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1、泛素化蛋白修饰泛素化蛋白修饰 Protein Modification by Ubiquitination北京协和医学院研究生课程：细胞信息与调控北京协和医学院研究生课程：细胞信息与调控2010年年10月月13日日The Central Dogma （Revised)DNARNAProteinBreakdownModification & DegradationE1-E1E2-E2底物底物E3ATPAMP+PPiUbUbUb蛋白酶体蛋白酶体泛素蛋白酶体通路泛素蛋白酶体通路Ub: 泛素泛素 (Ubiquitin)，一高度保守的，由，一高度保守的，由76个氨基酸组成的多肽。个氨基酸组成的多肽。E1
2、: 泛素激活酶泛素激活酶 (Ubiquitin-activating enzyme)，人类仅有，人类仅有2种种E1。E2: 泛素载体蛋白泛素载体蛋白 (Ubiquitin-carrier protein)， 人类约有人类约有 30 种种E2s。E3: 泛素蛋白连接酶泛素蛋白连接酶 (Ubiquitin-protein ligase)， 人类有人类有500多种多种E3s 。9 泛素化泛素化(ubiquitination)即蛋白质被泛素即蛋白质被泛素(ubiquitin，由，由76个氨基酸组成的多肽）共价修个氨基酸组成的多肽）共价修饰的过程，在几乎所有的真核细胞活动中起着饰的过程，在几乎所有的真核
3、细胞活动中起着关键作用。泛素关键作用。泛素 蛋白酶体蛋白酶体(proteasome)通路通路则是真核细胞内最主要的蛋白质则是真核细胞内最主要的蛋白质降解降解途径。泛途径。泛素化调控的细胞活动至少包括素化调控的细胞活动至少包括: 细胞周期细胞周期（Cell cycle progression）细胞凋亡细胞凋亡（Apoptosis）转录调控转录调控（Transcriptional regulation）DNA修复修复（DNA repair）免疫应答免疫应答（Immune response）蛋白质降解及质量控制蛋白质降解及质量控制（Protein degradation and quality co
4、ntrol )2The Nobel Prize in Chemistry 2004 for the discovery of ubiquitin-mediated proteolysis Aaron Ciechanover Avram Hershko Irwin Rose 阿龙阿龙.西查诺瓦西查诺瓦 阿夫拉姆阿夫拉姆.赫希科赫希科 欧文欧文.罗斯罗斯 3近年与泛素蛋白酶体相关的近年与泛素蛋白酶体相关的PubMed论文论文数在持续增长数在持续增长4Ub/ProteasomeCyclinHistonemiRNA篇数篇数年份年份本专题内容本专题内容1. 泛素蛋白酶体通路的组成及重要性泛素蛋白酶体通路
5、的组成及重要性2. 泛素化与泛素化酶泛素化与泛素化酶3. 去泛素化酶去泛素化酶4. 泛素化异常与人类重大疾病的发生泛素化异常与人类重大疾病的发生5. 蛋白酶体构成蛋白酶体构成6. 蛋白酶体抑制剂与药物蛋白酶体抑制剂与药物7. 调节蛋白酶体活性的新机制调节蛋白酶体活性的新机制8. 类泛素蛋白（类泛素蛋白（SUMO, NEDD8, ISG15, APG8, APG12， PUP等）等）5中国协和医科大学出版社，中国协和医科大学出版社， 2008年年 泛素介导的蛋白质降解泛素介导的蛋白质降解Ubiquitin-Mediated Proteolysis主编：邱小波主编：邱小波 王琛王琛 王琳芳王琳芳参
6、考书参考书陈竺和诺贝尔奖得主陈竺和诺贝尔奖得主Aaron Ciechanover作序作序蛋白质泛素化研究简史蛋白质泛素化研究简史1975年，年，Goldstein误将泛素（误将泛素（Ubiquitin)当作胸腺激素而发现。当作胸腺激素而发现。 1977年，年，Goldknopf和和Busch认定组蛋白认定组蛋白2A与泛素以异肽键（与泛素以异肽键（Isopeptide Bond）结合。）结合。 1977年，年，Goldberg证明人类细胞中存在一可溶的，直接依赖于能量的非溶证明人类细胞中存在一可溶的，直接依赖于能量的非溶 酶体类蛋白酶酶体类蛋白酶 。1978年，年，Ciechanover 和和
7、Hershko发现了发现了APF-1是是Goldberg系统中蛋白酶系统中蛋白酶 系的必要成分，结果发表在系的必要成分，结果发表在BBRC。1980年，年，Ciechanover，Hershko和和Rose等人证明了等人证明了APF-1与当时已被发与当时已被发 现的泛素是同一物质现的泛素是同一物质 。1984年，年，Finley和和Varshavsky等发现泛素在细胞周期中的重要性。等发现泛素在细胞周期中的重要性。 1987年，年，Goldberg和和Rechsteiner两个小组几乎同时分离出分子量很大的两个小组几乎同时分离出分子量很大的 依赖于依赖于ATP并降解泛素化底物的蛋白水解酶。并降
8、解泛素化底物的蛋白水解酶。1988年，年，Goldberg将这种蛋白水解酶命名为将这种蛋白水解酶命名为Proteasome（蛋白酶体）。（蛋白酶体）。1997年，年，Yeh 等小组发现类泛素蛋白等小组发现类泛素蛋白SUMO和和NEDD8的功能。的功能。2003年，美国年，美国FDA批准了用批准了用Velcade来治疗多发性骨髓瘤；来治疗多发性骨髓瘤； Velcade 是是 在在Goldberg发明的蛋白酶体抑制剂发明的蛋白酶体抑制剂MG132的基础上研发而成的。的基础上研发而成的。2004年，年，Ciechanover，Hershko和和Rose因发现泛素介导的蛋白质降解共因发现泛素介导的蛋白
9、质降解共 同获得诺贝尔化学奖。同获得诺贝尔化学奖。2008年，年，Darwin等在细菌中发现类泛素化修饰。等在细菌中发现类泛素化修饰。7Figure 8-34 Ubiquitin (泛素）泛素）泛素由泛素由76个氨基酸残基组成，其中包括个氨基酸残基组成，其中包括7个赖氨酸残基个赖氨酸残基(K), 其其C末端可与末端可与底物的赖氨酸残基形成异肽键，从而引起底物泛素化。泛素的底物的赖氨酸残基形成异肽键，从而引起底物泛素化。泛素的K11、K29、K48和和K63均能参与形成泛素与泛素间的异肽键均能参与形成泛素与泛素间的异肽键 (Isopeptide bond)。10E1与与ATP结合后，催化泛素羧基
10、末端结合后，催化泛素羧基末端腺嘌呤化，同时释放无机焦磷酸腺嘌呤化，同时释放无机焦磷酸（PPi）。）。E1活化位点的半胱氨酸硫活化位点的半胱氨酸硫醇激活泛素腺嘌呤核苷酸中间产物上醇激活泛素腺嘌呤核苷酸中间产物上的羧基，形成一个的羧基，形成一个泛素硫酯键泛素硫酯键。E2激活的重要条件是位于激活的重要条件是位于UBC结构结构域的一个保守半胱氨酸催化位点与泛域的一个保守半胱氨酸催化位点与泛素羧基端形成一个素羧基端形成一个硫酯键硫酯键。E3催化催化被被E2活化的泛素活化的泛素C-端甘氨酸端甘氨酸与底物或下一个泛素的赖氨酸间形成与底物或下一个泛素的赖氨酸间形成泛素泛素异肽键异肽键 (Isopeptide
11、bond)。11调节蛋白质内吞，修饰和转录调节蛋白质内吞，修饰和转录靶蛋白必须经多聚泛素靶蛋白必须经多聚泛素(多于多于4个泛个泛素分子素分子)修饰才能被蛋白酶体识别修饰才能被蛋白酶体识别与降解。与降解。泛素化模式（泛素化模式（Ubiquitination Modes）调节蛋白质的活性和定位调节蛋白质的活性和定位K48 polyubiquitylationK63 polyubiquitylationMonoubiquitylationMultiple monoubiquitylation12 a. RING finger domain（SCF复合体，复合体，APC， MDM2， Parkin,
12、和和c-Cb1） b. U-box domain（CHIP) c. HECT domain（能与底物形成硫酯键能与底物形成硫酯键) d. N-End Rule E3的种类的种类13E3泛素连接酶以单体和复合体两种形式存在泛素连接酶以单体和复合体两种形式存在14Amerik and Hochstrasser, 2004去泛素化作用去泛素化作用 （Deubiquitination）15泛素泛素-C-末端水解酶末端水解酶 ，通常参与蛋白降解后泛素分子的再利，通常参与蛋白降解后泛素分子的再利用及对多聚泛素链的修饰，也参与由泛素前体产生泛素单用及对多聚泛素链的修饰，也参与由泛素前体产生泛素单体的过程（如
13、体的过程（如UCH37UCH37、UCH-L1)UCH-L1)。泛素特异性蛋白酶泛素特异性蛋白酶 ，参与去除蛋白质上的多聚泛素链，也，参与去除蛋白质上的多聚泛素链，也可从短泛素链的末端去掉单个泛素（如可从短泛素链的末端去掉单个泛素（如USP8)USP8)。去泛素化酶属半胱氨酸蛋白酶，目前已发现去泛素化酶属半胱氨酸蛋白酶，目前已发现9090多种。多种。去泛素化酶可分为两类：去泛素化酶可分为两类：去泛素化酶去泛素化酶(Deubiquitinating enzyme)16泛素化途径的异常与人类重大疾病泛素化途径的异常与人类重大疾病神经退行性疾病（如神经退行性疾病（如帕金森氏症）：帕金森氏症）：Par
14、kin, UCH-L1癌症癌症: BRCA1, CYLD, Mdm2, Nrdp1, pVHL 传染病病原体的入侵、致病机制传染病病原体的入侵、致病机制: E6-AP17泛素连接酶泛素连接酶Parkin的失活与帕金森氏症（的失活与帕金森氏症（AR-JP)Current Opinion in Neurobiology 2004, 14:38438918Current Opinion in Neurobiology 2004, 14:384389Parkin Substrates19UCH-L1为一为一去泛素化酶，去泛素化酶，它在它在帕金森氏症帕金森氏症病人中的突变病人中的突变可能导致其酶活性的丧
15、失，减少了泛素自由单体的供应及可能导致其酶活性的丧失，减少了泛素自由单体的供应及底物蛋白的降解，进而导致黑质病变。底物蛋白的降解，进而导致黑质病变。帕金森氏症中的去泛素化帕金森氏症中的去泛素化20失调蛋白失调蛋白 底物底物 修饰修饰 肿瘤类别肿瘤类别SKP2 p27 (KIP) Polyubiquitylation Malignant melanomaMDM2 p53 Polyubiquitylation Non-small-cell lung cancer, soft-tissue carcinoma, colorectal cancer HAUSP p53, MDM2 De-ubiquit
16、ylation Non-small-cell lung cancer lymphoma APC Cyclin B, Polyubiquitylation Colorectal cancer securin FANCL FANCD2 Monoubiquitylation Fanconi anaemia-related cancers CYLD IKK De-ubiquitylation Cylindromatosis IAP2 BCL10 Polyubiquitylation MALT lymphomas CBL RTKs Multiple Lymphoma, AML and monoubiqu
17、itylation gastric carcinoma pVHL HIFPolyubiquitinationvon Hippel-Lindau disease泛素化失调与肿瘤泛素化失调与肿瘤21 1 394 470 684 956 N末端末端C末端末端 TRAF2结合位点结合位点 CYLD具有具有TRAF2（TNF-receptor-associated factor 2，为为 I B 的泛素连接酶的泛素连接酶) ) 结合位点，可促进结合位点，可促进 I B 的去泛素化。的去泛素化。去泛素化酶去泛素化酶CYLD的突变与的突变与圆柱瘤圆柱瘤CylindromatosCylindromatos的发
18、生相关的发生相关22CYLD促进促进IB的去泛素化，的去泛素化，从而抑制从而抑制NF-B的活性的活性23N ENGL J MED 2004, 350:187-188圆柱瘤圆柱瘤CylindromatosCylindromatos也称也称 “头帕肿瘤综合症头帕肿瘤综合症”(turban (turban tumour syndrome),tumour syndrome), 其患者细其患者细胞胞CYLD的两个等位基因都发的两个等位基因都发生了突变，结果使患者细胞中生了突变，结果使患者细胞中CYLD丧失功能，导致核转录丧失功能，导致核转录因子因子NF-B的过度活化；启动的过度活化；启动基因的转录，导致
19、细胞的过度基因的转录，导致细胞的过度增殖增殖24泛素连接酶泛素连接酶Mdm2和和E6-AP与与p53的降解和癌症的降解和癌症25Ubiquitination occurs on histones H1, H2A, H2B and H3. This modification on different histones plays distinct roles in regulation of chromatin structures, and hence gene expression and genome stabilityUbiquitination and transcriptional
20、regulationUbiquitination of histone H2A and H2B has opposite effects on transcription. Ubiquitination of H2B is associated with gene activation, while H2A ubiquitination contributes to gene silencingWang et al., NATURE |VOL 431 | 14 OCTOBER 2004Lee et al., Cell 131, 10841096, 2007Histone Crosstalk b
21、etween H2B Mono-ubiquitination and H3 Methylation Mediated by COMPASSCps35 Is Required for Translating Histone Crosstalk between H2B Monoubiquitination and H3 Methylation by COMPASS1.Nrdp1 是一新的含有是一新的含有RING finger 结构域的泛素连接酶结构域的泛素连接酶 。RING FingerSubstrate-Binding RegionNrdp1 是一促进是一促进ErbB3及及BRUCE泛素化泛素化
22、和降解的泛素连接酶和降解的泛素连接酶2. ErbB3 是表皮生长因子受体家族是表皮生长因子受体家族 (EGFR family)成员之一，成员之一， 在生长，发育及细胞存活中起着关键的作用。该家族与许多在生长，发育及细胞存活中起着关键的作用。该家族与许多 肿瘤密切相关，已成为癌症治疗的重要标靶之一。肿瘤密切相关，已成为癌症治疗的重要标靶之一。3. BRUCE/Apollon 是一含有是一含有BIR domain（凋亡抑制蛋白的标志性结构域）（凋亡抑制蛋白的标志性结构域）和和E2 domain 的巨型的巨型 (530 kDa) 膜蛋白膜蛋白BIR domainE2 (ubiquitin-carri
23、er) domain26Nrdp1促进细胞凋亡并可能与癌症和帕金森氏症相关促进细胞凋亡并可能与癌症和帕金森氏症相关Nrdp1ApoptoticStimuliPI3 kinasePI3 kinaseAKT/PKBAKT/PKBIKK IKK ErbB3I- I- B PB PNF- B BactivationApoptosisApoptosis Caspase-3/7Pro-casp-9Caspase-9Other IAPs(e.g., c-IAP1)SmacSmacprecursorParkinBRUCE?p53Sperm Differentiation NIP 1. Qiu* & Goldb
24、erg* (2002), PNAS2. Qiu* et al. (2004), EMBO J3. Qiu* & Goldberg* (2005), J. Biol. Chem. 4. Liu, Qiu* et al. Manuscript in preparation27促进促进抑制抑制本专题内容本专题内容1. 泛素蛋白酶体通路的组成及重要性泛素蛋白酶体通路的组成及重要性2. 泛素化与泛素化酶泛素化与泛素化酶3. 去泛素化酶去泛素化酶4. 泛素化异常与人类重大疾病的发生泛素化异常与人类重大疾病的发生5. 蛋白酶体构成蛋白酶体构成6. 蛋白酶体抑制剂与药物蛋白酶体抑制剂与药物7. 调节蛋白酶体活
25、性的新机制调节蛋白酶体活性的新机制8. 类泛素蛋白类泛素蛋白28The Biochemical Roles of Protein Degradation in a Cell1. 溶酶体溶酶体 (Lysosomes)Non-selective Hydrolyze proteins from autophagy Digest proteins from endocytosis Membrane proteins Extracellular proteins 2. 泛素泛素-蛋白酶体通路蛋白酶体通路Selective and (Ubiquitin-Proteasome Pathway)ATP-Dep
26、endent Regulate biochemical reactions Discard unnecessary proteins Degrade damaged or misfolded proteins Present internalized antigens in immunological responses29 20S 催化颗粒催化颗粒 19S调节颗粒调节颗粒19S10 nm电镜下的电镜下的26S蛋白酶体蛋白酶体(Proteasome)Yifan Cheng, Xiao-Bo Qiu et al., unpublished data3026S 蛋白酶体的亚基组成蛋白酶体的亚基组成
27、3132免疫蛋白酶体免疫蛋白酶体(Immunoproteasome)负责抗原提呈负责抗原提呈(Antigen Presentation)免疫蛋白酶体的免疫蛋白酶体的催化颗粒催化颗粒(20S) 有三个特殊亚单位有三个特殊亚单位LMP2、LMP7 和和MECL-1。其。其调节颗粒调节颗粒为为PA28（11S）。）。20S颗粒颗粒33MHC class I antigen presentation pathwayT cellPeptideMHC class IProtein antigenProteasome+/- UbiquitinPeptides (2-24 a.a.)TAP (8-16 a.a
28、.)Endoplasmic ReticulumCD8+Golgi8-10 a.a.Amino acidsERAP13435The proteasome inhibitor, Velcade (Botezomib/PS-341), has been approved by FDA to treat multiple myeloma and mantle cell lymphoma .36中药雷公藤中的抗癌活性成分中药雷公藤中的抗癌活性成分雷公藤红素雷公藤红素Celastrol是一种是一种蛋白酶体抑制剂蛋白酶体抑制剂，它能通过控制癌细胞的蛋白，它能通过控制癌细胞的蛋白酶体活性进而诱发癌细胞凋亡。酶
29、体活性进而诱发癌细胞凋亡。 Yang, H. et al., Cancer Res. (2006) 371、 蛋白酶体亚单位蛋白酶体亚单位hRpn13能激活存在于蛋白酶能激活存在于蛋白酶 体的去泛素化酶体的去泛素化酶UCH37。2、 c-Abl通过引起蛋白酶体磷酸化而抑制其活性。通过引起蛋白酶体磷酸化而抑制其活性。蛋白酶体的调控蛋白酶体的调控38hRpn13能激活去泛素化酶能激活去泛素化酶UCH37control+hRpn13S5a+hRpn13+Ub-HQiu, X.B. * et al., EMBO J. （2006） 25:5742-5753. 39其它研究表明其它研究表明Rpn13可作
30、为泛素受体而可作为泛素受体而结合于泛素链的近端结合于泛素链的近端Husnjak et al. Nature 453:481, 2008Schrener et al. Nature 453:548, 200841c-Abl通过引起蛋白酶体磷酸化而抑制其活性通过引起蛋白酶体磷酸化而抑制其活性Liu, X., Huang, W., Li., C., Li, P., Yuan, J., Li, X., Qiu, X.B., Ma, Q., and Cao, C.(2006). Molecular Cell. 22, 317-327. 42The 26S proteasome is a multisub
31、unit complex, consisting of the 20S catalytic particle and the 19S regulatory particle, and selectively degrades ubiquitinated proteins in the presence of ATP. Proteasomes are responsible for degradation of most cellular proteins, while lysosomes degrade extracellular proteins and most membrane prot
32、eins.Upon immune responses, cells generate special types of proteasomes, immunoproteasomes, which possess distinct regulatory particle (11S ) and catalytic particle (with different catalytic subunits), for more efficient antigen presentation. Proteasomes are responsible for degradation of most cellu
33、lar proteins本专题内容本专题内容1. 泛素蛋白酶体通路的组成及重要性泛素蛋白酶体通路的组成及重要性2. 泛素化与泛素化酶泛素化与泛素化酶3. 去泛素化酶去泛素化酶4. 泛素化异常与人类重大疾病的发生泛素化异常与人类重大疾病的发生5. 蛋白酶体构成蛋白酶体构成6. 蛋白酶体抑制剂与药物蛋白酶体抑制剂与药物7. 调节蛋白酶体活性的新机制调节蛋白酶体活性的新机制8. 类泛素蛋白（类泛素蛋白（SUMO, NEDD8, ISG15, ATG8, PUP等）等）43类泛素蛋白及其同源性类泛素蛋白及其同源性44Ubiquitin-Like Protein Involved in the Prot
34、easome Pathway of Mycobacterium tuberculosis Pearce et al. (2008) Science 322:1104PUP-conjugation is found remarkably in mycobacteria and allied actinobacterias, and is sporadically present in other lineages, such as verrucomicrobia, nitrospirae, deltaproteobacteria and planctomycetes.Iyer et al. (2
35、008 ) Biology Direct, 3:45Protein modification by ubiquitin-like protein, PUP, in prokaryotesPUP is predicted to encode a 64amino acid protein with a molecular size of 6.9 kD类泛素蛋白的结构高度相似类泛素蛋白的结构高度相似UbiquitinISG15SumoNEDD845Activating enzyme complex has two subunitsAOS1 is similar to the N-terminal h
36、alf of Ub E1UBA2 is homologous to the C-terminal half of Ub E1 and contains the cysteine necessary for linkage with SUMOConjugating enzyme: UBC9SUMO (Small ubiquitin-like modifier) 101 amino acids46SUMO修饰的功能修饰的功能47SUMO化修饰的底物化修饰的底物48Desumoylating enzymesUlp1Has both isopeptidase and C-terminal hydrol
37、ase activityRequired for G2/M transitionSumo C-terminal hydrolases, e.g. SENP149Nedd8 (neural precursor cell-expressed developmentally downregulated) -81 residuesActivating enzyme complex (2 subunits) -APP-BP1 and UBA3The APP-BP1 N-terminal half is homologous to the N-terminal half of ubiquitin E1UB
38、A3 is homologous to the C-terminal half of ubiquitin E1 and contains the cysteine required for thiol ester linkage with Nedd8Conjugating enzyme: UBC1250Function of NeddylationSubstrates (SCF components)Cdc53 in yeastCullin family members in humans51Crystal structure52Deneddylation: COP9 Signalosome
39、(CSN)500 kDa protein complex8 distinct subunitsCSN5/Jab1 is catalytic component of isopeptidaseHomology to subunits of the proteasome (CSN5=RPN11)53Other NEDD8-specific hydrolases and isopeptidasesUCH-L3 has NEDD8 C-terminal hydrolase activityUSP21 deconjugates ubiquitin and deneddylates from NEDD8
40、conjugates54ISG15 (Interferon-stimulated gene 15)Induced by interferon, lipopolysaccharides, or upon viral infectionsE1 (ISG15 activating enzyme)UBP43, ISG15-specific isopeptidase Modified proteins: JAK-STAT proteins55Aut7/Apg8/ATG8 in AutophagyAut7 /Apg8 is necessary for formation of membrane struc
41、tures in autophagosomesSubstrate: Phosphatidylethanolamine(a phospholipid)56Aut7/Apg8/ATG8 and Apg12/ATG12 in AutophagyAut7=Apg857 Deregulated Substrate Modification Tumour type/disease SENP1 De-sumoylation Infantile teratoma, thyroid oncocytic adenoma SUMO RB Sumoylation Retinoblastoma tumour p14AR
42、F Sumoylation Melanoma SUMO1 Sumoylation Anaplastic large-cell lymphoma SUMO2, UBA2 Sumoylation Hepatocellular carcinoma UBC9 BCL2 Sumoylation Ovarian tumour NEDD8 Neddylation Prostate malignancy FAT10 Fatylation Hepatocellular carcinoma, stomach, intestinal, colorectal, uterine, cervical and ovaria
43、n cancer UBE1L ISGylation Acute promyelocytic leukemia, lung tumour ISG15 ISGylation Melanoma ISG15 ISGylation Adult T-cell leukemia, bladder, breast, colorectal, ovarian and prostate cancer UBP43 De-ISGylation AML _Aberrant signaling of ubiquitin-like proteins and cancer Hoeller et al., 6, 776-788 (2006)58小结小结Wechman et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 6,599-609 (2005)59课外作业题课外作业题简述泛素化的主要生物化学特点，并说明它简述泛素化的主要生物化学特点，并说明它在细胞活动中的作用。在细胞活动中的作用。简述蛋白酶体的组成及其与其它蛋白酶的主简述蛋白酶体的组成及其与其它蛋白酶的主要差别。要差别。简单介绍类泛素蛋白的种类及其主要功能。简单介绍类泛素蛋白的种类及其主要功能。60
