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1、生物制药生物制药09303第七组第七组指导老师：陈芬指导老师：陈芬（一）（一） 操操 作作 方方 法法6.思考问题思考问题5.注意事项注意事项4.工艺过程工艺过程3.仪器试剂仪器试剂2.基本原理基本原理1.背景知识背景知识RNA的制备及的制备及纯度的鉴定纯度的鉴定背景知识背景知识核糖核酸，简称核糖核酸，简称RNA，主要以单链的形式存在于生物体内，主要以单链的形式存在于生物体内,其高级结构很复杂其高级结构很复杂,它们既担负着储藏及转移遗传信息它们既担负着储藏及转移遗传信息的功能的功能,又能作为核酶在细胞内发挥代谢功能。生物体内又能作为核酶在细胞内发挥代谢功能。生物体内共有三种共有三种RNA，即编
2、码特定蛋白质序列的信使，即编码特定蛋白质序列的信使RNA；能；能特异性解读特异性解读mRNA中的遗传信息、将其转化成相应氨基中的遗传信息、将其转化成相应氨基酸后加入多肽链中的转运酸后加入多肽链中的转运RNA；直接参与核糖体中蛋白；直接参与核糖体中蛋白质合成的核糖体质合成的核糖体RNA。mRNA的选择性拼接 合成类RNA RNA的生物合成 RNA/DNA诊断仪实验目的1掌握从动物组织中提取掌握从动物组织中提取RNA的基本原理和操作的基本原理和操作2掌握掌握RNA纯度鉴定的原理和基本操作纯度鉴定的原理和基本操作3进一步熟悉可见分光光度计的使用进一步熟悉可见分光光度计的使用实验原理细胞内大部分细胞内
3、大部分RNA均与蛋白质结合在一起，以均与蛋白质结合在一起，以核蛋白核蛋白的的形式存在。因此分离形式存在。因此分离RNA时必须使时必须使RNA与蛋白质解离，与蛋白质解离，并除去蛋白质。并除去蛋白质。最常用含水的酚溶液除去蛋白质，去污剂和酚均能抑制最常用含水的酚溶液除去蛋白质，去污剂和酚均能抑制RNA酶活力，有利于制备核酸大分子，以酚水两相系统分酶活力，有利于制备核酸大分子，以酚水两相系统分离离RNA是将细胞或细胞器置于含有是将细胞或细胞器置于含有SDS的缓冲的缓冲盐溶液盐溶液中，中，加等体积水饱和的酚，通过剧烈振荡，然后离心形成上层加等体积水饱和的酚，通过剧烈振荡，然后离心形成上层水相和下层酚相
4、。水相和下层酚相。实验所用的实验所用的0.15mol/L缓冲缓冲盐溶液盐溶液系统可使大部分核糖核系统可使大部分核糖核蛋白解离，在用酚处理时脱氧核糖核蛋白变性；在低温条蛋白解离，在用酚处理时脱氧核糖核蛋白变性；在低温条件下，从水相中除去，这样得到的件下，从水相中除去，这样得到的RNA制品中混杂的制品中混杂的DNA量极低量极低 RNA制品继续用氯仿异戊醇处理，可以进一步除去其制品继续用氯仿异戊醇处理，可以进一步除去其中含有的少量蛋白质。最后用乙醇使中含有的少量蛋白质。最后用乙醇使RNA自水溶液中沉淀自水溶液中沉淀下来。下来。实验所得制品的核酸含量可用地衣酚显色法测定实验所得制品的核酸含量可用地衣酚
5、显色法测定RNA含量含量。RNA与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而转变为糠醛，后者与转变为糠醛，后者与3，5-二羟基甲苯（地衣酚）反应呈二羟基甲苯（地衣酚）反应呈鲜绿色，该反应需用三氯化铁或氯化铜作催化剂，反应产鲜绿色，该反应需用三氯化铁或氯化铜作催化剂，反应产物在物在670nm处有最大吸收。处有最大吸收。RNA在在20250g范围内，光范围内，光吸收与吸收与RNA的浓度成正比。的浓度成正比。实验器材与试剂器材：乳钵器材：乳钵、磨口、磨口 具塞锥形瓶具塞锥形瓶(500ml)天平天平、离心离心 机（机（4000rpm）动物肝脏）动物肝脏、紫外可、
6、紫外可见分光度计、恒温水浴锅见分光度计、恒温水浴锅试剂：试剂：1.SDS-缓冲盐溶液缓冲盐溶液0.3%SDS-0.1mol/L氯化钠氯化钠-0.05mol/L，pH5.0乙酸盐缓冲液称取乙酸盐缓冲液称取1.5gSDS，2.92g氯化钠，氯化钠，2.05g乙酸钠乙酸钠溶于水中，用乙酸调至溶于水中，用乙酸调至pH5.0，最后定容至，最后定容至500ml。2.含水酚液：使用前将苯酚重蒸含水酚液：使用前将苯酚重蒸(酚的沸点为酚的沸点为181.8)并用并用SDS缓缓冲盐溶液使其饱和。冲盐溶液使其饱和。3.氯仿氯仿-异戊醇液：氯仿：异戊醇异戊醇液：氯仿：异戊醇=24:1(V/V)。4.含含2%乙酸钾的乙酸
7、钾的95%乙醇溶液。乙醇溶液。5.75%乙醇，乙醇，95%乙醇、无水乙醇。乙醇、无水乙醇。6.乙醚乙醚7.RNA标准溶液（须经定磷确定其纯度）：取酵母标准溶液（须经定磷确定其纯度）：取酵母RNA配成配成200g/mL的溶液。的溶液。8.地衣酚试剂：先配制地衣酚试剂：先配制0.1%三氯化铁的浓盐酸（分析纯）溶液，实三氯化铁的浓盐酸（分析纯）溶液，实验前用此溶液作为溶剂配成验前用此溶液作为溶剂配成0.1%地衣酚溶液。地衣酚溶液。实验步骤一一.实验前的准备实验前的准备mRNA的分子结构容易受到的分子结构容易受到RNA酶的攻击反应而酶的攻击反应而降解降解,加上加上RNA酶极为稳定而且广泛存在酶极为稳定
8、而且广泛存在,因此在因此在提取过程中应严格防止提取过程中应严格防止RNA酶的污染并设法抑制酶的污染并设法抑制其活性。其活性。所用的玻璃器皿需要置于干燥烘箱中所用的玻璃器皿需要置于干燥烘箱中200.0C烘烘烤两小烤两小时以上以上,凡是不能用高温烘烤的材料如塑料凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等可用容器等可用0.1%的焦碳酸二乙的焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶）水溶液液处理，再用蒸理，再用蒸馏水冲水冲净。RNA提取流程2克动物肝脏组织克动物肝脏组织加加20mlSDS缓冲盐溶液缓冲盐溶液倒入磨口具塞锥形瓶倒入磨口具塞锥形瓶室温剧烈震荡室温剧烈震荡10分钟分钟研碎研碎加同体积含水酚溶液加同体积含水酚溶
9、液水浴分层并离心水浴分层并离心得上清液得上清液加氯仿异戊醇震荡加氯仿异戊醇震荡离心取上清液离心取上清液放置沉淀离心放置沉淀离心洗涤沉淀离心干燥洗涤沉淀离心干燥将将RNA溶于蒸馏水溶于蒸馏水离心得粗品离心得粗品加加2%乙酸钾乙醇溶液乙酸钾乙醇溶液二二.实验过程实验过程1.取取2g动物肝脏组织，剪成小块，在乳钵种研碎，加动物肝脏组织，剪成小块，在乳钵种研碎，加20mLSDS-缓冲盐溶液（见试剂缓冲盐溶液（见试剂1.）使成均浆，倒入磨口）使成均浆，倒入磨口具塞锥形瓶内，再加同样体积的含水酚溶液，室温下剧烈具塞锥形瓶内，再加同样体积的含水酚溶液，室温下剧烈振荡振荡10分钟。分钟。2.置冰浴中分层，在置
10、冰浴中分层，在0-4下，以下，以4000rpmn离心离心15分钟。分钟。吸出上清液，加等体积氯仿异戊醇，室温下剧烈振荡吸出上清液，加等体积氯仿异戊醇，室温下剧烈振荡10分钟，以分钟，以4000rpm离心离心5分钟，或在室温下放置分钟，或在室温下放置10分钟使分钟使分层。吸出上清液（若有必要，该操作可反复多次），加分层。吸出上清液（若有必要，该操作可反复多次），加2倍体积倍体积2%乙酸钾的乙醇溶液，在冰浴中放置乙酸钾的乙醇溶液，在冰浴中放置1小时使小时使RNA沉淀，此沉淀液可在冰箱内较长期存放。沉淀，此沉淀液可在冰箱内较长期存放。3.若要得到干燥制品，可将沉淀液以若要得到干燥制品，可将沉淀液以4
11、000rpm离心离心10分钟，分钟，倾去上清液。沉淀用少许倾去上清液。沉淀用少许75%乙醇、乙醇、95%乙醇、无水乙醇乙醇、无水乙醇各洗各洗1次，同上法离心，倾去乙醇后，空气干燥。次，同上法离心，倾去乙醇后，空气干燥。4.4.将将RNARNA（准确称取（准确称取30mg30mg左右左右RNARNA干燥制品）溶于干燥制品）溶于5 510mL10mL蒸馏蒸馏水中，离心除去不溶性杂质，得水中，离心除去不溶性杂质，得RNARNA粗品。粗品。 5.RNA5.RNA纯度的鉴定纯度的鉴定一、一、RNA标准曲线的制定标准曲线的制定取取8支试管，编号，按表加入试剂。加毕，摇匀，置沸水支试管，编号，按表加入试剂。
12、加毕，摇匀，置沸水浴中加热浴中加热15min，冷却，测，冷却，测OD670值。以值。以OD670值为纵坐值为纵坐标，标，RNA含量（含量（ug/ml）为横坐标绘制标准曲线。）为横坐标绘制标准曲线。二、制品的测定二、制品的测定取取0.20.5ml制品液于试管中，加蒸馏水稀释至制品液于试管中，加蒸馏水稀释至2ml，然后加，然后加2ml地衣酚试剂摇匀，于沸水中煮沸地衣酚试剂摇匀，于沸水中煮沸15分钟，冷却，测分钟，冷却，测OD670。根据测得的吸光度，从标准曲线上查出相当该吸光度的。根据测得的吸光度，从标准曲线上查出相当该吸光度的RNA的含量。的含量。三、三、RNA含量的计算含量的计算根据测得的光吸
13、收值，从标准曲线上查出相当该光吸收值的根据测得的光吸收值，从标准曲线上查出相当该光吸收值的RNA含量。按下式计算出制品中含量。按下式计算出制品中RNA的百分含量：的百分含量：样品液样品液RNA含量含量(ug/ml)=标准曲线查到的值标准曲线查到的值稀释倍数稀释倍数操作参照表管号管号01234567RNA标标准液准液/ml00.20.40.81.01.21.62.0蒸馏水蒸馏水/ml21.81.61.21.00.80.40地衣酚地衣酚试剂试剂/ml22222222注意事项1：在操作中当加入变性剂氯仿后，为了保证核酸样：在操作中当加入变性剂氯仿后，为了保证核酸样品的完整性，操作要轻，尤其在提品的完
14、整性，操作要轻，尤其在提DNA时，更要避时，更要避免剧烈操作免剧烈操作2：在沉淀核酸时可用乙醇与异丙醇，乙醇的极性要：在沉淀核酸时可用乙醇与异丙醇，乙醇的极性要强于异丙醇，所以一般用强于异丙醇，所以一般用2V乙醇沉淀，但在多糖、乙醇沉淀，但在多糖、蛋白含量高时，用异丙醇沉淀可部分克服这种污染，蛋白含量高时，用异丙醇沉淀可部分克服这种污染，尤其用异丙醇在室温下沉淀对摆脱多糖、杂蛋白污尤其用异丙醇在室温下沉淀对摆脱多糖、杂蛋白污染更为有效。染更为有效。3：在提取核酸时，如样品浓度低，则应增加有机溶：在提取核酸时，如样品浓度低，则应增加有机溶剂沉淀时间，剂沉淀时间，70下下30min;20过夜将有助
15、于过夜将有助于增加核酸的沉淀量。增加核酸的沉淀量。4:RNA通常用分光光度计定量，测量在通常用分光光度计定量，测量在260nm处的处的吸收值（吸收值（A260）。通常分光光度计）。通常分光光度计A260的读数要介的读数要介于于0.15-1.0之间才是可靠的，因此之间才是可靠的，因此RNA提取结束后，提取结束后，要根据大概产量稀释到适当浓度范围，再用分光光度要根据大概产量稀释到适当浓度范围，再用分光光度计测量。计测量。A260为为1相当于相当于RNA的浓度为的浓度为40g/ml。问题及答案一、提取制备一、提取制备RNA常用的方法有那几种？常用的方法有那几种？ 主要有苯酚、异硫氰酸胍、主要有苯酚、
16、异硫氰酸胍、CTABCTAB、LiClLiCl密度梯度、密度梯度、TrizolTrizol等方法。等方法。 二、制备二、制备RNA应注意哪些问题应注意哪些问题. 1.1.整个过程应注意预防整个过程应注意预防RNARNA酶的污染酶的污染 2.2.匀浆后加氯仿之前样品可以在匀浆后加氯仿之前样品可以在-60-60至至-70-70保存至少一保存至少一个月。个月。三、地衣酚反应中，干扰三、地衣酚反应中，干扰RNA的测定因素有哪些的测定因素有哪些？如何能减少他们的影响？如何能减少他们的影响？ 1.DNA1.DNA，地衣酚反应特异性较差，凡戊糖均有此反应，地衣酚反应特异性较差，凡戊糖均有此反应，DNADNA及其他杂质也有影响。故一般测定及其他杂质也有影响。故一般测定RNARNA时，可先测定样时，可先测定样品中品中DNADNA含量，再算出含量，再算出RNARNA含量。含量。 2.2.蛋白质，本法较灵敏。样品中蛋白质含量高时，应先蛋白质，本法较灵敏。样品中蛋白质含量高时，应先用用5%5%三氯醋酸溶液将蛋白质沉淀后再测定，否则将发生干三氯醋酸溶液将蛋白质沉淀后再测定，否则将发生干扰。扰。
