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1、狂犬病疫苗、治疗抗体及其诊断狂犬病疫苗、治疗抗体及其诊断武汉生物制品研究所武汉生物制品研究所孟胜利孟胜利一、狂犬病毒病原学一、狂犬病毒病原学二、狂犬病疫苗、抗体的应用二、狂犬病疫苗、抗体的应用三、狂犬病抗原抗体的诊断三、狂犬病抗原抗体的诊断狂犬病狂犬病:现状现状我国狂犬病近年来发我国狂犬病近年来发病人数逐年递增，据病人数逐年递增，据统计我国统计我国20032003年狂犬年狂犬病病死人数达病病死人数达20372037人，人，是是1010年来最高峰，截年来最高峰，截至今年至今年1212月，全国狂月，全国狂犬病死亡人数已超过犬病死亡人数已超过30003000人。人。中国中国狂犬病死亡数连续狂犬病死亡
2、数连续6年明显回升年明显回升人群中特别是少年儿人群中特别是少年儿童易受宠物的攻击，童易受宠物的攻击，且头面部咬伤居多，且头面部咬伤居多，0 01919岁者占发病人岁者占发病人数的数的4040。狂犬病患者狂犬病患者狂犬病患者狂犬病患者中典型中典型中典型中典型三恐三恐三恐三恐（恐风、恐（恐风、恐（恐风、恐（恐风、恐水、恐光）水、恐光）水、恐光）水、恐光）病症占病症占病症占病症占60606060。另有另有另有另有40%40%40%40%为为为为不典型症状。不典型症状。不典型症状。不典型症状。狂狂犬犬病病的的传传染染源源甲醛、乙醚、升汞、过氧甲醛、乙醚、升汞、过氧化氢、高锰酸钾和季胺类化氢、高锰酸钾和
3、季胺类化合物（如本扎溴铵）等化合物（如本扎溴铵）等化学药品对狂犬病毒都有化学药品对狂犬病毒都有杀伤作用。杀伤作用。1%1%甲醛或甲醛或3%3%来苏尔来苏尔1515分钟分钟可使病毒灭活。可使病毒灭活。20%20%乙醚、乙醚、10%10%氯仿、氯仿、75%75%酒酒精、精、5%5%碘酊和碘酊和0.1%0.1%胰蛋白胰蛋白酶等也可使病毒灭活。酶等也可使病毒灭活。 狂犬病毒理化特性狂犬病毒理化特性狂狂狂狂犬犬犬犬病病病病毒毒毒毒对对对对温温温温度度度度的的的的抵抵抵抵抗抗抗抗力力力力很很很很弱弱弱弱，在在在在高高高高温温温温下下下下很很很很不不不不稳稳稳稳定定定定。病病病病毒毒毒毒悬悬悬悬液液液液56
4、565656。C C C C，30303030分分分分钟钟钟钟或或或或60606060。C C C C，10101010分分分分钟钟钟钟即即即即可可可可灭灭灭灭活活活活。煮煮煮煮沸沸沸沸2 2 2 2分分分分钟钟钟钟，病病病病毒毒毒毒全全全全部部部部死死死死亡亡亡亡。但但但但是是是是保保保保留留留留在在在在机机机机体体体体组组组组织织织织内内内内的的的的病病病病毒毒毒毒加加加加温温温温灭灭灭灭活活活活的的的的时时时时间要延长些。间要延长些。间要延长些。间要延长些。含含含含有有有有狂狂狂狂犬犬犬犬病病病病毒毒毒毒的的的的脑脑脑脑组组组组织织织织在在在在常常常常温温温温下下下下可可可可保保保保存存
5、存存活活活活力力力力7-107-107-107-10天天天天，在在在在日日日日光光光光和和和和紫紫紫紫外外外外线线线线照照照照射射射射下下下下，或或或或强强强强酸酸酸酸、强碱的环境下，病毒灭活的时间会缩短。强碱的环境下，病毒灭活的时间会缩短。强碱的环境下，病毒灭活的时间会缩短。强碱的环境下，病毒灭活的时间会缩短。狂狂狂狂犬犬犬犬病病病病毒毒毒毒在在在在Ph7.4-8.0Ph7.4-8.0Ph7.4-8.0Ph7.4-8.0较较较较为为为为稳稳稳稳定定定定，若若若若pHpHpHpH超超超超过过过过7-7-7-7-9 9 9 9的范围，则病毒易灭活。的范围，则病毒易灭活。的范围，则病毒易灭活。的范
6、围，则病毒易灭活。狂犬病毒的感染特点狂犬病毒的感染特点 狂狂犬犬病病毒毒一一般般是是通通过过破破损损的的皮皮肤肤或或黏黏膜膜进进入入人人体体的的。狂狂犬犬病病毒毒在在体体内内典典型型的的感感染染过过程程是是由由唾唾液液中中带带有有狂狂犬犬病病毒毒的的疯疯动动物物咬咬伤伤，使使病病毒毒从从伤伤口口侵侵入入机机体体内内。在在侵侵入入部部位位一一般般不不增增生生，也也不不侵侵入入血血液液，故故无无病病毒毒血血症症。狂狂犬犬病病毒毒从从侵侵入入局局部部进进入入周周围围神神经经组组织织内内，沿沿着着神神经经向向心心传传递递至至中中枢枢神神经经系系统统。病病毒毒运运行行、扩扩散散过过程程的的长长短短与与潜
7、潜伏伏期期有有关关，一一般般为为20-6020-60天天或或更更长长或或更更短短，这这与与病病毒毒侵侵入入部部位位和和数数量量有有关关，在在此此过过程程中中，若若对对机机体体进进行行疫疫苗苗接接种种，提高机体的抗感染能力，则可预防发病。提高机体的抗感染能力，则可预防发病。 一旦狂犬病毒进入中枢神经，侵犯脑和脊髓的神经细胞，并大量增生，则引起神经细胞功能紊乱和退行性病变，机体开始出现症状，一旦发病，目前尚无法医治，病死率为100。狂犬病毒在脑神经细胞中大量增生后，通过传出神经离心性地向外扩散到周围神经及其所支配的组织中，从而引起广泛的非神经组织的感染，常累积于唾液腺，病毒大量增生而由唾液腺排除体
8、外，一般出现典型的狂犬病症状后一周内死亡。 30 304040的狂犬病患者病程晚期脑部的狂犬病患者病程晚期脑部大量增生的狂犬病毒突破血脑屏障进入血大量增生的狂犬病毒突破血脑屏障进入血液，诱导产生极高水平的狂犬病毒抗体，液，诱导产生极高水平的狂犬病毒抗体，一般高出疫苗诱导抗体水平的一般高出疫苗诱导抗体水平的100100倍，对倍，对于不典型症状的狂犬病病例可通过这一指于不典型症状的狂犬病病例可通过这一指标作实验室确证。标作实验室确证。 人狂犬病潜伏期人狂犬病潜伏期潜伏期潜伏期潜伏期潜伏期10365365365(天天) )病例数病例数病例数病例数046484622619046484622619（）（
9、）029.854.414.61.2029.854.414.61.2WHOWHO推荐的暴露后治疗指南推荐的暴露后治疗指南分类分类分类分类暴露类型暴露类型暴露类型暴露类型推荐的治疗方法推荐的治疗方法推荐的治疗方法推荐的治疗方法I I I I触摸或饲养动物触摸或饲养动物触摸或饲养动物触摸或饲养动物 舔在完整皮肤上舔在完整皮肤上舔在完整皮肤上舔在完整皮肤上如有可靠的病史，如有可靠的病史，如有可靠的病史，如有可靠的病史，不必处理不必处理不必处理不必处理IIIIIIII轻度抓伤或擦伤但未出血轻度抓伤或擦伤但未出血轻度抓伤或擦伤但未出血轻度抓伤或擦伤但未出血舔到有破口的皮肤舔到有破口的皮肤舔到有破口的皮肤舔
10、到有破口的皮肤 立即接种狂犬病疫立即接种狂犬病疫立即接种狂犬病疫立即接种狂犬病疫苗苗苗苗单一或多处穿过皮肤的咬单一或多处穿过皮肤的咬单一或多处穿过皮肤的咬单一或多处穿过皮肤的咬伤或抓伤伤或抓伤伤或抓伤伤或抓伤粘膜被唾液污染（如舔）粘膜被唾液污染（如舔）粘膜被唾液污染（如舔）粘膜被唾液污染（如舔）立即接种狂犬病疫立即接种狂犬病疫立即接种狂犬病疫立即接种狂犬病疫苗苗苗苗及免疫球白及免疫球白及免疫球白及免疫球白狂犬病发病与抗体消长趋势狂犬病发病与抗体消长趋势疫苗注射疫苗注射0天天7天天14天天180天天360天天自主抗体低水平期自主抗体低水平期3天天28天天体内自主抗体水平体内自主抗体水平发病率发病
11、率4343天天103103天天体内被动免疫抗体水平体内被动免疫抗体水平被动免疫被动免疫二、狂犬病疫苗、抗体的应用二、狂犬病疫苗、抗体的应用国内外抗狂犬病血清临床使用效果国内外抗狂犬病血清临床使用效果 时间时间时间时间 地点地点地点地点 肇事动物肇事动物肇事动物肇事动物 重伤重伤重伤重伤人数人数人数人数 处理处理处理处理 死亡人数死亡人数死亡人数死亡人数 死亡率死亡率死亡率死亡率1954195419541954 伊朗伊朗伊朗伊朗 疯狼疯狼疯狼疯狼 13 13 13 13 疫苗抗血清疫苗抗血清疫苗抗血清疫苗抗血清 1 7.7%1 7.7%1 7.7%1 7.7% 5 5 5 5 单用疫苗单用疫苗单
12、用疫苗单用疫苗 3 603 603 603 60 1981- 1981- 1981- 1981- 中国中国中国中国 疯狼疯狼疯狼疯狼 26 26 26 26 疫苗抗血清疫苗抗血清疫苗抗血清疫苗抗血清 0 00 00 00 01982 3 1982 3 1982 3 1982 3 单用疫苗单用疫苗单用疫苗单用疫苗 3 1003 1003 1003 10017171717年间年间年间年间 伊朗伊朗伊朗伊朗 364 364 364 364 疫苗抗血清疫苗抗血清疫苗抗血清疫苗抗血清 19 5.3%19 5.3%19 5.3%19 5.3% 298 298 298 298 单用疫苗单用疫苗单用疫苗单用疫
13、苗 75 2575 2575 2575 251957195719571957- - - - 苏联苏联苏联苏联 22 22 22 22 疫苗抗血清疫苗抗血清疫苗抗血清疫苗抗血清 0 00 00 00 01958195819581958 28 28 28 28 单用疫苗单用疫苗单用疫苗单用疫苗 11 39.3%11 39.3%11 39.3%11 39.3% 俞永新等俞永新等俞永新等俞永新等狂犬病和狂犬病疫苗狂犬病和狂犬病疫苗狂犬病和狂犬病疫苗狂犬病和狂犬病疫苗中国医药科技出版社中国医药科技出版社中国医药科技出版社中国医药科技出版社 2001200120012001年年年年 p190-191p19
14、0-191p190-191p190-191抗狂犬病血清使用方法抗狂犬病血清使用方法WHOWHOWHOWHO建议重度咬伤、多部位咬伤者尤其应尽量多用于伤口建议重度咬伤、多部位咬伤者尤其应尽量多用于伤口建议重度咬伤、多部位咬伤者尤其应尽量多用于伤口建议重度咬伤、多部位咬伤者尤其应尽量多用于伤口处作浸润性注射狂犬病毒抗血清，使局部伤口处抗狂犬病处作浸润性注射狂犬病毒抗血清，使局部伤口处抗狂犬病处作浸润性注射狂犬病毒抗血清，使局部伤口处抗狂犬病处作浸润性注射狂犬病毒抗血清，使局部伤口处抗狂犬病毒抗体含量足够多，用以中和伤口处肥皂无法到达部位的毒抗体含量足够多，用以中和伤口处肥皂无法到达部位的毒抗体含量
15、足够多，用以中和伤口处肥皂无法到达部位的毒抗体含量足够多，用以中和伤口处肥皂无法到达部位的狂犬病毒，剩余的抗血清肌肉注射于另一上臂。狂犬病毒，剩余的抗血清肌肉注射于另一上臂。狂犬病毒，剩余的抗血清肌肉注射于另一上臂。狂犬病毒，剩余的抗血清肌肉注射于另一上臂。人狂犬病免疫球蛋白使用量为人狂犬病免疫球蛋白使用量为人狂犬病免疫球蛋白使用量为人狂犬病免疫球蛋白使用量为20 IU/KG20 IU/KG20 IU/KG20 IU/KG体重体重体重体重, , , ,马抗狂犬病马抗狂犬病马抗狂犬病马抗狂犬病血清使用剂量为血清使用剂量为血清使用剂量为血清使用剂量为40 IU/KG40 IU/KG40 IU/KG
16、40 IU/KG体重。不得增多用量。只能一次体重。不得增多用量。只能一次体重。不得增多用量。只能一次体重。不得增多用量。只能一次注射注射注射注射, , , ,不应多次注射。不应提早于疫苗注射。不应多次注射。不应提早于疫苗注射。不应多次注射。不应提早于疫苗注射。不应多次注射。不应提早于疫苗注射。在欧美国家暴露后无论伤口轻重程度，均联合使用狂犬病在欧美国家暴露后无论伤口轻重程度，均联合使用狂犬病在欧美国家暴露后无论伤口轻重程度，均联合使用狂犬病在欧美国家暴露后无论伤口轻重程度，均联合使用狂犬病疫苗和抗血清。疫苗和抗血清。疫苗和抗血清。疫苗和抗血清。应在清洗伤口后立即使用，最迟不超过应在清洗伤口后立
17、即使用，最迟不超过应在清洗伤口后立即使用，最迟不超过应在清洗伤口后立即使用，最迟不超过7 7 7 7天。天。天。天。马血清使用前应作过敏试验。马血清使用前应作过敏试验。马血清使用前应作过敏试验。马血清使用前应作过敏试验。中国狂犬病疫苗的发展过程中国狂犬病疫苗的发展过程使用年代使用年代制备来源制备来源效力效力注射次数注射次数第一代狂犬病疫苗第一代狂犬病疫苗羊脑组织疫苗羊脑组织疫苗0.8IU/ml21（20世纪世纪6070年代）年代）第二代狂犬病疫苗第二代狂犬病疫苗地鼠肾细胞疫苗地鼠肾细胞疫苗原倍疫苗原倍疫苗1.3IU/ml5（20世纪世纪8090年代）年代）浓缩疫苗浓缩疫苗2.5IU/ml5第三
18、代狂犬病疫苗第三代狂犬病疫苗 Vero细胞纯化疫苗细胞纯化疫苗2.5IU/ml5（21世纪）世纪）0.19911CBG9908CBG9916CBG9719cCAMB02006CBGGX9912CBGGX01017VNMGX01016VNM8743THA8734THA8758cTHA8760cTHA8738THA8664cTHAI020059910LAO02002LAO02001LAOGX9914CBGGX9915BIRGX9909BIR9913BIRGX8677cMAL02042CHIGX02041CHIGX02045CHIGX02043CHIGX02044CHI02040CHIGX9811C
19、HI02035CHI02036CHI02037CHI03003INDOFL9707CHIGX02050CHIFL94270PHI94280PHIGX94273PHIGX03007PHI03006PHI02047CHIGX02049CHIGX02046CHI9709cCHI9702INDI94257cSRI9903NEPGX9902NEP9901NEP94260cNEP020529706CHIGX8690CHIGXRCHLCVSPVaGCTN亚洲街毒分离株亚洲街毒分离株N基因序列进化图基因序列进化图中国街毒1组中国街毒3组中国街毒2组中国街毒4组街毒街毒3组组街毒街毒2 2组组街毒街毒4 4组组
20、街毒街毒1 1组组武生旺宁的制备流程VEROVERO细胞细胞细胞细胞狂犬病毒狂犬病毒狂犬病毒狂犬病毒CTNCTN株株株株继续培养继续培养继续培养继续培养收获培养上清收获培养上清收获培养上清收获培养上清超滤、分子筛层析纯化精制并灭活超滤、分子筛层析纯化精制并灭活超滤、分子筛层析纯化精制并灭活超滤、分子筛层析纯化精制并灭活分装待检分装待检分装待检分装待检生物学检定及生化检定生物学检定及生化检定生物学检定及生化检定生物学检定及生化检定合格后发货合格后发货合格后发货合格后发货武生旺宁精制苗的纯度纯化后去除了9598的杂蛋白残余牛血清含量50ng/ml狂犬病疫苗临床反应观察结果狂犬病疫苗临床反应观察结果
21、产品厂家产品厂家产品厂家产品厂家试验观察试验观察试验观察试验观察全身反应全身反应全身反应全身反应局部反应局部反应局部反应局部反应血清中和抗血清中和抗血清中和抗血清中和抗体体体体人数人数人数人数平均效价平均效价平均效价平均效价阳转率阳转率阳转率阳转率武生旺宁武生旺宁武生旺宁武生旺宁3044.28%7.24%11.89IU/ml100%3044.28%7.24%11.89IU/ml100%国外产品国外产品国外产品国外产品508.0%3.6%10.08IU/ml100%508.0%3.6%10.08IU/ml100% 国内产品国内产品国内产品国内产品5034.0%25.6%-5034.0%25.6%
22、-狂犬病疫苗临床反应观察结果狂犬病疫苗临床反应观察结果武生旺宁免疫动物街毒攻击保护性试验武生旺宁免疫动物街毒攻击保护性试验旺宁稀释度旺宁稀释度旺宁稀释度旺宁稀释度街毒株攻击途径街毒株攻击途径街毒株攻击途径街毒株攻击途径 实验小鼠数实验小鼠数实验小鼠数实验小鼠数 存活小鼠数存活小鼠数存活小鼠数存活小鼠数存活率（）存活率（）存活率（）存活率（）原倍原倍原倍原倍颅内攻击颅内攻击颅内攻击颅内攻击101010101001001:51:5颅内攻击颅内攻击颅内攻击颅内攻击9910099100阴性对照阴性对照阴性对照阴性对照颅内攻击颅内攻击颅内攻击颅内攻击9111.119111.11原倍原倍原倍原倍肌肉攻击肌
23、肉攻击肌肉攻击肌肉攻击101010101001001:51:5肌肉攻击肌肉攻击肌肉攻击肌肉攻击10101010100100 阴性对照阴性对照阴性对照阴性对照肌肉攻击肌肉攻击肌肉攻击肌肉攻击1011010110微生物学免疫学进展微生物学免疫学进展微生物学免疫学进展微生物学免疫学进展 20002000年年年年 28(1):10-1128(1):10-11NIH效力测定结果效力测定结果狂犬病疫苗品种狂犬病疫苗品种狂犬病疫苗品种狂犬病疫苗品种批号批号批号批号效力效力效力效力(IU/ml)(IU/ml)武生旺宁武生旺宁武生旺宁武生旺宁200402022.99200402022.99NE120040102
24、-010.82NE120040102-010.82N20040205032.12N20040205032.12E20031202.301.28E20031202.301.28NE2200403013-120.30NE2200403013-120.30NE320031203-40.58NE320031203-40.58NE4200312340.30NE4200312340.30我国药典规定我国药典规定我国药典规定我国药典规定, ,狂犬病疫苗狂犬病疫苗狂犬病疫苗狂犬病疫苗NIHNIH效力必须达到效力必须达到效力必须达到效力必须达到 2.50IU/ml以上方以上方以上方以上方为合格为合格为合格为合格
25、武生旺宁的效力武生旺宁的效力批号批号批号批号效力效力效力效力(IU/ml)(IU/ml)批号批号批号批号效力效力效力效力(IU/ml)(IU/ml)200202013.77200301013.21200202013.77200301013.21200203022.61200301023.63200203022.61200301023.63200205032.67200301032.94200205032.67200301032.94200206042.55200302042.82200206042.55200302042.82200209052.92200302053.10200209052.
26、92200302053.10200210063.36200302062.90200210063.36200302062.90200210075.00200303073.23200210075.00200303073.23200211082.99200303082.89200211082.99200303082.89200211093.21200303093.15200211093.21200303093.15200212102.89200304102.95200212102.89200304102.95200212112.72200212112.72平均值平均值平均值平均值 2.742.74武
27、汉生物制品研究所承担狂犬病疫苗武汉生物制品研究所承担狂犬病疫苗中国国家标准品的制备中国国家标准品的制备武汉生物制品研究所起草武汉生物制品研究所起草中国药典中国药典狂犬病疫苗规程狂犬病疫苗规程精制马抗狂犬血清柱层析纯化示意图精制马抗狂犬血清柱层析纯化示意图引起过敏反应引起过敏反应的血清成分的血清成分具有中和活性具有中和活性的血清成分的血清成分三、狂犬病抗原抗体的诊断三、狂犬病抗原抗体的诊断1 1、狂犬病毒抗原的检测与诊断、狂犬病毒抗原的检测与诊断 (Diagnostic (Diagnostic procedures for antigen detection)procedures for ant
28、igen detection) 狂狂犬犬病病毒毒通通常常在在感感染染的的活活体体神神经经细细胞胞中中或或体体外外感感染染狂狂犬犬病病毒毒的的培培养养细细胞胞的的胞胞浆浆中中形形成成尼尼氏氏小小体体和和病病毒毒颗颗粒粒，而而尼尼氏氏小小体体和和病病毒毒可可以以通通过过组组织织切切片片或或以以荧荧光光素素标标记记的的特特异异性性抗抗体体进进行行免免疫疫组组化化染染色色或或其其他他方方法法进进行行检检测测，这这些些方方法法用用于于实实验验室室诊诊断断既既精精确确、又又快快速速和和经经济济。尼尼氏氏小小体体大大多多出出现现在在海海马马回回、大大脑脑皮皮质质的的锥锥体体细细胞胞和和浦浦肯肯也也氏氏细细胞
29、胞中中，较较少少出出现现在在丘丘脑脑、桥桥脑脑、髓髓质质、脊脊髓髓和和感感觉觉神神经经节节等等神神经经组组织织中中，因因此此在在进进行行神神经经组组织织为为标标本本的的实验室诊断中，其标本的选择就显得尤为重要。实验室诊断中，其标本的选择就显得尤为重要。通常采用非常简单的手术即可暴露海马回，打开颅骨暴露脑组织后沿大脑半球背面半球沟外测2cm处往下通过灰质和白质直到侧脑室纵切35cm，掀开上部脑半球，即可露出光滑的形似蚕豆状的海马回，取出海马回、部分小脑和脑干，分别在载玻片上印压制成脑印片，室温干燥后浸入丙酮30分钟，取出晾干即可用于荧光抗体实验。1. 1. 荧光抗体实验荧光抗体实验 Fluore
30、scent Fluorescent Antibody Test (FAT)Antibody Test (FAT) 狂狂犬犬病病毒毒感感染染的的细细胞胞内内有有由由狂狂犬犬病病毒毒核核衣衣壳壳聚聚集集形形成成的的包包涵涵体体。以以提提纯纯的的狂狂犬犬病病毒毒核核衣衣壳壳免免疫疫实实验验动动物物制制备备的的多多克克隆隆抗抗体体，或或抗抗核核衣衣壳壳单单克克隆隆抗抗体体与与异异硫硫氰氰酸酸荧荧光光素素偶偶联联后后，用用直直接接免免疫疫荧荧光光法法可可特特异异地地与与这这些些包包涵涵体体结结合合，该该方方法法是是狂狂犬犬病毒实验室诊断最精确、快速和最可靠的方法。病毒实验室诊断最精确、快速和最可靠的方法
31、。 狂犬病毒抗原荧光标记抗狂犬病毒抗体免疫荧光实验检测狂犬病毒抗原免疫荧光实验检测狂犬病毒抗原 脑或神经组织的印片、涂片或冰冻切片经过脑或神经组织的印片、涂片或冰冻切片经过标记有异硫氰酸荧光素的狂犬病毒抗血清或球蛋标记有异硫氰酸荧光素的狂犬病毒抗血清或球蛋白处理后，在紫外线激发下，通过荧光显微镜即白处理后，在紫外线激发下，通过荧光显微镜即可检测，狂犬病毒阳性标本中分布有大量的黄绿可检测，狂犬病毒阳性标本中分布有大量的黄绿色荧光颗粒，呈不同的形状和大小，较大的圆形色荧光颗粒，呈不同的形状和大小，较大的圆形或椭圆形发强烈荧光者为内基氏小体（或椭圆形发强烈荧光者为内基氏小体（NegriNegri b
32、odies)bodies)，而象沙粒或灰尘的较细小的荧光粒子及，而象沙粒或灰尘的较细小的荧光粒子及丝状荧光物为神经元或树突中含有的狂犬病毒颗丝状荧光物为神经元或树突中含有的狂犬病毒颗粒，荧光颗粒大小范围为粒，荧光颗粒大小范围为0.24-270.24-27 m m。 由于狂犬病毒多分布在动物脑海马回及脑干处，因此合适的取样部位对抗原的检测很重要。脑样品印片必须用丙酮固定30分钟，因为丙酮可去除细胞膜表面的脂类，以便抗体到达细胞内与狂犬病毒结合。待测脑样品必须在含50%甘油的生理盐水中0C以下保存，印片染色前需用生理盐水洗涤数次，印片及丙酮固定过程需要在P3实验室中进行。武汉生物制品研究所徐葛林等
33、采用多种抗狂犬病毒核蛋白的单克隆抗体混合物标记荧光素，经法国巴斯德研究所多次实验，分别检测了人、犬、猫、狐狸、臭鼬、蝙蝠等12种动物来源的样品，包括目前已知的狂犬病毒7个基因型在内的共计360多份样品，与BIO-RAD同类产品相比，证实我国制备的荧光抗体具有非特异性小、灵敏度高、使用前不需用正常鼠脑吸附的特点，得到国外同行的认可。荧光标记抗体需最大限度降低非特异性反应，因此制备特异性、高效价的抗体是FAT的关键。目前有关狂犬病毒FAT检测试剂已完全国产化，1999年用该方法检测了我国广西狗肉市场上出售的食用狗的脑组织，结果发现在154份外观健康的犬中，有5份为狂犬病毒抗原阳性，通过乳鼠颅内接种
34、已分离到这5株狂犬病街毒株。2.2.快速狂犬病酶免疫诊断法快速狂犬病酶免疫诊断法 Rapid Rabies Rapid Rabies Enzyme Enzyme ImmunodetectionImmunodetection (RREID) (RREID) RREIDRREID可可通通过过检检测测脑脑组组织织中中的的狂狂犬犬病病毒毒核核衣衣壳壳来来诊诊断断狂狂犬犬病病。将将标标本本于于缓缓冲冲液液或或组组织织培培养养液液中中研研磨磨成成3030匀匀浆浆，1500g1500g离离心心5 5分分钟钟取取上上清清，置置于于微微量量反反应应板板中中孵孵育育（该该板板已已用用抗抗狂狂犬犬病病毒毒核核衣衣壳
35、壳抗抗体体包包被被），然然后后再再用用过过氧氧化化物物酶酶标标记记的的抗抗狂狂犬犬病病毒毒核核衣衣壳壳抗抗体体来来检检测测被被捕捕获获的的抗抗原原，加加显显色色底底物物进进行行酶酶促促颜颜色色反反应应。对对于于一一个个给给定定的的标标本本，通通过过用用肉肉眼眼观观察察颜颜色色反反应应或或用用酶酶标标仪仪测测光光吸吸收收值值，再再与与阴阴、阳阳对对照照比比较较，即即可可得得出出有有无无狂狂犬犬病病毒毒抗抗原原的的结结论论。该该方方法法所所能能检检测测到到的的基基因因1 1型型狂狂犬犬病病毒毒最小核衣壳抗原量为最小核衣壳抗原量为0.8-1.0 0.8-1.0 ngng/ml/ml。该该方方法法由由
36、Perrin.PPerrin.P 于于19861986年年建建立立，后后经经欧欧美美6 6个个实实验验室室试试验验，共共检检测测了了30003000多多个个样样品品，结结果果表表明明与与FATFAT有有很很好好的的相相关关性性（96%96%），由由于于不不需需要要特特别别的的仪仪器器和和技技术术，该该方方法法尤尤其其适适用用于于发发达达国国家家，但但其其灵灵敏敏度度略略低低于于FATFAT。武武汉汉生生物物制制品品研研究究所所用用抗抗狂狂犬犬病病毒毒核核蛋蛋白白的的单单抗抗建建立立了了用用于于检检测测狂狂犬犬病病毒毒抗抗原原的的双双抗抗体体夹夹心心ELISAELISA法法，目目前前经经与与小小
37、鼠鼠颅颅内内接接种种及及FATFAT法法相相比比较较，检检测测了了近近10001000份份动动物物脑脑组组织织，结结果果完完全全一一致致，该该试试剂剂盒盒对对基基因因1 1型型的的狂狂犬犬病病毒毒检检出出灵灵敏敏度度达达到到0.8 0.8 ngng/ml/ml，对对狂狂犬犬病病毒毒7 7个个基基因因型型均均能检出。能检出。快速狂犬病酶免疫诊断法快速狂犬病酶免疫诊断法快速狂犬病酶免疫诊断法快速狂犬病酶免疫诊断法抗狂犬病毒单抗狂犬病毒样品酶标抗狂犬病毒抗体 检测狂犬病毒核蛋白的双抗体夹心法已于检测狂犬病毒核蛋白的双抗体夹心法已于20042004年年1111月份被中国药品生物制品检定所月份被中国药品
38、生物制品检定所列为我国狂犬病疫苗鉴别诊断试剂。列为我国狂犬病疫苗鉴别诊断试剂。技术特点及要求本方法具有灵敏度高、特异性好、操作简单、重复性好、不需要昂贵仪器等特点，最适合于作现场流行病学调查。本试剂盒中酶标板包被后需立即使用或保存于-20C备用。肉眼观察阳性对照显黄颜色，阴性对照完全无色。所有显色样品，无论深浅均认为是阳性。福尔马林固定的样品不适宜作RREID。使用酶标记抗体前的加样、孵育及洗涤过程需要在P3实验室中进行。3.3.小鼠颅内接种分离狂犬病毒法（小鼠颅内接种分离狂犬病毒法（MITMIT） 狂犬病毒是嗜神经性病毒，可采用颅内接种法分离后，再进行狂犬病特异性抗原的检查。可采用小白鼠接种
39、分离，任何品种的实验用小白鼠均可使用，一般选择体重10-20克的健康小白鼠，雌雄不限。如用1-3日龄的乳鼠，可提高分离病毒的阳性率。可疑动物脑组织或唾液腺组织可用于病毒的分离，一般前者病毒检出率要高于后者，但从流行病学观点考虑，检查唾液腺中的病毒更显重要。脑组织需要预先用含1050灭活牛血清的生理盐水或PBS或脱脂奶研磨成10悬液，150200g离心5分钟去除粗颗粒；唾液腺需切碎后再研磨，12层无菌纱布过滤后，颅内接种小鼠，0.03ml/只。狂犬病毒后潜伏期至少5天，一般观察21天，小鼠狂犬病症状一般为竖毛、战栗（用镊子夹尾悬空时）、后肢失调（置于桌上使其运动时）、麻痹、衰竭（濒死前）。MIT
40、法的特点该方法灵敏度高，仅适于分离活的狂犬病街毒，不适于因腐烂或其他原因导致病毒灭活的样品。仅凭动物发病症状不足以确定为狂犬病毒，需配合免疫荧光法作特异性鉴定。耗时较长，不适于作快速诊断用。需要在P3实验室中操作，并需要有经验的技术员。4.4.狂犬病组织培养感染实验狂犬病组织培养感染实验( (rabierabie tissue- tissue-culture infection test RTCIT)culture infection test RTCIT)上世纪70年代中期以来，各实验室相继用婴地鼠肾细胞、BHK21、鸡胚细胞、成神经瘤细胞分离街毒狂犬病毒。与小鼠颅内接种法相比所需时间大大缩
41、短，BHK21细胞培养法的敏感性与小鼠颅内接种法相似，而小鼠成神经瘤N2a细胞分离街毒比BHK21细胞更为敏感。狂犬病毒抗原的检测与诊断狂犬病毒抗原的检测与诊断狂犬病毒抗原的检测与诊断狂犬病毒抗原的检测与诊断30%脑悬液样品，5000rmp， 5minN2a细胞，继续培养24h后固定，加荧光标记的抗狂犬病毒核蛋白抗体细胞无荧光，表明样品中不含狂犬病毒细胞有荧光，表明样品中含有狂犬病毒与MIT相比，RTCIT法操作简便、成本低、耗时短，灵敏度与MIT相同，适于快速诊断。由于狂犬病毒对感染细胞不形成空斑，因此通过普通显微镜无法观察到细胞病变，借助于荧光素标记的抗狂犬病毒核蛋白即可检查出感染的细胞。
42、动动物物脑脑组组织织用用含含抗抗生生素素及及1010灭灭活活牛牛血血清清的的EMEMEMEM培培养养液液研研磨磨成成0 0（w/vw/v）悬悬液液后后2000g2000g离离心心3030分分钟钟，取取上上清清0.1ml0.1ml加加入入0.1ml0.1ml的的N2aN2a细细胞胞悬悬液液（5 5 10105 5细细胞胞/ml/ml）于于9696孔孔微微量量细细胞胞培培养养板板孔孔中中，3737 C C 5 5 COCO2 2孵孵箱箱中中培培养养2424小小时时，甩甩出出培培养养液液，板板孔孔用用8080冷冷丙丙酮酮室室温温固固定定3030分分钟钟，甩甩干干，晾晾干干后后加加入入荧荧光光素素标标
43、记记的的抗抗狂狂犬犬病病毒毒核核蛋蛋白白的的抗抗体体，3737 C C孵孵育育4545分分钟钟,PBS,PBS洗洗涤涤即即可可通通过过荧荧光光显显微微镜镜观观察察。胞胞浆浆中中有有黄黄绿绿色色荧荧光光颗颗粒粒的的为为狂狂犬犬病病毒毒阳阳性性，无无荧荧光光颗颗粒者为狂犬病毒阴性。粒者为狂犬病毒阴性。狂犬病毒抗原的检测与诊断狂犬病毒抗原的检测与诊断狂犬病毒抗原的检测与诊断狂犬病毒抗原的检测与诊断诊断技术诊断技术免疫荧光免疫荧光 快速酶快速酶小鼠颅内小鼠颅内细胞培养细胞培养胶体金胶体金实验实验免疫诊断免疫诊断接种接种分离技术分离技术免疫层析法免疫层析法所需时间所需时间2-3h3-4h5-10d20-
44、24h5-10min2-3h3-4h5-10d20-24h5-10min特异性特异性99.99%99.96%ND99.99%ND99.99%99.96%ND99.99%ND敏感性敏感性99.99%98.06%ND98.21%ND99.99%98.06%ND98.21%ND二二 狂犬病毒抗体的检测（狂犬病毒抗体的检测（Tests for the Tests for the determination of rabies antibodydetermination of rabies antibody）滴滴定定抗抗狂狂犬犬病病抗抗体体是是为为了了测测定定接接种种对对象象在在暴暴露露后后治疗末期或暴
45、露前免疫的抗体水平。治疗末期或暴露前免疫的抗体水平。WHOWHO狂狂犬犬病病专专家家委委员员会会认认为为大大于于或或等等于于0.50.5国国际际单单位位（IUIU）/ml/ml的的抗抗体体水水平平才才具具有有足足够够的的保保护护性性，如如果果滴滴度度低低于于0.5IU 0.5IU /ml/ml，必必须须给给予予加加强强剂剂量量，直直到到抗体达到要求的水平。抗体达到要求的水平。也也可可在在血血库库中中进进行行抗抗体体滴滴定定以以筛筛选选来来自自免免疫疫供供体体的的血血浆浆样样品品，用用以以制制备备治治疗疗用用人人狂狂犬犬病病免免疫疫球球蛋蛋白（白（HRIGHRIG）。）。特特异异狂狂犬犬病病抗抗
46、体体的的检检测测也也有有利利于于不不明明原原因因病病毒毒性性脑炎病人的病原学诊断。脑炎病人的病原学诊断。1973年第七届WHO狂犬病专家委员会推荐的标准检测方法有小鼠中和试验（MNT）空斑减少试验亦即随后发展成的快速荧光灶抑制试验（RFFIT）。RFFIT为现代试验室的首选方法，其敏感度至少与MNT一致。小鼠中和试验小鼠中和试验小鼠中和试验小鼠中和试验 三倍系列稀释待测血清三倍系列稀释待测血清预先滴定过的中和用狂犬病毒预先滴定过的中和用狂犬病毒（设已知国际单位的标准血清对照）设已知国际单位的标准血清对照）CVSCVS鼠脑悬液（稀释成鼠脑悬液（稀释成30-300LD30-300LD5050）等量
47、混合等量混合3737保温保温1 1小时后小时后3737中和中和1 1小时小时复滴定复滴定LDLD5050颅内接种颅内接种10-1210-12克小白鼠克小白鼠观察并记录小鼠发病及死亡情况观察并记录小鼠发病及死亡情况 根据试验结果计算中和指数及中和抗体含量根据试验结果计算中和指数及中和抗体含量特点：可定量检测狂犬病毒中和抗体效价；需专门技术培训，操作较繁琐；实验周期需14天，耗时长，不利于快速诊断；需较多试验小鼠，成本高；动物间的个体差会影响试验结果，我国药典收录的狂犬病中和抗体滴定法即用此法。2. 2. 快速荧光灶抑制试验快速荧光灶抑制试验 （RFFITRFFIT）：）：原理： 将预先滴定致细胞
48、80感染的攻击毒株CVS与3倍系列稀释的待滴定血清37C孵育1小时，试验中设包括已知中和抗体国际单位含量的参照血清，再将血清/病毒混和液加入BSR细胞悬液。37C 5CO2孵育24小时后，细胞单层用80冷丙酮固定，加荧光标记的抗核衣壳抗体进行染色，检测未被中和的病毒的存在（荧光灶），通过Reed-Muench法计算待滴定血清中狂犬病毒中和抗体单位。快速荧光灶抑制试验快速荧光灶抑制试验快速荧光灶抑制试验快速荧光灶抑制试验三倍系列稀释待测血清三倍系列稀释待测血清预先滴定过的中和用狂犬病毒预先滴定过的中和用狂犬病毒（设已知国际单位的标准血清对照）设已知国际单位的标准血清对照）CVSCVS病毒悬液（致
49、病毒悬液（致8080细胞感染的病毒量）细胞感染的病毒量）等量混合等量混合3737保温保温1 1小时后小时后3737中和中和1 1小时小时复滴定复滴定FFUFFU接种接种BSRBSR细胞细胞 COCO2 2孵箱孵箱3737培养培养2424小时小时 固定并用荧光抗体染色，荧光镜观察，固定并用荧光抗体染色，荧光镜观察，记录每孔荧光灶数量，计算血清抗体效价记录每孔荧光灶数量，计算血清抗体效价特点：可定量检测狂犬病毒中和抗体效价；耗时较短，可用于精确定量的快速诊断；重复性好；需专门技术培训，操作较繁琐；需荧光显微镜。该方法为WHO推荐的狂犬病中和抗体首选滴定法，武汉生物制品研究所已从法国成功引进此法，所
50、用荧光抗体已完全达到国产化。3.3.酶免疫吸附法（酶免疫吸附法（ELISAELISA）：）：酶酶免免疫疫吸吸附附法法是是七七十十年年代代建建立立的的方方法法，目目前前世世界界上上用用于于检检测测狂狂犬犬病病毒毒抗抗体体初初步步筛筛选选的的酶酶免免疫疫法法基基本本上上是是采采用用间间接接ELISAELISA法法，其其吸吸附附抗抗原原有有全全病病毒毒颗颗粒粒、纯纯化化的的狂狂犬犬病病毒毒糖糖蛋蛋白白以以及及纯纯化化的的狂狂犬犬病病毒毒核核衣衣壳壳蛋蛋白白（RNPRNP），并并以以过过氧氧化化物物酶酶标标记记的的抗抗抗抗体体作作为为标标记记抗抗体体，即即可可检检测测人人及及不不同同动动物物血血清清中
51、中的抗狂犬病毒抗体。的抗狂犬病毒抗体。 酶免疫吸附法酶免疫吸附法酶免疫吸附法酶免疫吸附法 抗狂犬病毒单抗包被 狂犬病毒抗原待检人血清中的抗狂犬病毒抗体酶标抗人IgG抗体显色底物表表2EIA2EIA与与MNAMNA检测狂犬病毒抗体结果比较检测狂犬病毒抗体结果比较免疫用疫苗免疫用疫苗例数例数MNAEIAMNAEIAEIAEIA阳性数阳性数阳性数阳性数阳检率阳检率 维尔博苗维尔博苗747474747474100%100%aGaG浓缩苗浓缩苗676767676292.5%6292.5%CTNCTN精制苗精制苗34/3191.2%34/3191.2%各种检测狂犬病毒抗体的各种检测狂犬病毒抗体的ELISA
52、ELISA法的抗原抗体比较法的抗原抗体比较 酶免疫吸附法酶免疫吸附法 吸附抗原吸附抗原 所检测的抗体所检测的抗体 间接间接ELISA ELISA 纯化狂犬病毒糖蛋白纯化狂犬病毒糖蛋白 抗狂犬病毒糖蛋白抗体（中和抗体）抗狂犬病毒糖蛋白抗体（中和抗体） 间接间接ELISA ELISA 纯化全病毒颗粒纯化全病毒颗粒 抗狂犬病毒抗体（含中和抗体）抗狂犬病毒抗体（含中和抗体） 间接间接ELISA ELISA 粗制狂犬病毒粗制狂犬病毒 抗吸附抗原的抗体（含中和抗体）抗吸附抗原的抗体（含中和抗体） 夹心间接夹心间接ELISA ELISA 狂犬病毒抗原狂犬病毒抗原 抗狂犬病毒抗原抗体（含中和抗体）抗狂犬病毒抗
53、原抗体（含中和抗体）特点：ELISAELISA只只需需简简单单的的实实验验室室设设备备，尤尤其其适适合合检检测测大大量量的血清样品，且在很短的时间内即可出结果。的血清样品，且在很短的时间内即可出结果。ELISAELISA法法与与MNTMNT有有较较好好的的相相关关性性，在在小小鼠鼠饲饲养养及及组组织织培培养养不不具具备备的的实实验验室室里里，ELISAELISA可可视视为为MNTMNT的的替替代方法。代方法。严严格格地地讲讲，ELISAELISA实实验验并并没没有有测测定定真真正正的的中中和和抗抗体体，所所测测抗抗体体为为几几乎乎所所有有的的与与包包被被板板上上抗抗原原结结合合的的IgGIgG抗抗体体，包包括括一一些些非非特特异异性性抗抗体体，所所以以其其结结果果不不用用国国 际际 单单 位位 （ IU/mlIU/ml） 表表 示示 ， 而而 是是 用用 等等 价价 单单 位位（EU/mlEU/ml）表示。）表示。 各血清学试验获得结果所需时间方法 MNTRFFITELISAIFA时间 21天26小时4小时2小时定性或 定量定量 定量 定性定量
