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1、5、利用EST数据库发现新基因EST (expressed sequence tags),是从基因表达的短的序列，携带着完整基因某些片断的信息，称为表达序列标签获得一个EST的途径有三种：1 大规模测序；2 比较同源性；3 差异显示或基因芯片法获得与某一性状相关的EST电脑克隆 第一步，找到与待克隆基因相关的EST；第二步 计算机拼接、比较；第三步 检测潜在的可读框ORF确定是否为全长16. SAGEExpressionLevelExpressionLevelGene ProductsGene ProductsQuantify Tags and DeterminePatterns of Gen
2、e ExpressionLink tags together and sequenceIsolate SAGE tagsAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAASample ASample BSerial analysis of gene expression2SAGE37.7.基因芯片（基因芯片（gene chipgene chip）技术）技术生物芯片（生物芯片（BiochipBiochip）: :是指通过机器人是指通过机器人自动印迹或引导光化学合成自动印迹或引导光化学合成技技术在术在硅片、玻璃、凝胶或尼龙膜上硅片、玻璃、凝胶或尼龙膜上制造的生物制造的
3、生物分子微列阵分子微列阵，根据分子间的特异，根据分子间的特异性相互作用的原理，将生命科学领域中性相互作用的原理，将生命科学领域中不连续的分析过程集成于芯片表面不连续的分析过程集成于芯片表面，以，以实现对细胞、蛋白、基因及其他生物组份的准确、快速、大信息量的检测。实现对细胞、蛋白、基因及其他生物组份的准确、快速、大信息量的检测。基因芯片（基因芯片（Gene chip, DNA chip, or DNA microarryGene chip, DNA chip, or DNA microarry）：）：生物芯片的一种。它是将生物芯片的一种。它是将DNADNA分子固定于支持物上，并与标记的样品杂交，
4、分子固定于支持物上，并与标记的样品杂交，通过自动化仪器检测杂交信号的强度来判断样品中靶分子的数量，进而得知样通过自动化仪器检测杂交信号的强度来判断样品中靶分子的数量，进而得知样品中品中mRNAmRNA的表达量，也可进行基因突变体的检测和基因序列的测定，为进的表达量，也可进行基因突变体的检测和基因序列的测定，为进一步了解基因间的相互关系及基因克隆提供有用的工具一步了解基因间的相互关系及基因克隆提供有用的工具基本概念基本概念GeneChipGeneChip将将探探针针固固定定在在特特定定的的固固体体基基质质上上，而而原原来来印印记记在在膜膜上上的的目目标标DNADNA或或RNARNA进行标记，然后
5、进行的大规模的杂交。进行标记，然后进行的大规模的杂交。4Affymetrix的原位合成技术可制作的点阵密度高达1061010/cm2。5Cy3和和Cy5Cy3Cy3激发波长激发波长532nm532nmCy5Cy5激发波长激发波长635nm635nm6表达谱芯片实验流程表达谱芯片实验流程1.Samples2.mRNA Extraction and Reverse Transcription3.Fluorescent Labeling of cDNAs4.Hybridization to a DNA Microarray5.Scanning the Hybridized Array6.Interp
6、reting the Scanned Image7Liu et al., JXB, 200988. RNA-seq 技术9Xu et al., BMC Genomics, 2009109. 酵母双杂交技术酵母双杂交技术(Yeast Two-hybrid System)1 1、酵母双元杂交系统的应用、酵母双元杂交系统的应用 验证传统方法检测的相互作用的蛋白验证传统方法检测的相互作用的蛋白 蛋白的功能作图蛋白的功能作图 功能域功能域 / /氨基酸氨基酸 鉴别新的相互作用蛋白鉴别新的相互作用蛋白 (from a cDNA library)(from a cDNA library)11 Gal4 pr
7、otein comprises DNA binding domains(BD) and activating domains (AD) Binding domain interact with promoter Activating domain with transcription machineryGal4双元系统双元系统原理原理12背景知识背景知识13酵母双杂交技术原理示意图酵母双杂交技术原理示意图14Yeast two-hybrid system 实例Wu et al. Cell. 2006, 125: 1347-136015BiFC ： 双分子荧光双分子荧光互补互补bimolecul
8、ar fluorescence complementation20022002年年，HuHu等等报报道道的的一一种种直直观观、快快速速地地判判断断目目标标蛋蛋白白在在活活细细胞胞中中的的定定位位和相互作用的新技术和相互作用的新技术BiFCBiFC技技术术原原理理将将荧荧光光蛋蛋白白在在某某些些特特定定的的位位点点切切开开，形形成成不不发发荧荧光光的的N N和和CC端端2 2个多肽，称为个多肽，称为N N片段片段(N-fragment)(N-fragment)和和CC片段片段(C-fragment)(C-fragment)。当当这这2 2个个荧荧光光蛋蛋白白的的片片段段分分别别连连接接到到1 1
9、组组有有相相互互作作用用的的目目标标蛋蛋白白上上，在在细细胞胞内内共共表表达达或或体体外外混混合合这这2 2个个融融合合蛋蛋白白时时，由由于于目目标标蛋蛋白白质质的的相相互互作作用用，荧荧光光蛋蛋白白的的2 2个个片片段段在在空空间间上上互互相相靠靠近近互互补补，重重新新组组装装成成完完整整的发光蛋白。的发光蛋白。16Yuan et al. Plant Cell 2010,22:3164-317617免免疫疫共共沉沉淀淀（co-immunoprecipitation）优点优点：（1）相相互互作作用用的的蛋蛋白白质质都都是是经经翻翻译译后后修修饰饰的，处于天然状态；的，处于天然状态； （2）蛋蛋
10、白白的的相相互互作作用用是是在在自自然然状状态态下下进进行行的，可以避免人为的影响；的，可以避免人为的影响； （3）可可以以分分离离得得到到天天然然状状态态的的相相互互作作用用蛋蛋白复合物。白复合物。缺点缺点：（1）可可能能检检测测不不到到低低亲亲和和力力和和瞬瞬间间的的蛋蛋白白质蛋白质相互作用；质蛋白质相互作用； （2）两两种种蛋蛋白白质质的的结结合合可可能能不不是是直直接接结结合合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；而可能有第三者在中间起桥梁作用； （3）必必须须在在实实验验前前预预测测目目的的蛋蛋白白是是什什么么，以以选选择择最最后后检检测测的的抗抗体体，所所以以，若若预预测测不不正正确确
11、，实实验验就就得得不不到到结结果果，方方法法本本身身具具有有冒险性。冒险性。18HIS3：筛选标记酵母单杂交技术酵母单杂交技术Li等（1993）从酵母双杂交技术发展而来，研究DNA和蛋白质互作。19ChIP: Chromatin immuno precipitation主要实验流程：在活细胞状态下固定蛋白质DNADNA复合物，并通过超声或酶处理将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过抗原抗体的特异性识别反应沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNADNA片段，通过对目的片段的纯化与检测，获得蛋白质与DNADNA相互作用的信息。染色质免疫共沉淀染色质免疫共沉淀2021思考题什么是基因工程？ 对社会和科学技术发展有什么重要意义？限制性内切酶有哪几类？什么是回文结构？常见载体？报告基因？蓝白斑筛选？基因克隆的常用策略及原理？果树上使用的有哪些方法？什么是细菌感受态？转化？转染？酵母双杂交？22主要参考资料l基因 VIIIl基因操作原理 孙明 华中农业大学l植物基因工程 王关林 方宏均 科学出版社 2002lMolecular Cloning 分子克隆实验指南（E3,2001）lPrinciples of Gene Manipulation(S Primrose, R Twyman, Blackwell scientific publication)23
