因大豆累年，中国进口转基因大豆累计超过计超过2 亿吨。在中国市场上亿吨。在中国市场上70%的大豆的大豆制品中含有转基因成分，像大豆油、色拉制品中含有转基因成分，像大豆油、色拉油、磷脂、酱油、膨化食品等等，进入中油、磷脂、酱油、膨化食品等等，进入中国消费者的生活转基因食品主要是使用转国消费者的生活转基因食品主要是使用转基因大豆加工的食用油和豆制品。另外在基因大豆加工的食用油和豆制品。另
9、外在市场上发现转基因米粉、饼干、咖啡等，市场上发现转基因米粉、饼干、咖啡等，中国正在接受更多的国外转基因食品。中国正在接受更多的国外转基因食品。羞羞答答的转基因大豆油羞羞答答的转基因大豆油转基因植物的构建策略转基因植物的构建策略作物转入的外源基因的类型及方法作物转入的外源基因的类型及方法n类型：转基因作物涉及的遗传改良性状主要包括：抗除草剂基因占总面积的71%，抗虫基因占28%，抗病毒基因占1%。n方法：农杆菌介导法：农杆菌中有一种致瘤的环型DNA，称为Ti质粒。被农杆菌感染的植物之所以长瘤正是由于TDNA插入了植物染色体。从此，人们便利用这种天然的转化体系向植物转基因。基因枪：把所要转入的基
10、因包被在金粉或钨粉上之后，利用基因枪将其打入培养细胞中来完成转基因过程。转基因大豆转基因大豆转基因大豆的研究主要以耐除草剂和改善大豆品质为主：n耐除草剂：在美国有3个转基因大豆品种已应用，最多的是对除草剂草丁膦和草甘膦具有耐性的个品种。2002年种植面积占美国大豆的74%。可见，目前美国的大豆生产已经基本上普及了耐除草剂的转基因品种。 n改善大豆成分：Mazur等(1999) 获得了种子油酸相对含量高达85%的大豆新品系，而且农艺性状优良。转基因玉米转基因玉米转基因玉米的研究主要集中于提高抗虫性和耐除草剂方面。n在美国，转基因玉米的种植面积占玉米总种植面积的比例在35%左右。n其中抗虫Bt玉米
11、的种植面积发展最快，所占近比例最大，2002年约占玉米种植总面积的24；耐除草剂玉米占7 10之间；兼具抗虫和耐除草剂特性的转基因玉米品种种植规模仍然不大，近年来仅占玉米种植总面积的1 -2。 转基因水稻转基因水稻 转基因水稻的研究主要集中在以下三个方面：n提高光合效率：将C4作物玉米的PEPC基因导入水稻的基因组，从而改良了水稻的光合作用效率。n提高营养品质：Ye等（2000）成功地将来自其他物种的psy、cntl和lcy基因整合到水稻基因组中，解决了水稻胚乳不能合成维生素A的难题。n增加抗逆性：纽约康乃尔大学的加戈等将大肠杆菌中两种负责合成海藻糖的基因导入到籼稻中。转基因水稻在恶劣环境条件
12、下的生存能力比普通水稻更强。n到底我国目前有多少转基因食品？ 已经超过2000万吨。n目前我国极少生产粮食、油料作物等转基因食品，只有一些转基因抗虫棉，但并不进入人的食物链。我国的转基因食品基本上都是进口的。n排在前三位的是：大豆、玉米、油菜。我国去年进口大豆3500万吨。目前我国进口大豆主要用做加工原料，生产豆油、豆腐、豆奶等制品。转基因食品的主要功能转基因食品的主要功能1.1.改善食品品质和加工特性改善食品品质和加工特性2.2.提高农作物的抗病虫害性能提高农作物的抗病虫害性能3.3.提高果蔬产品的耐储存性和保鲜期提高果蔬产品的耐储存性和保鲜期4.4.改善发酵食品品质和风味改善发酵食品品质和
13、风味5.5.改良动物性食品品质改良动物性食品品质转基因作物的利与弊转基因作物的利与弊 n转基因作物的带来的效益转基因作物的带来的效益 ISAAA报告认为，转基因作物已经在以下几个重要方面做出报告认为，转基因作物已经在以下几个重要方面做出了贡献：了贡献：（1）保证粮食安全，保证粮食价格的稳定，解决发展中国）保证粮食安全，保证粮食价格的稳定，解决发展中国家人民的饥饿问题。世界人口数量，特别在发展中国家，家人民的饥饿问题。世界人口数量，特别在发展中国家，还在持续增长，它带来的粮食短缺问题，也就成为了一个还在持续增长，它带来的粮食短缺问题，也就成为了一个全世界关注的重要问题。因此，通过基因工程技术，特
14、别全世界关注的重要问题。因此，通过基因工程技术，特别是转基因技术，以获得高产的优良农作物品种，可能将是是转基因技术，以获得高产的优良农作物品种，可能将是解决解决21世纪不断增加人口对粮食需求的重要途径之一。世纪不断增加人口对粮食需求的重要途径之一。（2）创造了明显的可观的经济效益。转基因农作物的发展）创造了明显的可观的经济效益。转基因农作物的发展能够带来明显的经济效益，如加拿大，在能够带来明显的经济效益，如加拿大，在1996年种植了年种植了1200万万hm 耐除草剂油菜后，产量提高耐除草剂油菜后，产量提高9 ，经济效益，经济效益达达600万美元；中国种植转基因抗虫棉花，从万美元；中国种植转基因
15、抗虫棉花，从19972000年的年的4年，总的经济效益达年，总的经济效益达337亿美元。在亿美元。在2000年世界转基因作物产品的价值为年世界转基因作物产品的价值为3O亿美元，预计亿美元，预计2010年年时价值可达时价值可达800亿美元。由此可见，经济效益是十分明显亿美元。由此可见，经济效益是十分明显的。的。转基因食品的安全性转基因食品的安全性 1.1.未进行较长时间的安全性试验：基因化食品改变了我们所食用食品的自然属性，它所使用的生物物质不是人类食品安全提供的部份，未进行长时间的安全试验，无法确定这类食品是否安全。 英国一位科学家在著名医学杂志柳叶刀上发表论文，宣称实验用的大鼠在食用转基因马
16、铃薯以后，肝脏受到损伤，免疫系统受到削弱，由此掀起了国际社会对转基因食品安全性广泛争论的序幕。对人类健康产生的安全性问题对人类健康产生的安全性问题2 产生毒素：基因化食品能产生不可预见的生物突变，会在食品中产生较高水平和新的毒素。Losey,J.E.等（1999）报道，在一种植物马利筋叶片上撒有转基因Bt玉米花粉后，普累克西普斑蝶食用叶片就少，长得慢，4天的幼虫的死亡率44%。而对照组（饲喂不撒Bt玉米花粉的叶片）无一死亡。转基因作物产生的杀虫毒素可由根部渗入周围，但尚不清楚会产生何种影响，是否会对人类的健康产生影响同样未知。 3 过敏或变态反应：基因技术会在食品中产生不能预见的和未知的变态反
17、应原。据报告，对巴西坚果产生过敏的主体也会对用该坚果基因工程化而得到的大豆产生过敏。科学家把巴西胡桃的特性移植到黄豆上去，结果却使一些对胡桃过敏的人在摄取黄豆时有过敏的可能。植物凝血素（Lectin）对有些害虫来说是有毒的，转基因食品不得含有此类有毒物质。 4 减少食品的营养价值或降解食品中重要的成份：基因化的目的是去除或灭活人们认为不需要的物质，这些物质可能是未知的。美国的研究资料表明，在具有抗除草剂基因的大豆中，异黄酮类激素等防癌的成份减少了。具有芳香、有光泽的红色蕃茄能贮藏几周，但营养价值较低。消费者在购买水果或蔬菜时，仅依靠外观和质地，因此，不能准确判定该产品的真实质量。5 产生抗菌素
18、耐药性细菌：基因技术采用耐抗菌素（如抗卡那霉素、氨苄青霉素、新霉素、链霉素等）基因来标识转基因化的农作物，这就意味着农作物带有耐抗菌素的基因。荷兰科学家发表在新科学家杂志的试验结果称，设计一人造胃，对人消化转基因食物的过程进行模拟，发现DNA滞留在肠内，同时一些转基因细菌能够把自己的抗生素抗性基因转移给人造胃的细菌。 6. 副作用能对人体产生危害：Mayeno,A.N.等（1994）报告，发生一种新的，不明原因的病症，主要表现为嗜酸性肌痛。临床表现有麻痹、神经问题、痛性肿胀、皮肤发痒、心脏出现问题，记忆缺乏、头痛、光敏、消瘦（Brenneman,D.E.等，1993；Love,L.A.等，19
19、93）。后查明系日本一公司生的基因化工程细菌产生的色氨酸所致。食用者在3个月后发病，导致37人死亡，1500人体部份麻痹，5000多人发生偶尔性无力。据测定，含量为0.1%便可杀死人体。 1 除草剂使用的增加：科学家估计，基因化的农作物对除草剂具有抵抗力，实际应药量高于正常的3倍。农民知道其作物对除草剂有抵抗力，会大量使用除草剂。2 杀虫剂使用的增加：农作物常使用自己特有的杀虫剂，基因化的农作物对杀虫剂有抵抗力，这就意味着比以前有更多的杀虫剂进入我们的食品和田野。有报导，将优良的特定的基因（如抗杀虫剂）植入作物，可能会使周围野生植物一并获得改良，呈现出抗杀虫剂的特征。 对环境产生的安全性问题对
20、环境产生的安全性问题3 基因污染：转基因作物通过基因流可使野生近缘种变为杂草，成为“超级杂草”。有资料证明，把转基因油菜释放后，当大田的油菜附近有近缘杂草时，在萌发的后代种子中有93%被证实是种间杂草。4 对非目标生物有伤害，对生物多样性形成威胁：Birch,A.等（1996/7）的实验结果表明，用转基因马铃薯饲喂蚜虫，雌虫的产卵量减少1/3，用喂转基因马铃薯长大的雄蚜虫与对照组蚜虫交配，所得的未受精卵数量多4倍，已受精卵在未孵化前比对照组死亡率高近3倍，以转基因马铃薯蚜虫为食物的雌飘虫的存活时间比对照组少一半，如果大规模的种植转基因作物，可能会减少有益昆虫的种群。转基因食品的检测技术转基因食
21、品的检测技术 转基因植物产品的安全性评估极为重要，但可能更为受到人们关注的是转基因产品的检测技术。目前要测试植物产品是否含有基因改造成分，或植物产品是否经过基因改造，主要有两种方法： 1 检测是否有外来基因或DNA；2 检测是否有外源的蛋白质。 制订了12项转基因产品检测行业标准和7项国家标准；研制并生产了10种转基因产品检测试剂产品；建立了转基因产品检测信息库和一个转基因产品信息网站。n大豆中转基因成份定性PCR检测方法n玉米中转基因成份定性PCR检测方法n油菜籽中转基因成份定性PCR检测方法n烟草中转基因成份定性PCR检测方法n植物性饲料中转基因成份定性PCR检测方法n马铃薯中转基因成份定
22、性PCR检测方法n棉花中转基因成份定性PCR检测方法食源微生物的安全性时间 微生物名称 食品源 感染人数 国家1984鼠伤寒沙门氏菌沙拉酱 美国1985鼠伤寒沙门氏菌巴氏消毒奶170 000 美国 1989金黄色葡萄球菌蘑菇罐头 美国1991甲肝病毒毛蚶300 000 中国1994肠炎沙门氏菌 巴氏消毒液态冰激凌224 000 美国1996大肠杆菌 O157:H7 萝卜8 000 日本1997肠炎沙门氏菌蛋和肉制品2013 比利时2000金黄色葡萄球菌雪印牛奶日本2001单增李斯特菌 法国世界上食源微生物感染群发事件世界上食源微生物感染群发事件根据WHO估计：发达国家食源性疾病的漏报率在90%
23、以上发展中国家食源性疾病的漏报率95%以上“冰山一角冰山一角”沙门氏菌沙门氏菌（禽、畜肉）（禽、畜肉）副溶血性弧菌副溶血性弧菌（水产品）（水产品）蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌（剩饭）（剩饭）肉毒梭菌肉毒梭菌（发酵制品、肉制品）（发酵制品、肉制品）单核细胞增生李斯特菌单核细胞增生李斯特菌（乳制品、冷藏食品）（乳制品、冷藏食品）大肠杆菌大肠杆菌O157:H7（肉制品）等。肉制品）等。微生物性食物中毒常见的致病菌和食物：微生物性食物中毒常见的致病菌和食物：方法修订征求意见文本方法修订征求意见文本nGB4789.2 GB4789.2 菌落总数测定菌落总数测定nGB4789.
24、3.1GB4789.3.1大肠菌群测定大肠菌群测定 nGB4789.3.2GB4789.3.2粪大肠菌群测定粪大肠菌群测定 nGB4789.3.4GB4789.3.4大肠杆菌检验大肠杆菌检验 nGB4789.10.1GB4789.10.1 金黄色葡萄球菌定性检验金黄色葡萄球菌定性检验 nGB4789.10.2GB4789.10.2 金黄色葡萄球菌定量检验金黄色葡萄球菌定量检验生物毒素的安全性也称作真菌毒素真菌毒素（Mycotoxins）Mykes:Greekforfungus/mold希腊希腊语语“霉菌霉菌”Toxicum:Latinforpoison/toxin拉丁文拉丁文 “毒素毒素” 真
25、菌毒素（真菌毒素（MycotoxinMycotoxin），），有时也俗称霉菌毒素，是某些有时也俗称霉菌毒素，是某些真菌产生的代谢产物，目前已发现的真菌毒素有十多种，真菌产生的代谢产物，目前已发现的真菌毒素有十多种，它们包括黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏马霉素、脱氧雪腐它们包括黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏马霉素、脱氧雪腐镰刀菌烯酮（也称为呕吐毒素）、玉米赤霉烯酮、镰刀菌烯酮（也称为呕吐毒素）、玉米赤霉烯酮、T-2T-2毒毒素、麦角碱、杂色曲霉素、黄米毒素、岛青霉毒素、展青素、麦角碱、杂色曲霉素、黄米毒素、岛青霉毒素、展青霉毒素（棒曲霉毒素）、橘青霉素、皱褶青霉素、黄绿青霉毒素（棒曲霉毒素）、橘青霉素、
26、皱褶青霉素、黄绿青霉素、红矢精、黄绿素、圆弧青霉偶氮酸和霉素、红矢精、黄绿素、圆弧青霉偶氮酸和F-2F-2毒素等。毒素等。 能够产生真菌毒素的霉菌能够产生真菌毒素的霉菌1）曲霉属（Aspergillus Link）：黄曲霉（A. flavus）、寄生曲霉（A. parasiticus）、赭曲霉（A. ochraceus）、杂色曲霉（A. flavus）、烟曲霉（A. flumigatus）、构巢曲霉（A. nidulans）和棒曲霉（A. clavus）等。2）青霉属（Penicillium Link ex Fr）：岛青霉（P. islandicum）、橘青霉（P. citrinum）、红色青
27、霉（P. rubrum）、展青霉（P. patulum）和黄绿青霉（P. citreo-vinide）等。3）镰刀菌属（Fusarium Link ex Fr）：禾谷镰刀菌（F. graminearun）、串珠镰刀菌（F. moniliforme）、木贼镰刀菌（F. equiseti）、茄病镰刀菌（F. solani）、三线镰刀菌（F. tritinctum）和镳草镰刀菌（F. sporotrichioides）等。玉米上的曲霉属（Aspergillus)玉米上的镰刀菌属（ Fusarium)玉米上的赤霉素（ Gibberella)Aflatoxin 黄曲霉毒素黄曲霉毒素nProduced b
28、y Aspergillus flavus and A. parasiticus 由由黄曲黄曲霉和寄生曲霉产生霉和寄生曲霉产生nFive key aflatoxins (五种五种黄曲霉毒素黄曲霉毒素): B1, B2, G1, G2 and M1 nFound in corn, grains, cottonseed, peanuts, tree nuts, spices, milk 玉米、玉米、谷物、棉籽、花生、坚果、调味品、牛谷物、棉籽、花生、坚果、调味品、牛奶中均已发现奶中均已发现nLiver damage 对对肝有损害肝有损害nIARC- class 1 human carcinogen
29、国际国际肿瘤研究机构定为肿瘤研究机构定为一级致癌物一级致癌物黄曲霉毒素的化学性质黄曲霉毒素的化学性质 黄曲霉毒素的基本结构为二呋喃环和香豆素，在紫外线下，黄曲霉毒素B1、B2发兰色荧光，黄曲霉毒素G1、G2发绿色荧光。黄曲霉毒素M1是黄曲霉毒素B1在体内经过羟化而衍生成的代谢产物。黄曲霉毒素的分子量为312-346。难溶于水，易溶于油、甲醇、丙酮和氯仿等有机溶剂，但不溶于石油醚、己烷和乙醚中。一般在中性及酸性溶液中较稳定，但在强酸性溶液中稍有分解，在pH 9-10的强碱溶液中分解迅速。其纯品为无色结晶，耐高温，黄曲霉毒素B1的分解温度为268 oC，紫外线对低浓度黄曲霉毒素有一定的破坏性。黄曲
30、霉毒素在各国商品中的存在情况黄曲霉毒素在各国商品中的存在情况 (1)商 品 国 家 文献发表年份 被分析的样品数 出现率（%） 含量范围(g/kg)玉米印度19972074475-666玉米阿根廷19962271205-560花生印度19962062455-833花生粉印度1995380978-6280棉籽粉英国199721715-25干椰子粉菲律宾1995910023-186巴西果美国1993176170-619Pistachio果芬兰199629592-165黄曲霉毒素在各国商品中的存在情况黄曲霉毒素在各国商品中的存在情况 (2)商 品 国 家 文献发表年份 被分析的样品数 出现率（%）
31、含量范围（g/kg）杏仁美国19934410-372大豆阿根廷199194101-36大米厄瓜多尔19979997-40小麦乌拉圭1996123202-20干无花果奥地利1993136131-350肉豆蔻日本199367430-17Chillies果巴基斯坦1995176661-80Aspergillus flavus黄曲霉黄曲霉n五颗表面消毒的花生五颗表面消毒的花生置于营养培养基中，置于营养培养基中，其中两颗有长出黄曲其中两颗有长出黄曲霉（黄绿色霉菌）霉（黄绿色霉菌）黄曲霉毒素黄曲霉毒素的毒害作用的毒害作用黄曲霉毒素对天竺鼠肝脏的影响，从上排的最左边到下排的最右边，同一时间内摄入的黄曲霉毒素
32、量逐步增加。请注意：摄入的黄曲霉毒素量越大，天竺鼠肝脏越苍白。黄曲霉毒素的毒性黄曲霉毒素的毒性1.一级致癌物质。2.是氰化钾的10-20倍。3.是砒霜的68倍 。4.是农药1605、1059的28-33倍。5. 是3，4-苯并芘的4000倍。6.是二甲基亚硝胺的75倍。黄曲霉毒素引起的家禽和家畜中毒症（黄曲霉毒素引起的家禽和家畜中毒症（一）一）动物年龄黄曲霉毒素 (mg/kg.bw)喂饲时间毒性作用小牛断乳0.22-2.216周发育迟缓、死亡、肝损伤小公牛 2岁0.22-0.6620周肝损伤奶牛2岁2.47个月 肝损伤鸭0.2346周肝损伤、死亡黄曲霉毒素引起的家禽和家畜中毒症黄曲霉毒素引起的
33、家禽和家畜中毒症（二）（二）动物年龄黄曲霉毒素 (mg/kg.bw)喂饲时间毒性作用猪新生0.2344天发育迟缓猪2周0.1723周 厌食、黄疸、腹水、发育迟缓猪4-6周 0.41-0.693-6个月发育迟缓、肝损伤鸡1周0.8410周 发育迟缓、肝损伤鸡2天0.240天 长瘤Ochratoxin赭曲霉毒素赭曲霉毒素nProduced by Aspergillus ochraceus and Penicillium viridicatum 由由赭色曲霉菌赭色曲霉菌和和青霉菌青霉菌产生产生nFound in cereal grains, coffee, pig products, dried v
34、ine fruit, wine可在可在谷物、咖啡、猪肉产品、葡萄干和谷物、咖啡、猪肉产品、葡萄干和酒中发现酒中发现nNephrotoxin (kidney toxin)肾肾毒素毒素nLinked to Balkan endemic nephropathy与与巴尔干肾病巴尔干肾病有关有关nIARCpossible human carcinogen 国际国际肿瘤研究机构认定为肿瘤研究机构认定为2B2B类致癌物类致癌物赭曲霉毒素的化学性质赭曲霉毒素的化学性质包括7种结构类似的化合物。其中赭曲霉毒素A(R1=C1，R2=H)毒性最大，在霉变谷物、饲料等最常见。 赭曲霉毒素A是一种无色结晶化合物。可溶于
35、极性有机溶剂和稀碳酸氢钠溶液。微溶于水。其苯溶剂化物熔点9496，二甲苯中结晶熔点169。有很高的化学稳定性和热稳定性。赭曲霉毒素A是由多种生长在粮食（小麦、玉米、大麦、燕麦、黑麦、大米和黍类等）、花生、蔬菜（豆类）等农作物上的曲霉和青霉产生的。动物摄入了霉变的饲料后，这种毒素也可能出现在猪和母鸡等的肉中。赭曲霉毒素主要侵害动物肝脏与肾脏。这种毒素主要是引起肾脏损伤，大量的毒素也可能引起动物的肠黏膜炎症和坏死。还在动物试验中观察到它的致畸作用。 赭曲毒素赭曲毒素A A在各种商品中的存在情况（在各种商品中的存在情况（1 1）商 品 国 家 文献发表年份 被分析的样品数 出现率（%） 含量范围(g
36、/kg)大麦德国1998679725-27000小麦丹麦1997508050-4550黑麦丹麦19972662910-2124燕麦丹麦19971212042-350小麦瑞士19971533473-2395大麦/小麦英国19972405650-34868绿咖啡日本19973574100-1740赭曲毒素赭曲毒素A A在各种商品中的存在情况（在各种商品中的存在情况（2 2）商 品 国 家 文献发表年份 被分析的样品数 出现率（%） 含量范围(g/kg)绿咖啡 英国1997225050-5787可可粉 英国199650100225-37000干果英国19964898600-37650酒德国19966
37、489550-6320调味品/本草植物德国1996317276-7132二二.食品质量安全问题中检测技食品质量安全问题中检测技术术n分子生物学检测技术 基因检测基因检测 免疫学检测免疫学检测n化学检测技术n基因检测技术：1. PCR法2. 分子杂交法3. 基因芯片法PCR的概念 PCR技术的创建PCR的原理PCR的反应体系和方法PCR的类型和应用 多聚酶链式反应多聚酶链式反应（PCR：Polymerase Chain Reaction)Polymerase: DNAPolymerase: DNA聚合酶聚合酶 PCRPCR技术的创建技术的创建KaryKary B. Mullis B. Mulli
38、s（穆利斯（美）（穆利斯（美）Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术1989年美国Science杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。生物样品生物样品生物样品生物样品DNADNA片段片段基基基基因因因因诊诊诊诊断断断断基基基基因因因因治治治治疗疗疗疗基基基基因因因因工工工工程程程程产产产产品品品品法法法法医医医医学
39、学学学检检检检测测测测人人人人类类类类学学学学研研研研究究究究PCR技术诞生所依赖的社会需求和研究需要引物引物引物引物Mullis的构思DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶特定特定特定特定DNADNA片段片段片段片段1983年94949494变性变性变性变性50-6550-65退火退火退火退火XX延伸延伸延伸延伸Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)酶酶酶酶活活活活性性性性( (%) )温度温度温度温度()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 207272949494945555PCRPCR循环循环循环循环PCR技术的原理1 PCR
40、技术的基本原理 无细胞分子克隆法：在微量离心管中,加入适量的缓冲液, 微量的模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶, 一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍; 扩增了特异区段的DNA带。 加热加热变变 性性复复性性复温DNA的变性和复性加热或强酸、碱性作用可以使 DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为 DNA的变性。解除变性的条件后, 变性的单链可以重新结合起来,形成双链,其原有的特性和活性可以恢复,这称DNA复性, 也叫退火。 PCR扩增原理引
41、物引物引物引物延伸延伸延伸延伸延伸延伸延伸延伸5 55 53 33 3变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火2 PCR技术的特点1 ）高度的灵敏性30轮循环扩增量达230个拷贝PCR产物每轮循环增加一倍2 ）特异性引物引物 引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。 引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。引物设计：（1)序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列。（2）引物长度以18-30 bp为宜。（3）碱基尽可能随机分布,G+C占50-60%。（4）引物内部避免形成二级结构。（5）两引物间
42、避免有互补序列。（6）引物3端为关键碱基；5端无严格限制。3）操作简便易行 PCR扩增法,只需要数小时,就可以用电泳法检出1g基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列。 通常的DNA 扩增法是分子克隆法, 首先要构建含有目的的基因的载体, 然后将它导入细胞后进行扩增,还要用同位索探针进行筛选;这种方法,要经过DNA内切、连接、转化和培养等相关的过程,操作复杂,一般需要数周时间。4 ）用途广泛生命学科医学工程遗传工程疾病诊断法医学考古学PCR的反应体系和方法 PCR管加热使模板变性, 退火使引物与模板DNA互补,延伸需将反应温度升至中温( 72),在Tap多聚酶的作用下,以dNTP为原料,以引物为复
43、制的起点,合成新链。 如此重复改变反应温度,即高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍; 将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。 总体积 50-100 l Buffer 缓冲液 dNTP 原料 Primer 引物 DNA分子 模板 Taq酶 DNA聚合酶 1 反应体系PCR技术的基本过程(1)模板模板模板模板DNA DNA dNTPdNTP 引物引物引物引物BufferBuffer预变性预变性模板模板模板模板DNA DNA dNTPdNTP 引物引物
44、引物引物BufferBufferTaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶9494oC52 基本过程PCR技术的基本过程(2)Taq Taq 酶酶酶酶模板模板模板模板DNA DNA dNTPdNTP 引物引物引物引物BufferBuffer循循环环仪仪949455 55 72 72 Taq Taq 酶酶酶酶模板模板模板模板DNA DNA dNTPdNTP 引物引物引物引物BufferBuffer72 572 57 min7 min琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳PCR技术的基本过程(3)1）PCR反应成分（1）模板 单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合
45、蛋白类。 一般100ng DNA模板/100L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。3 PCR反应条件（2）引物浓度 0.1-0.5 mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。（3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 0.5-2.5 U/50 l 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。（4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。（5） Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。0.5
46、mmol/L-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。2）循环参数(1)变性 (2) 使双链DNA解链为单链 94oC 20-30秒(2) 退火 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。（3）延伸 70-75,一般为72 延伸时间由扩增片段长度决定（4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加经典循环参数（500bp
47、以内）94 30s 94 30s 55 45s55 45s72 1min72 1min94 5min94 5min30次72 7min72 7min42 forever42 forever1）不对称PCR 目的：扩增产生特异长度的单链DNA。 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.010.5M,关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针 基因组DNA结构功能的研究 PCR的类型 高浓度引物低浓度引物2)反向PCR (reverse PCR) 是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列
48、进行扩增。 可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。已知序列已知序列未知序列未知序列未知序列未知序列已知序列已知序列未知序列未知序列未知序列未知序列限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶连接酶连接酶3）多重PCR（复合（复合PCRPCR）用于检测特定基因序列的存在或缺失。电电电电泳泳泳泳引物引物123412344）LP-PCR（LabelledLabelled primers) primers) 利用同位素、荧光素等对引物进行标记,用以直观地检测目的基因。 特别适合大量临床标本的基
49、因诊断 可同时检测多种基因成分病毒病毒1 1 病毒病毒2 2 病毒病毒 3 3 病毒病毒4 4标记引物标记引物标记引物标记引物观察观察PCRPCR产物产物5）逆转录酶聚合酶mRNAcDNA杂化双链杂化双链PCR扩增基因mRNAmRNA蛋白质多肽链蛋白质多肽链6) 6) 荧光定量荧光定量荧光定量荧光定量 PCRPCR（real-time PCR)real-time PCR) 通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针, ,对对PCRPCR产产物进行标物进行标 记跟踪记跟踪, ,实时在线监控反应过程实时在线监控反应过程, ,结合相应结合相应的软件可以对结果进行分析的软
50、件可以对结果进行分析, ,计算待测样品的初始模板计算待测样品的初始模板量。量。荧光定量荧光定量荧光定量荧光定量 PCRPCR仪仪仪仪 光定量光定量PCRPCR仪是一种带有激发光源和荧光信号检测仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系统的系统的PCRPCR仪仪, ,通常配有电脑系统及相应的分析软件。通常配有电脑系统及相应的分析软件。荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时PCRPCR与普通与普通与普通与普通PCRPCR的比较的比较的比较的比较 实时在线监控实时在线监控实时在线监控实时在线监控对样品扩增的整个过程进行实时监控对样品扩增的整个过程进行实时监控, ,能够实时地观察到产物的增能够实时
51、地观察到产物的增加加, ,直观地看到反应的对数期直观地看到反应的对数期 降低反应的非特异性降低反应的非特异性降低反应的非特异性降低反应的非特异性使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合, ,提高了提高了PCRPCR反应反应的特异的特异性性 增加定量的精确性增加定量的精确性增加定量的精确性增加定量的精确性全程监控全程监控, ,准确的算法进行定量准确的算法进行定量 结果分析更加快捷方便结果分析更加快捷方便结果分析更加快捷方便结果分析更加快捷方便, ,无需跑胶无需跑胶无需跑胶无需跑胶全新全新4通道实时荧光定量通道实时荧光定量PCR仪仪 普通梯度普通梯度PCR仪仪P
52、CRPCR技术的应用技术的应用1) 1) 基因克隆基因克隆重组重组DNADNA质粒质粒DNADNA基因片段基因片段大肠杆菌大肠杆菌胰岛素胰岛素重组体+胰岛素胰岛素基因基因基因基因基因工程产品基因工程产品55Bam H IBam H IBam H IBam H IBam H IBam H IBam H IBam H IG GT TC CC CG GG GA AC CC CC CT TG GC CA AG GG GG GT TC CC CG GG GA AC CC CC CT TG GC CA AG GG GCCTGCCTGGGACGGACGTCCGTCCCAGGCAGG质粒质粒DNADNA目的基
53、因目的基因限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶2)基因检测A内源内源性病变基因性病变基因正常人A病 人A正常人正常人正常人正常人病病病病 人人人人正正正正常常常常病病病病人人人人3）基因鉴定女女性性男男性性Y Y引物引物PCR男性男性 女性女性PCR技术在食品安全检测中的应用技术在食品安全检测中的应用方法步骤：方法步骤：1、运用化学手段对、运用化学手段对DNA提取；提取；2、设计并合成引物；、设计并合成引物；3、进行、进行PCR扩增；扩增；4、克隆并筛选鉴定、克隆并筛选鉴定PCR产物；产物；5、DNA序列分析。序列分析。转基因食品的基因食品的检测大豆中大豆中转基因成份定性基因成份定性PCR检测方法
54、方法玉米中玉米中转基因成份定性基因成份定性PCR检测方法方法油菜籽中油菜籽中转基因成份定性基因成份定性PCR检测方法方法烟草中烟草中转基因成份定性基因成份定性PCR检测方法方法植物性植物性饲料中料中转基因成份定性基因成份定性PCR检测方法方法马铃薯中薯中转基因成份定性基因成份定性PCR检测方法方法棉花中棉花中转基因成份定性基因成份定性PCR检测方法方法原理：标记基因的PCR检测1.报告基因GUS 基因荧光素酶(LUC)基因胭脂碱合成酶(NOS)基因GFP基因2. 抗性基因PCR技术在微生物学中的应用技术在微生物学中的应用一一. 微生物检测微生物检测1.常规常规PCR检测检测 在1992年Rah
55、n 等利用沙门氏菌的invA基因设计了一对引物,第一次用PCR的方法对沙门氏菌进行了检测试验。共检测了630株沙门氏菌,约100多种血清型和21个菌属的142株非沙门氏菌。结果显示,有两株没有检测出,检出率为99.14%。2.多重多重PCR Cortez等（2006）用多重PCR检测了家鸡屠宰场不同来源样品中的鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和其他血清型的沙门氏菌。其使用了3对引物,分别来自沙门氏菌的invA, pefA和sefA 基因。在检测的288 份样品中,鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌的检出率为62%,其他血清型的沙门氏菌为10%。3.巢式巢式PCR 巢式PCR ( nesting PCR)
56、是指先后用两套引物进行扩增的PCR 技术,用内外两对引物先后扩增靶基因片段。通常是先用第一套引物扩增15 - 30个循环,再用已扩增的DNA片段内设定的第二套引物扩增15 - 30个循环。由于第二套引物设计片段位于第一套引物扩增的片段内,所以将第一套引物称为外引物,而把第二套引物叫做内引物。巢式PCR既可增加反应的物异性,又可得到丰产的特异性靶序列,增加敏感性。巢式PCR技术对微生物的检测和单拷贝基因靶DNA的扩增都是非常有效。 Hashimoto等（1995）基于编码Vi抗体的基因序列改进了巢式PCR,所有的伤寒菌(包括丙型副伤寒)都能检出, 灵敏度可以达到单个细胞水平。Prakash（20
57、05）的研究设计了肠沙门氏菌Typhi血清型菌株的H12d特异引物对进行巢式PCR,结果显示,该巢式PCR能够代替Widal测试方法诊断伤寒症。4.荧光定量荧光定量PCR Nam等 10 建立和评价了SYBR Green 1 实时PCR特异检测沙门氏菌的方法。用大小为119 bp的invA 基因作为检测靶点,对124 株沙门氏菌和116株非沙门氏菌进行了检测。检测结果显示,所有的沙门氏菌有invA基因阳性条带,而非沙门氏菌均没有扩增条带。5. 热起动热起动PCR 热起动PCR (Hot start PCR)指的是使Taq DNA聚合酶只在样品温度超过至少70时才发挥作用的PCR。它是为提高反应
58、的特异性设计的。如所周知道, Taq DNA聚合酶通常在比适宜温度低得多的条件下仍有较强的活性,会导致非靶序列的扩增,影响PCR反应的特异性。热起动可减少非靶序列的扩增,从而提高反应的特异性。 Yang等（2006）设计了12对引物进行多重PCR,并使用了热启动酶,检测腊样芽孢杆菌毒素基因。该体系成功的检测出了与食物中毒及与食品相关的162株菌中潜在的毒素。二二.微生物分类鉴定微生物分类鉴定 在酿造工业中，对于保持发酵持久度的一致性和全体产品质量的一致性来说，从非酿酒酵母菌株中纯化酿酒酵母菌株是必要的。传统的基于形态、生理生化的检测和分类鉴定方法常常比较耗时且结论也不确定和完全，特别是难于从表
59、现型上区分Saccharomyces 属的S.cerevisiae，S.bayanus 和S.diastaticus，因为这些酿酒酵母它们属于同一个属。Yamagishi等应用标定FLO1 的开放阅读框架的PCR 法来区分酿酒酵母和非酿酒酵母，PCR 分子水平的显示结果表明了二者的不同展望展望 PCR 技术和以PCR 技术为基础的分子生物学技术给现代生物学的研究带来了革命性的变化，微生物学自然也不例外，它们给微生物学的研究开辟了一个新的天地，微生物由于个体微小和本身研究的特殊性，相对与其他学科来说更需要PCR 技术和以PCR 技术为基础的分子生物学技术。相信随着科学技术的进一步发展及其在微生物
60、学应用领域的扩大，它们必将发挥出更大的作用。核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术nSOUTHERNnNORTHERN 第第 一一 节节 核酸分子杂交的基本原理核酸分子杂交的基本原理原理：碱基互补配对原则原理：碱基互补配对原则 一、核酸分子杂交一、核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 来源不同的两条单链核酸分子通过碱基互补来源不同的两条单链核酸分子通过碱基互补形成异源双螺旋分子，称为形成异源双螺旋分子，称为核酸分子杂交核酸分子杂交。 杂交可分成：杂交可分成：DNA/DNA、RNA/RNA、DNA/RNA之间的杂交。之间的杂交。复性复性RNADNAn待测核酸序列待测
61、核酸序列n探针探针(probe)：已知核酸序列已知核酸序列二、二、DNA的变性的变性(denaturation)n定义定义：在某些理化因素作用下，在某些理化因素作用下，DNADNA双链解开双链解开 成两条单链的过程。成两条单链的过程。n方法：方法：过量酸、碱、加热、变性试剂如尿素、过量酸、碱、加热、变性试剂如尿素、 甲酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。甲酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。 变性后其它理化性质变化：变性后其它理化性质变化： OD260OD260增高增高粘度下降粘度下降 比旋度下降比旋度下降浮力密度升高浮力密度升高 酸碱滴定曲线改变酸碱滴定曲线改变生物活性丧失生物活性丧失DNA
62、DNA变性的本质是双链间氢键的断裂变性的本质是双链间氢键的断裂Tm：变性是在一个相当窄的温度范围内完成，在这一范围内，变性是在一个相当窄的温度范围内完成，在这一范围内，双链双链DNADNA变性一半所需要的温度称为变性一半所需要的温度称为DNADNA的解链温度，又称熔解温的解链温度，又称熔解温度度(melting temperature, Tm)。其大小与其大小与G+C含量成正比。含量成正比。计算公式nTm=（G+C）%0.41+69.3三、三、DNADNA的复性的复性nDNADNA复性复性( (renaturationrenaturation) )的定义的定义 在适当条件下，变性在适当条件下，
63、变性DNADNA的两条互补链可的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性复性。 热变性的热变性的DNADNA经缓慢冷却后即可复性，经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为这一过程称为退火退火(annealing) (annealing) 。n减色效应减色效应 DNADNA复性时，其溶液复性时，其溶液OD260OD260降低。降低。DNA-DNA杂交双链分子杂交双链分子变性变性 复性复性 不同来源的不同来源的DNA分子分子 第第 二二 节节 核酸分子杂交的基本方法核酸分子杂交的基本方法核酸分子杂交的类别核酸分子杂交的类别 （一）（一）DNADNA印迹技术印迹
64、技术 (Southern blotting)(Southern blotting) 用于用于基因组基因组DNADNA的定性定量分析、酶切图谱分的定性定量分析、酶切图谱分析、基因突变分析及限制性片段长度多态性分析析、基因突变分析及限制性片段长度多态性分析（RFLPRFLP）等。）等。（二）（二）RNARNA印迹技术印迹技术 (Northern blotting)(Northern blotting) 用于用于RNARNA的定性定量分析。的定性定量分析。 蛋白质的印迹分析蛋白质的印迹分析 (Western blotting) 用于蛋白质定性定量及相互作用研究。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。n其
65、他其他n斑点印迹斑点印迹 (dot blotting) (dot blotting) n原位杂交原位杂交 (in situ hybridization)(in situ hybridization)（一）（一）Southern 印迹杂交印迹杂交 nDNA 印迹nE. Southern1975 年Southern blot步骤步骤（1）待测核酸样品的制备待测核酸样品的制备：提取基因组DNA，并用适当的限制性内切酶消化水解基因组DNA，成大小不一的DNA片段。（2）待测待测DNA样品的电泳分离。样品的电泳分离。（3）凝胶中核酸的变性凝胶中核酸的变性：DNA在制备与电泳过程中DNA片段始终保持双链结
66、构。电泳结束后DNA变性并转移到适当的固定支持物上才能进行Southern blot。变性通常用碱变性法。（4） Southern 转膜转膜：将凝胶中的DNA进行碱变性并将PH恢复中性后，即可将凝胶中DNA转移到固定支持物上。固定支持物固定支持物：硝酸纤维素（NC）膜、尼龙膜、化学活化膜和滤纸等。转移方法转移方法：毛吸管虹吸印迹法、电转印迹法、真空转移法。（5）已知序列的）已知序列的DNA探针的制备探针的制备（6） Southern杂交杂交：在将固定于膜上的DNA片段与探针进行杂交前，必须先进行一个预杂交预杂交的过程。因为能够结合DNA的膜同样可以和探针DNA结合，在进行杂交实验前，必须将膜上
67、所有能与DNA结合的位点全部封闭。（7）杂交结果的检测杂交结果的检测：采用核素标记的探针或发光剂标记的探针进行杂交时，在杂交洗膜后，将滤膜和X线片装入暗盒，感光后，经冲洗，在X线片上可见黑色条带。方法方法1. 酶解酶解DNAn限制性内切酶（限制性内切酶（Restriction Enzyme, RE）n限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）2. 分离分离n电泳电泳 在电场中带电粒子向带符号相在电场中带电粒子向带符号相反的电极移动的现象称为反的电极移动的现象称为电泳电泳（electrophoresis）
68、。 3. 凝胶中核酸的变性凝胶中核酸的变性n碱变性碱变性n中和处理中和处理4. 转膜转膜n硝酸纤维素膜n尼龙膜转膜方法转膜方法n毛细管虹吸印迹法毛细管虹吸印迹法n电转印法电转印法n真空转移法真空转移法毛细管虹吸印迹法毛细管虹吸印迹法电转印法真空转移法5. 杂交杂交n预杂交：预杂交：封闭非特异性封闭非特异性DNA位点。位点。n杂交杂交6. 杂交结果的检测杂交结果的检测放放射射自自显显影影照照片片（二）二）Northern blot和和Southern blot不同在于：不同在于：A：靶核酸是靶核酸是RNA；B：RNA电泳时，凝胶中加入变性剂，防止电泳时，凝胶中加入变性剂，防止RNA分子形成二级结
69、构；分子形成二级结构；C：电泳结束后直接转膜。电泳结束后直接转膜。一、原理一、原理三三种种印印迹迹技技术术的的比比较较第三第三 节探节探 针针n探针探针 (probe) 一小段用同位素、生物素或荧光染料一小段用同位素、生物素或荧光染料等标记其末端或全链的已知序列的多等标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在聚核苷酸，与固定在NCNC膜上的核苷酸膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存结合，判断是否有同源的核酸分子存在。在。一、核酸探针的来源一、核酸探针的来源n 基因组基因组DNA探针探针n cDNA探针探针n RNA探针探针n 寡核苷酸探针寡核苷酸探针二、核酸探针的标记物二、核酸探
70、针的标记物 高度灵敏性；高度灵敏性；n标记物与核酸探针结合，应绝对不能影响核酸探针与模标记物与核酸探针结合，应绝对不能影响核酸探针与模板的结合能力及结合的特异性；板的结合能力及结合的特异性；n当用酶促方法进行标记时，应对酶促活性（当用酶促方法进行标记时，应对酶促活性（KmKm值）无多值）无多大影响，以保证标记反应的效率和标记产物的比活性；大影响，以保证标记反应的效率和标记产物的比活性；n高度特异性；高度特异性；n较高的化学稳定性，保存时间长，标记及检测方法简单；较高的化学稳定性，保存时间长，标记及检测方法简单；n对环境无污染，对人体无损伤；对环境无污染，对人体无损伤；n价格低廉等。价格低廉等。
71、常用的探针标记物：常用的探针标记物：n放射性同位素：放射性同位素： 3H、32P、35S、125I等。等。n非放射性同位素：非放射性同位素： 荧光、地高辛素、辣根过氧化酶、碱性荧光、地高辛素、辣根过氧化酶、碱性磷酸酶等。磷酸酶等。放射性核素标记物放射性核素标记物（灵敏度极高灵敏度极高）3232P P：释放：释放-粒子粒子, ,能量高能量高, ,穿透力极强。穿透力极强。3535S S：3535S S的放射性亦较强，但的放射性亦较强，但-粒子能粒子能量较低，因此其检测灵敏度较量较低，因此其检测灵敏度较3232P P稍低。稍低。3 3H H：适用于细胞原位杂交。：适用于细胞原位杂交。125125I
72、I和和131131I I：碘放射性同位素在：碘放射性同位素在7070年代曾年代曾被广泛应用于核酸探针的标记。被广泛应用于核酸探针的标记。非放射性标记物非放射性标记物无放射性污染，稳定性好无放射性污染，稳定性好n半抗原：生物素、地高辛半抗原：生物素、地高辛n配体：生物素配体：生物素n荧光素：荧光素：n化学发光物质，可以像放射性核素一样直接化学发光物质，可以像放射性核素一样直接对对X光胶片进行曝光。光胶片进行曝光。n光密度或电子密度标记物：如金、银等，适光密度或电子密度标记物：如金、银等，适用于细胞原位杂交，可以在光镜或电镜下进行用于细胞原位杂交，可以在光镜或电镜下进行观察。观察。核酸分子杂交信号
73、的检测核酸分子杂交信号的检测n放射性同位素标记探针放射性同位素标记探针放射自显影放射自显影n非放射性同位素标记探针非放射性同位素标记探针偶联反应偶联反应+显色反应显色反应分子杂交的应用分子杂交的应用:1. 1. 转基因检测转基因检测2. 2. 微生物检测微生物检测分子杂交的限制性分子杂交的限制性基因芯片分析的理论与方法基因芯片分析的理论与方法基因芯片概论基因芯片分析的概念基因芯片分析的概念基因芯片(Genechip)技术是指通过微阵列(Microarray)技术将高密度DNA片段阵列通过高速机器人或原位合成方式以一定的顺序或排列方式使其附着在如玻璃片等固相表面，以荧光标记的DNA探针，借助碱基
74、互补杂交原理，进行大量的基因表达及监测等方面研究的技术。基因芯片发展历史基因芯片发展历史Southern & Northern Southern & Northern BlotBlotDot Dot BlotBlotMacroarrayMacroarrayMicroarrayMicroarray早在八十年代，BainsW.等人就将短的DNA片段固定到支持物上，借助杂交方式进行序列测定。但基因芯片从实验室走向工业化却是直接得益于探针固相原位合成技术和照相平板印刷技术的有机结合以及激光共聚焦显微技术的引入。它使得合成、固定高密度的数以万计的探针分子切实可行，而且借助激光共聚焦显微扫描技术使得可以对
75、杂交信号进行实时、灵敏、准确的检测和分析。基因芯片分析的优点快速高通量(104-106)自动化使用的试剂少低成本基因芯片分析的应用范围基因芯片分析的应用范围AcademicresearchofgeneticdiseasesCancerGeneralgeneticdiseasesInfectiousdiseasesDrugdiscoveryAnimalfarming/veterinaryIndustrial(fermentation)Environmental基因芯片的分类 根据用途分类根据用途分类gene expression patternBiologicalSampleFunctional
76、 Information一些发展中的基因芯片技术平台一些发展中的基因芯片技术平台利用生物分子的电物理特性进行基因表达监测：监测速度很快，适用于基因表大，蛋白质组及基因型的研究利用电场原理进行高密度芯片生产：基于适合用于生物学的集成电路，集成电路包含可以独立寻址的微电极阵列，结合特殊的液体流动系统，可以使大部分生物分子按照来自于计算机的数字指令运动。喷墨点样技术：以高度定位的形式把合成好的寡核苷酸分子喷点倒玻璃表面。寡核苷酸包被的微珠芯片平行信号测序技术：对基因表达进行定量分析基因芯片分析试验方法 操作流程操作流程（1）探针的设计、合成与芯片的制作（商品化产品）；）探针的设计、合成与芯片的制作（
77、商品化产品）；（2）靶基因样品的制备；）靶基因样品的制备； 靶基因的制备：靶基因的制备：RT-PCR （设实验组和对照组）设实验组和对照组） 标记方法：分别进行荧光素标记如：标记方法：分别进行荧光素标记如：Cy3和和Cy5（3）生化杂交反应；与常规的分子杂交过程基本相似生化杂交反应；与常规的分子杂交过程基本相似 封闭封闭 预杂交预杂交 杂交杂交 洗脱洗脱（4）杂交信号的检测与结果的分析）杂交信号的检测与结果的分析 激光共聚焦荧光检测系统收集荧光信号，计算机分析激光共聚焦荧光检测系统收集荧光信号，计算机分析基因芯片分析的主要步骤cDNA基因芯片分析的主要步骤cDNA芯片分析的主要步骤Spotby
78、ArrayspotterOligonucleotidearray （GeneChip ）L LL LL LL LL LL LL LL LcDNAcDNAAAAAAAAA总总RNA的制备的制备反转录反转录体外体外转录转录生物素标记的生物素标记的cRNA片段化处理片段化处理带带标记的标记的cRNA片断片断35-200 bases0.5-2 ug/ul起始用量起始用量5-10ug（IVT）操作流程操作流程（以真核生物为例）（以真核生物为例）L LL LL LL LL L标记的标记的cRNA片断片断杂交混合液的制备杂交混合液的制备EukaryoticHyb.ControlControlOligo B2
79、 杂交杂交（16hour） 数据分析数据分析 扫扫 描描 洗脱洗脱染色染色Oligonucleotidearray的特点1 个平方厘米的面积至少可排列个平方厘米的面积至少可排列四十多万个探针合成区四十多万个探针合成区(“点点”）基因基因2 2基因基因1cDNA1cDNA基因基因2cDNA2cDNA用于用于cDNA芯片的探针芯片的探针Oligo probe基因基因1 1多个检测结果可以参考多个检测结果可以参考聚类结果显示聚类结果显示: Cluster, Cluster viewer基因芯片的应用基因芯片的应用1.1998年底美国科学促进会将基因芯片技术列为1998年度自然科学领域十大进展之一，足
80、见其在科学史上的意义。2.现在，基因芯片这一时代的宠儿已被应用到生物科学众多的领域之中。它以其可同时、快速、准确地分析数以千计基因组信息的本领而显示出了巨大的威力。这些应用主要包括基因表达检测、突变检测、基因组多态性分析和基因文库作图以及杂交测序等方面。3.在基因表达检测的研究上人们已比较成功地对多种生物包括拟南芥（Arabidopsisthaliana）、酵母(Saccharomycescerevisiae)及人的基因组表达情况进行了研究，并且用该技术（共157,112个探针分子）一次性检测了酵母几种不同株间数千个基因表达谱的差异。4.实践证明基因芯片技术也可用于核酸突变的检测及基因组多态性的分析，例如对人BRCA基因外显子、CFTR基因22、-地中海贫血、酵母突变菌株间、HIV-1逆转录酶及蛋白酶基因（与Sanger测序结果一致性达到98%）等的突变检测，对人类基因组单核苷酸多态性的鉴定、作图和分型，人线粒体16.6kb基因组多态性的研究等。DNA测序：杂交测序基因表达分析：基因组研究：作图、测序、基因鉴定、基因功能分析基因诊断：寻找和检测与疾病相关的基因及在RNA水平上检测致病基因的表达药物研究与开发：存在的问题存在的问题1.技术成本昂贵2.样品制备3.探针的合成4.探针分子的标记5.分子与探针的杂交过程6.信号的获取与分析
