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1、实验四 DNA限制性酶切和琼脂糖凝胶电泳 EcoR I Restriction Enzymel识别序列识别序列 -GAATT C - - C TTAAG -实验原理-限制性内切酶及酶切反应BamH I Restriction Enzyme识别序列：识别序列： - GGATC C - - C CTAGG -Hind III Restriction Enzyme识别序列：识别序列： - AAGCT T - - T TCGAA - l每一种限制性内切酶都有特定的反应条件：每一种限制性内切酶都有特定的反应条件： pH范围：范围： 7.58.0 缓冲液组份缓冲液组份: Tris(三羟甲基氨基甲烷）、三羟
2、甲基氨基甲烷）、 NaCl、 MgCl2、 温育温度：温育温度：37l反应体系：反应体系： DNA (1ug或更少或更少) 5ul 10 x Buffer 2ul Restriction Enzyme 3ul H2O 10ul Total 20ull混匀，混匀，37度保温度保温30分钟分钟实验原理-琼脂糖凝胶电泳 电泳是在一个电场的作用下，在琼脂糖支持电泳是在一个电场的作用下，在琼脂糖支持电泳是在一个电场的作用下，在琼脂糖支持电泳是在一个电场的作用下，在琼脂糖支持介质上，能将一个混合物分离成若干条区带（若介质上，能将一个混合物分离成若干条区带（若介质上，能将一个混合物分离成若干条区带（若介质上
3、，能将一个混合物分离成若干条区带（若干个组分）的过程。干个组分）的过程。干个组分）的过程。干个组分）的过程。 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是一种简便、快速、最是一种简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法。常用的分离纯化和鉴定核酸的方法。l l 琼琼琼琼脂脂脂脂糖糖糖糖是是是是一一一一种种种种线线线线性性性性多多多多糖糖糖糖聚聚聚聚合合合合物物物物。将将将将琼琼琼琼脂脂脂脂糖糖糖糖粉粉粉粉末末末末加加加加热热热热到到到到熔熔熔熔点点点点后后后后冷冷冷冷却却却却凝凝凝凝固固固固便便便便会会会会形形形形成成成成良良良良好好好好的电泳介质。的电泳介质。的电泳介质。的电泳介质。琼脂糖琼脂糖琼脂糖凝
4、胶的浓度与DNA分离范围琼脂糖浓度(%)线型DNA分子的分离范围(Kb)0.35600.61200.80.8100.90.571.20.961.50.2312.00.12电泳法的优点l l凡是能带电的物质，都可以用电泳法分离。凡是能带电的物质，都可以用电泳法分离。凡是能带电的物质，都可以用电泳法分离。凡是能带电的物质，都可以用电泳法分离。l l样品用量少。样品用量少。样品用量少。样品用量少。l l设备简单。设备简单。设备简单。设备简单。l l可在室温进行。可在室温进行。可在室温进行。可在室温进行。l l操作简便，费时不多操作简便，费时不多操作简便，费时不多操作简便，费时不多l l不同类型的电泳
5、，有不同的用途。不同类型的电泳，有不同的用途。不同类型的电泳，有不同的用途。不同类型的电泳，有不同的用途。l l改改改改进进进进或或或或找找找找到到到到更更更更好好好好的的的的支支支支持持持持介介介介质质质质，就就就就有有有有可可可可能能能能大大大大大大大大地地地地提提提提高高高高分分分分辩辩辩辩率。率。率。率。1、TAE电泳缓冲液电泳缓冲液 Tris-base 冰醋酸冰醋酸 EDTA2、琼脂糖凝胶（、琼脂糖凝胶（0.8%） 琼脂糖：琼脂糖：0.8g TAE：100ml 试剂3、溴化乙锭、溴化乙锭(ethidium bromide，EB)lEB染色液工作液浓度：染色液工作液浓度：0.010.0
6、3mg/mllEB是一种荧光染料，其扁平分子可嵌入核酸双链的碱是一种荧光染料，其扁平分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。4、6 x Loading Dyel组成组成0.25% bromophenol blue（深蓝色）（深蓝色）0.4% orange G （黄色）（黄色）10mol/L Tirs-HCl (pH7.5), 50mol/L EDTAl使用量使用量 5份份DNA样品溶液加样品溶液加1份份Blue / 6xLoading Dye操 作 步 骤一、酶切反应l反应体系：反应体系： DNA 5ul 10 x Buffer 2
7、ul Hind III 3ul H2O 10ul Total 20ull混匀，混匀，37度保温度保温30分钟分钟二、电泳。1、电泳前的准备工作 轻轻刷干净电泳制胶的梳子，模板，电泳槽，用蒸馏水轻轻刷干净电泳制胶的梳子，模板，电泳槽，用蒸馏水洗净晾干，把制胶槽放入模板中。洗净晾干，把制胶槽放入模板中。2、制 胶 (1)每组称取琼脂糖每组称取琼脂糖0.24g,倒入三角瓶，再往其中加入倒入三角瓶，再往其中加入 30ml电泳缓冲液，微波炉加热直到琼脂糖溶化。电泳缓冲液，微波炉加热直到琼脂糖溶化。（2)每组将琼脂糖液冷却到约每组将琼脂糖液冷却到约70,轻轻倒入胶槽，并插轻轻倒入胶槽，并插 上梳子。凝固约
8、上梳子。凝固约30min. (3)取出梳子，把胶放在电泳槽中，准备电泳。取出梳子，把胶放在电泳槽中，准备电泳。3、点样和电泳 9 8 7 6 5 4 3 2 1 9 8 7 6 5 4 3 2 1(1)将酶切产物、自制将酶切产物、自制DNA与与6 x Loading Dye混混 合，每个样品混合后体积均为合，每个样品混合后体积均为24ul。 a.自制自制DNA 20ul + 4ul Loading Dye b. 酶切产物酶切产物 20ul +4ul Loading Dye (2)将标准将标准DNA /Hand III 、DNA 、酶切产物、自制、酶切产物、自制 DNA各各10ul点入点样孔。点入点样孔。(3)电泳。电泳。(4)EB染色染色10min。（注意不要污染实验室环境）（注意不要污染实验室环境）-DNA / Hind III Markers片段大小（片段大小（ bp）和电泳带型示意图）和电泳带型示意图点样孔点样孔23130941665574361232220274、紫外分析仪下看胶23130 232220279416 6557 4361警告l胶染色和观察时一定要带手套！胶染色和观察时一定要带手套！EB（溴化乙锭）诱变！结果记录与分析l绘制电泳图谱绘制电泳图谱
