《基因工程的操作过程》由会员分享，可在线阅读，更多相关《基因工程的操作过程（65页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、基因工程基因工程 第十三章第十三章 基因工程的操作过程基因工程的操作过程第十三章第十三章第十三章第十三章 基因工程的操作过程基因工程的操作过程三、三、 转化子的筛选和鉴定（检）转化子的筛选和鉴定（检）二、二、 重组重组DNADNA分子的转化和扩增（转、增）分子的转化和扩增（转、增）一、一、 DNADNA的体外重组（切、接）的体外重组（切、接）第十三章第十三章第十三章第十三章 基因工程的操作过程基因工程的操作过程切切接接转转增增检检一、一、 DNADNA的体外重组（切与接）的体外重组（切与接）第十三章第十三章第十三章第十三章 基因工程的操作过程基因工程的操作过程同种内切酶生产的粘性末端的连接同种
2、内切酶生产的粘性末端的连接同尾酶生产的粘性末端的连接同尾酶生产的粘性末端的连接不同粘性末端的连接不同粘性末端的连接粘性末端的更换粘性末端的更换人工粘性末端的连接人工粘性末端的连接重组率重组率1.1.同种内切酶生产的粘性末端的连接同种内切酶生产的粘性末端的连接5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRIEcoRI5GCTTAAAATTCG5 5 GCTTAA 55 AATTCG5 退火退火GCTTAAAATTCG5 GCTTAA 5 AATTCGGCTTAAAATTCG5 GCTTAA 5 AATTCGT4-DNA T4-DNA ligaseligaseGAATTCCTTAA
3、G5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAG2. 2. 同尾酶生产的粘性末端的连接同尾酶生产的粘性末端的连接BamHIBamHI5 5GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5GCCTAGGATCCG5 5 TACTAG 55 GATCAT5 退火退火GCCTAGGATCCG5 TACTAG 5 GATCATT4-DNA T4-DNA ligaseligaseTGATCCACTAGG5 5GGATCACCTAGT5 TGATCAACTAGT5 BclIBclIGCCTAGGATCCG5 TACTAG 5 GATCATTGATCCACTAGG5
4、5GGATCACCTAGT3. 3. 不同粘性末端的连接不同粘性末端的连接BamHIBamHI5 5GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5GCCTAGGATCCG5 5 CTGCAG5 GACGTC3 T4-DNA T4-DNA ligaseligaseCGATCCGCTAGG5 5GGATCGCCTAGC5 CTGCAGGACGTC5 PstIPstI3 T4-DNA T4-DNA polpol切平切平5 CG5 GCKlenowKlenow补平补平5GGATCCCTAGGATCC5 CTAGGCGATCCGCTAGG5 5GGATCGCCTAGC4. 4. 人工粘性末端的连接人
5、工粘性末端的连接 55突出末端突出末端5GCCTAGGATCCG5 5 GCTTAA 555 AATTCGT4-DNA T4-DNA ligaseligase5 5KlenowKlenow补平补平KlenowKlenow补平补平5GGATCCCTAGGATCC5 CTAGG5 GAATTCTTAA 555 AATTCTTAAGTdTTdTTdTTdTdGTPdGTPdCTPdCTPGAATTGGGGGGCTTAA AATTCGGGGGGTTAAGGGATCCCCCCCCCTAGGATCCCCCCCCCTAGGGAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCC
6、AATTCCCTAGGGGGGGTTAAG5 5GAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG退火退火BamHBamH I IBamHBamH I IEcoREcoR I IBamHBamH I I4.4.人工粘性末端的连接人工粘性末端的连接 33突出末端突出末端CTGCA 3 GG3 ACGTC5 GCATG 3C5C3 GTACGT4-DNA T4-DNA ligaseligaseTdTTdTTdTTdTdCTPdCTPdGTPdGTPGCATGCCCCCC 3C退火退火PstPst I IPstPst I
7、IC3 CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG 3 GG3 GGGGGGACGTC5 5GCATGCCCCCC GC GGGGGGACGTCCTGCAGGGGGG CG CCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCC GC GGGGGGACGTCCTGCAGGGGGG CG CCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGKlenowKlenow
8、PstPst I ISphSph I I4.4.人工粘性末端的连接人工粘性末端的连接 平头末端平头末端C 3 GG5 G 3C5C3 GT4-DNA T4-DNA ligaseligaseTdTTdTTdTTdTdTTPdTTPdATPdATPGTTTTTTTTTT 3C退火退火C3 TTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAA 3 GG3 AAAAAAAAAAC5 5GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTGS1S1C3 5 5GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTG加热加热GTCA
9、TTTTTTTTTGAAAAAAAAACCAGTAAAAAAAAACTTTTTTTTTGTGACCAGT5. 5. 粘性末端的更换粘性末端的更换BamHIBamHI5 5GGATCCCCTAGGT4-DNA T4-DNA ligaseligaseKlenowKlenow补平补平GATCC5 G5GCCTAG55 5GGATCCCTAG5 GATCCCTAGG55GGATCGGAATTCCGATCCCCTAGCCTTAAGGCTAGG5 5EcoREcoR I IGGAATTCCCCTTAAGGEcoREcoR I linker I linker6. 6. 重组率重组率（1 1）重组率的定义）重
10、组率的定义 重组率重组率 = = 含有外源含有外源DNADNA的重组分子数的重组分子数 / / 载体分子总数载体分子总数 在常规实验条件下，重组率一般为在常规实验条件下，重组率一般为25 - 75%25 - 75% 重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以 大大简化大大简化DNADNA重组的后续操作。重组的后续操作。6. 6. 重组率重组率（2 2）提高重组率的方法）提高重组率的方法提高外源提高外源DNADNA片段与载体的分子比片段与载体的分子比：5 5 : : 1 1 - - 10 10 : : 1 1 载体载体DNADNA分子
11、在连接前先除去磷酸基团：分子在连接前先除去磷酸基团： 5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRIEcoRI5GCTTAA pAATTCG5 p5 GCTTAA OH 55 AATTCG5 HO退火退火5 G-A-A-T-T-CC-T-T-A-A G5G A-A-T-T-CC-T-T-A-A-GOHHOOHHO碱性磷酸单酯酶碱性磷酸单酯酶碱性磷酸单酯酶碱性磷酸单酯酶重组率重组率（2 2）提高重组率的方法）提高重组率的方法加装同聚尾末端：加装同聚尾末端： CTGCA 3 GG3 ACGTC5 GCATG 3C5C3 GTACGT4-DNA T4-DNA ligaseligas
12、eTdTTdTTdTTdTdCTPdCTPdGTPdGTPGCATGCCCCCC 3C退火退火C3 CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG 3 GG3 GGGGGGACGTC5 5GCATGCCCCCC GC GGGGGGACGTCCTGCAGGGGGG CG CCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGKlenowKlenow二、二、 重组重组DNADNA分子分子的转化和扩增（转与增）的转化和扩增（转与增）第十三章第十三章第十三章第十三章 基因工程的操作过程基因工程的操作过程
13、转化的原理与技术转化的原理与技术转化率转化率转化细胞的扩增转化细胞的扩增1. 1. 转化的原理与技术转化的原理与技术（1 1）CaCa2+2+诱导的完整细菌细胞的转化诱导的完整细菌细胞的转化 CaCa2+2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等），大肠杆菌等），19701970年建立此技术，其原理是年建立此技术，其原理是CaCa2+2+与细菌外与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态
14、叫做感受态感受态 1. 1. 转化的原理与技术转化的原理与技术（1 1）CaCa2+2+诱导的完整细菌细胞的转化诱导的完整细菌细胞的转化大肠杆菌感受态细胞大肠杆菌感受态细胞的制备：的制备：100 100 ml ml 菌体培养至菌体培养至ODOD600 600 = 0.5= 0.5，离心收集菌体离心收集菌体 用用10 10 ml ml 冰冷的冰冷的10 10 mMmM CaClCaCl22溶液悬浮菌体，离心溶液悬浮菌体，离心用用1 1 ml ml 冰冷的冰冷的75 75 mMmM CaClCaCl22溶液悬浮菌体溶液悬浮菌体 冰浴放置冰浴放置12 - 2412 - 24小时，备用小时，备用 收集
15、菌体收集菌体1. 1. 转化的原理与技术转化的原理与技术（1 1） CaCa2+2+诱导的完整细菌细胞的转化诱导的完整细菌细胞的转化大肠杆菌感受态细胞大肠杆菌感受态细胞的质粒转化：的质粒转化：取取100 100 m ml l 感受态细胞，加入相当于感受态细胞，加入相当于50 50 ngng 载体的重载体的重组组冰浴放置半小时冰浴放置半小时 在在4242保温保温 2 2 分钟（热脉冲）分钟（热脉冲） 快速将转化细胞转移至冰浴中放置快速将转化细胞转移至冰浴中放置1 - 21 - 2分钟分钟 DNADNA连接液，混匀连接液，混匀加入加入1 1 ml ml 新鲜培养基，新鲜培养基，于于3737培养培养
16、 1 1 小时（扩增）小时（扩增） 涂在合适的固体培养基平板上进行筛选涂在合适的固体培养基平板上进行筛选 1. 1. 转化的原理与技术转化的原理与技术（2 2）细菌原生质体的转化）细菌原生质体的转化 革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源DNADNA的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采用的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采用原生质体原生质体（细胞（细胞去壁后的形态）转化的方法转移质粒或重组去壁后的形态）转化的方法转移质粒或重组DNADNA分子分子 酵母菌、霉菌、植物细胞也可用酵母菌、霉菌、植物细胞也可用原生质体法进行转化原生质体法进行转
17、化 1.1.转化的原理与技术转化的原理与技术（2 2）细菌原生质体的转化）细菌原生质体的转化 不同细菌的原生质体制备方法不尽相同，以链霉菌为例：不同细菌的原生质体制备方法不尽相同，以链霉菌为例：细菌需生长在高渗培养基中（如细菌需生长在高渗培养基中（如34%34%的蔗糖溶液，并加入甘氨的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加细菌细胞壁对溶菌酶的敏感性。在制备过程中，菌体酸以增加细菌细胞壁对溶菌酶的敏感性。在制备过程中，菌体应始终悬浮在应始终悬浮在10.3%10.3%的蔗糖等渗溶液中。与原生质体接触的所的蔗糖等渗溶液中。与原生质体接触的所有器皿应保持无水无去污剂有器皿应保持无水无去污剂 细菌原生质体细菌原生
18、质体的制备：的制备：1. 1. 转化的原理与技术转化的原理与技术（2 2）细菌原生质体的转化）细菌原生质体的转化 取取0.2 - 10.2 - 1mlml的原生质体悬浮液（的原生质体悬浮液（10108 88 8-10-109 99 9个原生质体），加个原生质体），加入入10 - 20 10 - 20 m ml DNAl DNA重组连接液，同时加入含有重组连接液，同时加入含有PEG1000PEG1000和和CaCa2+2+的等渗溶液，混匀的等渗溶液，混匀 细菌原生质体细菌原生质体的转化：的转化：细菌原生质体细菌原生质体的再生的再生： 原生质体再生的主要目的是使细菌重新长出细胞壁。再生原生质体再生
19、的主要目的是使细菌重新长出细胞壁。再生在特殊的固体培养基上进行，内含脯氨酸和微量元素在特殊的固体培养基上进行，内含脯氨酸和微量元素 1.1.转化的原理与技术转化的原理与技术（3 3）l l噬菌体噬菌体DNADNA的转染的转染感受态细胞的培养：感受态细胞的培养： 将大肠杆菌在含有麦芽糖（不含葡萄糖）和将大肠杆菌在含有麦芽糖（不含葡萄糖）和MgClMgCl22的培养基的培养基 中培养至中培养至ODOD600 600 = 0.5= 0.5吸附：吸附： 加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液，加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液，3030保温保温1010分钟分钟转染裂解：转染裂解： 加入加入2020倍体积的
20、新鲜培养基，倍体积的新鲜培养基，3030培养培养2 2小时，直至培养液小时，直至培养液 中菌体裂解，培养液澄清度增加，然后涂板筛选中菌体裂解，培养液澄清度增加，然后涂板筛选1.1.转化的原理与技术转化的原理与技术（4 4） 电穿孔转化电穿孔转化 将将待待转转化化的的质质粒粒或或DNADNA重重组组连连接接液液加加在在电电穿穿孔孔转转化化仪仪的的样样品品池池中中，两两极极施施加加高高压压电电场场。在在强强大大电电场场的的作作用用下下，细细菌菌细细胞胞壁壁和和细胞膜产生缝隙，质粒或细胞膜产生缝隙，质粒或DNADNA重组分子便可进入细胞内重组分子便可进入细胞内 电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含
21、细胞壁结构的受电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大体细胞均有效，但转化效率差别很大 同样的原理，电穿孔法也可用于质粒消除实验同样的原理，电穿孔法也可用于质粒消除实验2. 2. 转化率转化率（1 1）转化率的定义）转化率的定义 转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义为：每转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义为：每微克微克载体载体DNADNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。由于在一般的转在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。由于在一般的转化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分子，因此化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分子
22、，因此转化率的定义也可以表征为：每转化率的定义也可以表征为：每微克微克载体载体DNADNA转化后，受体细胞转化后，受体细胞接纳接纳DNADNA的个数，即克隆数（在筛选时，未接纳载体或重组子的的个数，即克隆数（在筛选时，未接纳载体或重组子的受体细胞不长）受体细胞不长）2. 2. 转化率转化率（1 1）转化率的定义）转化率的定义 例例如如，pUC18pUC18对对大大肠肠杆杆菌菌的的转转化化率率为为101088，即即每每微微克克pUC18pUC18中中只只有有101088个个分分子子能能进进入入受受体体细细胞胞。一一微微克克pUC18pUC18共共有有3.43.4X10X101111个个分分子子（
23、6.026.02X10X1017 17 / / 2686X6602686X660），也也就就是是说说，每每34003400个个pUC18pUC18分分子才有子才有一一个分子进入受体细胞个分子进入受体细胞 另另一一方方面面，在在实实际际操操作作过过程程中中，转转化化一一微微克克pUC18pUC18共共需需2 2mlml感感受受态态细细胞胞，大大约约含含有有2 2X10X101010个个大大肠肠杆杆菌菌细细胞胞，也也就就是是说说，每每200200个细胞只有个细胞只有一一个细胞能接纳个细胞能接纳pUC18 DNApUC18 DNA 2. 2. 转化率转化率（2 2）转化率的用途）转化率的用途 利用转
24、化率和重组率等参数可以帮助设计利用转化率和重组率等参数可以帮助设计DNADNA重组实验规模重组实验规模例如，例如，某一某一DNADNA重组实验的重组率为重组实验的重组率为20%20%，转化率为，转化率为101077/ /m mg g载体，载体， 经切接处理后的载体转化率比天然的载体低经切接处理后的载体转化率比天然的载体低100100倍，倍，欲获得欲获得10104 44 4个个 重组克隆，需投入多少载体重组克隆，需投入多少载体DNADNA进行重组实验？进行重组实验？ 若重组率为若重组率为100%100%，则转化后产生，则转化后产生101044个重组克隆需要：个重组克隆需要： 101044 / 1
25、0 / 1077 X 10 X 10 - 2- 2 = 0.1 = 0.1 m mg g 载体载体DNADNA 考虑到实验系统的重组率为考虑到实验系统的重组率为20%20%，所以实际投入载体应为：，所以实际投入载体应为： 0.1 / 20% = 0.50.1 / 20% = 0.5 m mg g 载体载体DNADNA 载体投入量确定后，外源载体投入量确定后，外源DNADNA的投入量即可按的投入量即可按1010 1 1的要求算的要求算出（出（5 5 m mg g），甚至还可以估算需要涂布多少块平板进行筛选），甚至还可以估算需要涂布多少块平板进行筛选 2. 2. 转化率转化率（3 3）转化率的影响
26、因素）转化率的影响因素载体及载体及DNADNA重组分子方面：重组分子方面： 载体本身的性质载体本身的性质：不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同 载体的空间构象载体的空间构象：质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接操作后的载质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接操作后的载体由于空间构象难以恢复，其转化率一般要比新制备的体由于空间构象难以恢复，其转化率一般要比新制备的超螺旋质粒低两个数量级超螺旋质粒低两个数量级插入片段的大小插入片段的大小：对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低 2. 2. 转化率转化率（
27、3 3）转化率的影响因素）转化率的影响因素受体细胞方面：受体细胞方面： 受体细胞必须与载体相匹配，例如：受体细胞必须与载体相匹配，例如：pBR322pBR322转化大转化大肠杆菌肠杆菌JM83JM83株，转化率很低；但对大肠杆菌株，转化率很低；但对大肠杆菌ED8767ED8767株的株的转化率则较高转化率则较高 2. 2. 转化率转化率（3 3）转化率的影响因素）转化率的影响因素转化方法方面：转化方法方面： 受体细胞的预处理受体细胞的预处理：影响最大影响最大供受体的比例供受体的比例：CaCa2+2+诱导转化诱导转化 0.1 0.1 ml ml 感受态感受态细胞细胞 50 50 ngng DNA
28、 DNA 转化方法转化方法：CaCa2+2+诱导转化诱导转化 101066 - 10 - 1077 / / m mg DNAg DNA 原生质体转化原生质体转化 101099 个个原生质体原生质体 50 50 ngng DNA DNA 原生质体转化原生质体转化 101055 - 10 - 1066 / / m mg DNAg DNA l l-DNA-DNA转染转染 101077 - 10 - 1088 / / m mg DNAg DNA 电穿孔转化电穿孔转化 101066 - 10 - 1099 / / m mg DNAg DNA 3. 3. 转化细胞的扩增转化细胞的扩增（1 1）扩增操作）扩
29、增操作 转化细胞的扩增操作是指转化完成之后细胞的短时间培转化细胞的扩增操作是指转化完成之后细胞的短时间培养。在实验时，扩增操作往往与转化操作偶联在一起，如：养。在实验时，扩增操作往往与转化操作偶联在一起，如： CaCa2+2+诱导转化后的诱导转化后的3737培养培养一个一个小时小时 原生质体转化后的再生过程原生质体转化后的再生过程 l l噬菌体转染后的噬菌体转染后的3030培养等，均属扩增操作培养等，均属扩增操作 3. 3. 转化细胞的扩增转化细胞的扩增（2 2）扩增操作的目的）扩增操作的目的增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序
30、扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选 表达外源基因，便于筛选和鉴定表达外源基因，便于筛选和鉴定 三、三、 转化子的筛选和鉴定（检）转化子的筛选和鉴定（检）第十三章第十三章第十三章第十三章 基因工程的操作过程基因工程的操作过程载体遗传标记检测载体遗传标记检测克隆克隆DNADNA序列检测序列检测外源基因产物检测外源基因产物检测三、三、 转化子的筛选和鉴定（检）转化子的筛选和鉴定（检）第十三章第十三章第十三章第十三章 基因工程的操作过程基因工程的操作过程 由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种
31、筛选和鉴定方法区分助各种筛选和鉴定方法区分转化子转化子与非转化子与非转化子、重组子重组子与非与非重组子、重组子、目的重组子目的重组子与非目的重组子与非目的重组子转化子转化子重组子重组子目的重组子目的重组子1. 1. 载体遗传标记检测载体遗传标记检测（1 1）抗药性筛选法）抗药性筛选法ROPROISal IBamH ITcrPvu IPst IPst IEcoR ICla IHind IIIHind IIBal IApr抗药性筛选法的基本原理：抗药性筛选法的基本原理： pBR3224363 bpori抗药性筛选法可区分抗药性筛选法可区分转化子转化子与与非转非转化子化子、重组子重组子与与非重组子非
32、重组子将外源将外源DNADNA片段插在片段插在EcoRIEcoRI位点：位点： 非重组子呈非重组子呈 ApAprr、TcTcrr 重组子呈重组子呈 ApAprr、TcTcrr将外源将外源DNADNA片段插在片段插在BamHIBamHI位点：位点： 非重组子呈非重组子呈 ApAprr、TcTcrr 重组子呈重组子呈 ApAprr、TcTcss 1. 1. 载体遗传标记检测载体遗传标记检测（1 1）抗药性筛选法）抗药性筛选法抗药性筛选法的基本操作：抗药性筛选法的基本操作： 先将转化液涂布含有先将转化液涂布含有ApAp的平板的平板再将再将ApAp平板上的转化子影印至平板上的转化子影印至含含有有ApA
33、p和和TcTc的平板上的平板上在在ApAp平板上生长、但在平板上生长、但在ApAp和和TcTc平平板上板上不长的转化子即为不长的转化子即为重组子重组子 ApApApAp + + TcTc影印影印挑选挑选1. 1. 载体遗传标记检测载体遗传标记检测（2 2）营养缺陷型筛选法）营养缺陷型筛选法营养缺陷型筛选法的基本原理：营养缺陷型筛选法的基本原理： 营养缺陷型筛选法可以区分营养缺陷型筛选法可以区分转化子转化子与非转化子，一般不与非转化子，一般不能区分能区分重组子重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种营养组份的合成基因，而受体细胞本身不能合成这一营养组
34、营养组份的合成基因，而受体细胞本身不能合成这一营养组份，将转化细胞涂布在不含此营养组份的培养基上，长出的份，将转化细胞涂布在不含此营养组份的培养基上，长出的便是转化子便是转化子 1. 1. 载体遗传标记检测载体遗传标记检测（2 2）营养缺陷型筛选法）营养缺陷型筛选法常见的营养缺陷型筛选标记：常见的营养缺陷型筛选标记： 哺乳动物细胞中存在两条哺乳动物细胞中存在两条dTTPdTTP的合成途径：的合成途径： 用于用于大肠杆菌大肠杆菌的营养标记基因常选用色氨酸生物合成基因的营养标记基因常选用色氨酸生物合成基因trptrp+用于高等用于高等哺乳动物细胞哺乳动物细胞的营养标记基因常使用胸腺嘧啶核苷激的营养
35、标记基因常使用胸腺嘧啶核苷激酶基因酶基因tktk，相应的受体细胞则选择相应的受体细胞则选择tktk- -缺陷型缺陷型dCDPdCDPdTDPdTDPdTTPdTTPT TRRdTMPdTMPdTDPdTDPdTTPdTTPAPAPTKTKAP AP 氨基喋呤氨基喋呤TK TK 胸腺嘧啶核苷激酶胸腺嘧啶核苷激酶1.1.载体遗传标记检测载体遗传标记检测（3 3）显色筛选法）显色筛选法显色筛选法的基本原理：显色筛选法的基本原理： 显色筛选法可以区分显色筛选法可以区分转化子转化子与非转化子，也可区分与非转化子，也可区分重组子重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种显色酶基因，其与非重组子。其原理
36、是：载体分子上携带某种显色酶基因，其表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选，如大表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选，如大肠杆菌质粒肠杆菌质粒pUC18pUC18携带的携带的lacZlacZ 基因（蓝色反应）、链霉菌质粒基因（蓝色反应）、链霉菌质粒pIJ702pIJ702携带的携带的melCmelC基因（黑色反应）等基因（黑色反应）等1. 1. 载体遗传标记检测载体遗传标记检测（3 3）显色筛选法）显色筛选法显色筛选法的基本操作：显色筛选法的基本操作： pUC18AprlacZoriApAp + X-gal + X-gal重组子（重组子（ApAprr + + lacZla
37、cZ-） 将将外外源源基基因因克克隆隆在在pUC18pUC18的的lacZlacZ 标标记记基基因因内内部部，使使之之灭灭活活，此此时时重重组组子子呈呈ApAprr、lacZlacZ-，淡淡黄黄色色菌菌落落；而而非非重组子则呈重组子则呈ApAprr、lacZlacZ+，蓝色菌落蓝色菌落 2. 2. 克隆克隆DNADNA序列检测序列检测（1 1）限制性酶切图谱法）限制性酶切图谱法 所谓的限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外源所谓的限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外源DNADNA片片段进行酶切图谱分析，并以此与目的基因的已知图谱对比，因段进行酶切图谱分析，并以此与目的基因的已知图谱对比，因此利用
38、这种方法不仅能区分此利用这种方法不仅能区分重组子重组子与非重组子，而且还能鉴定与非重组子，而且还能鉴定目的重组子目的重组子。但这种方法在用于数千规模的转化子筛选时，工。但这种方法在用于数千规模的转化子筛选时，工作量极大，实验成本也高。作量极大，实验成本也高。2.2.克隆克隆DNADNA序列检测序列检测（1 1）限制性酶切图谱法）限制性酶切图谱法全酶解图谱法：全酶解图谱法：pUC18 pUC18 2.7 kb2.7 kbHindIIIHindIII SphISphI PstIPstI SalISalI BamHIBamHI SmaISmaI KpnIKpnI EcoRIEcoRIApAprrla
39、cZlacZorioriBBBBEEPP4.0 kb4.0 kb1.0 kb1.0 kb0.8 kb0.8 kb区分重组子与非重组子区分重组子与非重组子用用BamHIBamHI酶切转化子质粒酶切转化子质粒DNADNA电泳观察酶解产物片段电泳观察酶解产物片段重组子：重组子： 2.7 2.7 kbkb + 4.0 kb + 4.0 kb非重组子：非重组子： 2.7 2.7 kbkb如果外源如果外源DNADNA片段也是片段也是2.7 2.7 kbkb，最好最好选用单一切口的酶将质粒线型化，然选用单一切口的酶将质粒线型化，然后通过其长度来鉴定其是否为重组子后通过其长度来鉴定其是否为重组子2. 2. 克
40、隆克隆DNADNA序列检测序列检测（1 1）限制性酶切图谱法）限制性酶切图谱法全酶解图谱法：全酶解图谱法：pUC18 pUC18 2.7 kb2.7 kbHindIIIHindIII SphISphI PstIPstI SalISalI BamHIBamHI SmaISmaI KpnIKpnI EcoRIEcoRIApAprrlacZlacZorioriSSSSBBPP4.0 kb4.0 kb1.0 kb1.0 kb0.8 kb0.8 kb区分重组子与非重组子区分重组子与非重组子如果外源如果外源DNADNA片段插在片段插在pUC18pUC18的的SphISphI位点处，原则上也可用位点处，原则
41、上也可用SphISphI酶解鉴定，但这样做很不经济，酶解鉴定，但这样做很不经济，因为因为SphISphI非常昂贵（每非常昂贵（每100100单位单位5050美元）。用美元）。用HindIIIHindIII和和EcoRIEcoRI联联合酶解同样可以达到目的，但这合酶解同样可以达到目的，但这两种酶的价格只及两种酶的价格只及SphISphI的的1 / 501 / 50 2. 2. 克隆克隆DNADNA序列检测序列检测（1 1）限制性酶切图谱法）限制性酶切图谱法全酶解图谱法：全酶解图谱法：pUC18 pUC18 2.7 kb2.7 kbHindIIIHindIII SphISphI PstIPstI
42、SalISalI BamHIBamHI SmaISmaI KpnIKpnI EcoRIEcoRIApAprrlacZlacZorioriBBBBEEPP4.0 kb4.0 kb1.0 kb1.0 kb0.8 kb0.8 kb区分目的重组子与非目的重组子区分目的重组子与非目的重组子用用EcoRIEcoRI酶切转化子质粒酶切转化子质粒DNADNA目的重组子：目的重组子： 3.0 3.0 kbkb + + 3.7 kb3.7 kb 或者：或者： 1.0 1.0 kbkb + + 5.7 kb5.7 kb用用PstIPstI酶切转化子质粒酶切转化子质粒DNADNA目的重组子：目的重组子： 3.2 3.
43、2 kbkb + + 3.5 kb3.5 kb 或者：或者： 0.8 0.8 kbkb + + 5.9 kb5.9 kb2.2.克隆克隆DNADNA序列检测序列检测(1)(1)限制性酶切图谱法限制性酶切图谱法全酶解图谱法：全酶解图谱法：pUC18 pUC18 2.7 kb2.7 kbHindIIIHindIII SphISphI PstIPstI SalISalI BamHIBamHI SmaISmaI KpnIKpnI EcoRIEcoRIApAprrlacZlacZorioriBBBBEE4.0 kb4.0 kb2.0 kb2.0 kb2.0 kb2.0 kb区分目的重组子与非目的重组子区
44、分目的重组子与非目的重组子对图示的克隆片段，转化子质粒对图示的克隆片段，转化子质粒DNADNA用用EcoRIEcoRI酶切开后，只出现酶切开后，只出现2.0 2.0 kbkb和和2.7 2.7 kbkb两条带子，实际上两条带子，实际上2.0 2.0 kbkb的条带中含有两种不同的的条带中含有两种不同的分子分子2.7 kb2.7 kb2.0 kb2.0 kbEE2.2.克隆克隆DNADNA序列检测序列检测(1)(1)限制性酶切图谱法限制性酶切图谱法部分酶解图谱法：部分酶解图谱法：2.2 kb2.2 kbPstIPstI EcoRIEcoRI BamHIBamHIBBBBEE4.4 kb4.4 k
45、b1.2 1.2 1.8 kb1.8 kbEEBB0.6 0.6 0.8 0.8 该重组质粒经酶解后，分别得到下列几组数据：该重组质粒经酶解后，分别得到下列几组数据：BamHIBamHI全酶解：全酶解：0.6 0.8 1.8 0.6 0.8 1.8 3.43.4 kbkbBamHI+EcoRIBamHI+EcoRI全酶解：全酶解：0.6 0.8 1.8 1.2 0.6 0.8 1.8 1.2 2.22.2 kbkb其中，其中，1.2 1.2 kbkb片段的存在表明该片段位于一端片段的存在表明该片段位于一端BamHIBamHI部分酶解：部分酶解：1.4 2.6 1.4 2.6 4.04.0 kb
46、kb其中，其中，1.4 1.4 kbkb的片段必为的片段必为0.6 0.6 kbkb和和0.8 0.8 kbkb两片段，表两片段，表明两者是连在一起的；同理，明两者是连在一起的；同理，2.6 2.6 kbkb的片段必为的片段必为0.8 0.8 kbkb和和1.8 1.8 kbkb两片段，表明两者是连在一起的；最后，两片段，表明两者是连在一起的；最后，4.0 4.0 kbkb的片段必为的片段必为0.6 0.6 kbkb和和3.4 3.4 kbkb两片段，表明两者两片段，表明两者是连在一起的是连在一起的2.2.克隆克隆DNADNA序列检测序列检测(2)(2)菌落噬菌斑原位杂交法菌落噬菌斑原位杂交法
47、 菌落或噬菌斑原位杂交法的工作原理是根据克隆的目的基菌落或噬菌斑原位杂交法的工作原理是根据克隆的目的基因或因或DNADNA片段的片段的同源序列同源序列设计并合成设计并合成探针探针，以此搜寻筛选含有，以此搜寻筛选含有目的基因的目的基因的目的重组子目的重组子。其中，。其中，DNADNA同源序列之间的特异性互同源序列之间的特异性互补杂交是该技术的基本理论依据补杂交是该技术的基本理论依据 2.2.克隆克隆DNADNA序列检测序列检测(2)(2)菌落噬菌斑原位杂交法菌落噬菌斑原位杂交法菌落原位杂交法的基本操作：菌落原位杂交法的基本操作：影印影印用硝酸纤维素薄膜影印克隆平板用硝酸纤维素薄膜影印克隆平板 洗
48、涤洗涤杂交杂交感光感光用用0.40.4NN的的NaOHNaOH溶液浸泡影印薄膜溶液浸泡影印薄膜 用用SSCSSC溶液浸泡清洗影印薄膜溶液浸泡清洗影印薄膜 8080烘干固定影印薄膜烘干固定影印薄膜 薄膜置于含有探针的杂交溶液中保温薄膜置于含有探针的杂交溶液中保温 用用SSC-SDSSSC-SDS液洗涤杂交薄膜液洗涤杂交薄膜 用用XX光胶片覆盖薄膜感光光胶片覆盖薄膜感光 2.2.克隆克隆DNADNA序列检测序列检测(2)(2)菌落噬菌斑原位杂交法菌落噬菌斑原位杂交法杂交探针的制备：杂交探针的制备：用于菌落或噬菌斑原位杂交的探针必须满足下列条件：用于菌落或噬菌斑原位杂交的探针必须满足下列条件：单链结
49、构（双链单链结构（双链DNADNA可用碱变性）可用碱变性） 足够长度（至少足够长度（至少1212个个碱基）碱基） 内部不含互补区内部不含互补区 探针的制备方法或来源包括：探针的制备方法或来源包括：人工合成人工合成 cDNAcDNA合成合成 同源序列同源序列 mRNAmRNA 2.2.克隆克隆DNADNA序列检测序列检测(2)(2)菌落噬菌斑原位杂交法菌落噬菌斑原位杂交法杂交探针的标记：杂交探针的标记：T4-PNPT4-PNP介导的末端标记介导的末端标记5 HO3 HOOH 3 OH 5 T4-PNPT4-PNPMgMg2+2+ p pppATPppATP（g g- -3232P-ATPP-AT
50、P）5 p3 HOOH 3 p 5 2. 2. 克隆克隆DNADNA序列检测序列检测(2)(2)菌落噬菌斑原位杂交法菌落噬菌斑原位杂交法杂交探针的标记：杂交探针的标记：逆转录酶逆转录酶介导的反转录标记介导的反转录标记3 3 AAAAAAAAAAACCAGCTTCCAAAAAAAAAAACCAGCTTCCGGAACTGATTTAGGCTAACTGATTTAGGCT 55mRNAmRNA反转录酶反转录酶MgMg2+2+ dNTPdNTP + + p pp pp pd dATPATP（a a- -3232P-dATPP-dATP）5 5 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT55mRNAmRN
51、A33cDNAcDNA3 3 AAAAAAAAAAACCAGCTTCCAAAAAAAAAAACCAGCTTCCGGAACTGATTTAGGCTAACTGATTTAGGCT5 5 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGTCGGGTCGAAAAGGGGCTTGCTTGA ACTCTAAAAAATCCGTCCGA A2.2.克隆克隆DNADNA序列检测序列检测(2)(2)菌落噬菌斑原位杂交法菌落噬菌斑原位杂交法杂交探针的标记：杂交探针的标记：DNADNA聚合酶聚合酶介导的缺刻前移标记介导的缺刻前移标记5 5 GG- -CC- -T T- -CC- -AA- -GG- -CC- -T T-
52、-GG- -GG- -AA- -GG- -T 3T 33 3 CC- -GG- -AA- -GG- -T T- -CC- -GG- -AA- -CC- -CC- -T T- -CC- -A A 5 5 MgMg2+ 2+ 5 5 dNTPdNTP 5 5 ppppp p dA dA（a a- -3232P-dATPP-dATP）5 5 GG- -CC- -T T- -C AC A- -GG- -CC- -T T- -GG- -GG- -AA- -GG- -T 3T 33 3 CC- -GG- -AA- -GG- -T T- -CC- -GG- -AA- -CC- -CC- -T T- -CC-
53、 -A A 5 5 5 5 GG- -CC- -T T- -CC- -A-GA-G- -CC- -T T- -GG- -GG- -AA- -GG- -T 3T 33 3 CC- -GG- -AA- -GG- -T T- -CC- -GG- -AA- -CC- -CC- -T T- -CC- -A A 5 5 DNaseDNase I IDNA DNA polpol I I2. 2. 克隆克隆DNADNA序列检测序列检测(2)(2)菌落噬菌斑原位杂交法菌落噬菌斑原位杂交法杂交探针的标记：杂交探针的标记：ABCABC荧光标记荧光标记GCTTGAGCAGTAACCTGGCTTGAGCAGTAACCT
54、G荧光胺荧光胺Biotin Biotin 生物素生物素AvidinAvidin生物素结合蛋白生物素结合蛋白烷烃连接臂烷烃连接臂2. 2. 克隆克隆DNADNA序列检测序列检测(2)(2)菌落噬菌斑原位杂交法菌落噬菌斑原位杂交法杂交探针的标记：杂交探针的标记：ABCABC显色酶标记显色酶标记GCTTGAGCAGTAACCTGGCTTGAGCAGTAACCTG显色酶显色酶Biotin Biotin 生物素生物素AvidinAvidin 生物素结合蛋白生物素结合蛋白烷烃连接臂烷烃连接臂生色底物生色底物颜色产物颜色产物2. 2. 克隆克隆DNADNA序列检测序列检测(2)(2)菌落噬菌斑原位杂交法菌落
55、噬菌斑原位杂交法杂交探针的标记：杂交探针的标记：地高辛系统标记地高辛系统标记dUTPdUTP- -连接臂连接臂- -甾醇半抗原甾醇半抗原digoxigenindigoxigenin DIG DIG抗体抗体- -显色酶显色酶交联复合物交联复合物2.2.克隆克隆DNADNA序列检测序列检测(3) DNA(3) DNA序列分析法序列分析法双脱氧末端终止测序法的基本原理：双脱氧末端终止测序法的基本原理： DNADNA序序列列测测定定是是精精确确鉴鉴定定目目的的基基因因的的重重要要手手段段，目目前前国国际际上上流流行行采采用用SangerSanger发发明明的的双双脱脱氧氧末末端端终终止止法法测测定定D
56、NADNA序序列列，其其工工作作原原理理是是在在DNADNA聚聚合合反反应应的的进进程程中中，通通过过位位点点特特异异性性终终止止测测定定DNADNA序序列列其关键技术有：其关键技术有：DNADNA链聚合反应时的定点随机中断（链聚合反应时的定点随机中断（ddNTPddNTP）聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨率（聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨率（600 600 bpbp / 601 / 601 bpbp）电脑自动检测、记录、编辑程序电脑自动检测、记录、编辑程序用于用于DNADNA测序的专一性试剂盒（测序的专一性试剂盒（KitKit）2. 2. 克隆克隆DNADNA序列检测序列检测(3) DNA(3) DN
57、A序列分析法序列分析法双脱氧末端终止测序法的基本操作：双脱氧末端终止测序法的基本操作： AA CC GG TT ssDNAssDNA ssDNAssDNA ssDNAssDNA ssDNAssDNA PrimerPrimer PrimerPrimer PrimerPrimer PrimerPrimer KlenowKlenowKlenowKlenowKlenowKlenowKlenowKlenowdNTPsdNTPsdNTPsdNTPsdNTPsdNTPsdNTPsdNTPsddATPddATPddCTPddCTPddGTPddGTPddTTPddTTPAA GG TT CC DNADNA聚合
58、反应聚合反应聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳2. 2. 克隆克隆DNADNA序列检测序列检测(3) DNA(3) DNA序列分析法序列分析法双脱氧末端终止测序法的基本反应：双脱氧末端终止测序法的基本反应： KlenowOH 35 PTdNTP + ddATP TTTTTOH 35 PAA GG TT CC GGCATTGCGTTACTAGTCCAGTACAGGCATTGCGTTACTAGTCCAGTACA3. 3. 外源基因产物检测外源基因产物检测(1)(1)蛋白质生物功能测定法蛋白质生物功能测定法淀粉酶目的基因的鉴定：淀粉酶目的基因的鉴定： 淀粉酶能将淀粉水解为多糖或单糖。将难溶淀粉酶能
59、将淀粉水解为多糖或单糖。将难溶淀粉酶能将淀粉水解为多糖或单糖。将难溶于水淀粉酶能将淀粉水解为多糖或单糖。将难溶于水的淀粉加入固体培养基内，培养基呈混浊状。将的淀粉加入固体培养基内，培养基呈混浊状。将待鉴定的重组克隆涂布在此培养基上，含目的基因的待鉴定的重组克隆涂布在此培养基上，含目的基因的目的重组子目的重组子可可其表达的淀粉酶分泌出胞外，并均匀扩散，同时降解淀粉为可溶性其表达的淀粉酶分泌出胞外，并均匀扩散，同时降解淀粉为可溶性的多糖或单糖。因此，的多糖或单糖。因此，目的重组子目的重组子菌落周围会形成透明圈。如果透菌落周围会形成透明圈。如果透明圈不明显，还可往培养板上喷碘，使淀粉所在区域呈蓝色本
60、底，明圈不明显，还可往培养板上喷碘，使淀粉所在区域呈蓝色本底，易于辨认。易于辨认。 蛋白酶、脂肪酶等目的基因也可采用类似的方法进行鉴定蛋白酶、脂肪酶等目的基因也可采用类似的方法进行鉴定3.3.外源基因产物检测外源基因产物检测(1)(1)蛋白质生物功能测定法蛋白质生物功能测定法抗菌素抗性基因的鉴定：抗菌素抗性基因的鉴定： 抗抗菌菌素素抗抗性性基基因因表表达达的的蛋蛋白白质质能能使使受受体体细细胞胞产产生生对对该该抗抗生生素素的的抗抗性性。据据此此，只只需需往往培培养养板板中中加加入入适适量量抗抗生生素素，理理论论上上长长出出的的菌落即是含有目的基因的目的重组子菌落即是含有目的基因的目的重组子 在
61、在实实际际操操作作过过程程中中，由由于于抗抗生生素素有有时时会会诱诱导导受受体体细细胞胞产产生生抗抗性性，因因此此必必须须从从抗抗性性重重组组克克隆隆中中抽抽出出重重组组质质粒粒，二二次次转转化化受受体体细细胞胞。如如果果此此时时转转化化平平板板上上出出现现大大量量的的抗抗性性菌菌落落，即即可可认认为为这这种种抗抗性确由目的基因的编码产物产生性确由目的基因的编码产物产生3.3.外源基因产物检测外源基因产物检测(1)(1)蛋白质生物功能测定法蛋白质生物功能测定法抗菌素抗性基因的鉴定：抗菌素抗性基因的鉴定： 目的重组子目的重组子 诱导抗性诱导抗性 抽取重组质粒抽取重组质粒再次转化再次转化3. 3.
62、 外源基因产物检测外源基因产物检测(1)(1)蛋白质生物功能测定法蛋白质生物功能测定法DNADNA结合蛋白编码基因的鉴定：结合蛋白编码基因的鉴定： 影印影印用用聚乙烯薄膜聚乙烯薄膜影印裂解平板影印裂解平板 洗涤洗涤杂交杂交感光感光轻轻漂洗影印薄膜，干燥固定轻轻漂洗影印薄膜，干燥固定 8080烘干固定影印薄膜烘干固定影印薄膜 与探针溶液中杂交与探针溶液中杂交 洗涤、干燥、感光洗涤、干燥、感光 用用氯仿蒸汽氯仿蒸汽或或烈性噬菌体喷洒烈性噬菌体喷洒克隆平板克隆平板 聚乙烯膜探针选用能与探针选用能与 目标蛋白特异目标蛋白特异 性结合的性结合的DNA DNA 片段片段 3. 3. 外源基因产物检测外源基
63、因产物检测(1)(1)蛋白质生物功能测定法蛋白质生物功能测定法杂交释放转译杂交释放转译鉴定：鉴定： 合合并并 变变性性 挂挂柱柱 制制备备 上上样样 淋淋洗洗 洗洗脱脱 翻翻译译 测测活活 重组重组DNADNA 单链单链DNADNA mRNAmRNA 杂交的杂交的mDNAmDNA 蛋白质蛋白质 蛋白质蛋白质 无细胞体外翻译系统：无细胞体外翻译系统：麦胚提取物、网织红细胞提取物麦胚提取物、网织红细胞提取物 3.3.外源基因产物检测外源基因产物检测(2)(2)蛋白质生物结构鉴定法蛋白质生物结构鉴定法放射免疫原位杂交放射免疫原位杂交鉴定：鉴定： 影印影印用固定了特异性抗体的用固定了特异性抗体的聚乙烯
64、薄膜聚乙烯薄膜影印影印洗涤洗涤与与II125125标记的标记的IgGIgG保温保温感光感光轻轻漂洗影印薄膜，干燥固定轻轻漂洗影印薄膜，干燥固定 与与II125125标记的标记的IgGIgG保温保温洗涤、干燥、感光洗涤、干燥、感光 用用氯仿蒸汽氯仿蒸汽或或烈性噬菌体喷洒烈性噬菌体喷洒克隆平板克隆平板 含抗体的聚乙烯膜 裂解平板裂解平板 3.3.外源基因产物检测外源基因产物检测(2) (2) 蛋白质生物结构鉴定法蛋白质生物结构鉴定法免疫沉淀免疫沉淀鉴定：鉴定： 在琼脂培养基中加入目标蛋白的特异性抗体在琼脂培养基中加入目标蛋白的特异性抗体 然后涂布转化液然后涂布转化液 3737 培养培养 经培养后，目的重组子菌落变会分泌出目标经培养后，目的重组子菌落变会分泌出目标 蛋白，后者与特异性抗体发生免疫沉淀蛋白，后者与特异性抗体发生免疫沉淀 反应，在菌落周围形成白色的圆斑反应，在菌落周围形成白色的圆斑 此法简便快速，但灵敏度低，抗体消耗量大此法简便快速，但灵敏度低，抗体消耗量大 3. 3. 外源基因产物检测外源基因产物检测(3) (3) 聚丙烯酰胺凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法如果待筛选鉴定的目标蛋白既不如果待筛选鉴定的目标蛋白既不能测定生物活性，又无现成的抗能测定生物活性，又无现成的抗体使用，则可采用体使用，则可采用聚丙烯酰胺凝聚丙烯酰胺凝胶电泳进行粗略的筛选胶电泳进行粗略的筛选
