《H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建》由会员分享，可在线阅读，更多相关《H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建（80页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、 H5N1H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建亚型禽流感病毒感染性克隆的构建及其及其RNARNA干扰的研究干扰的研究汇报提纲：汇报提纲：汇报提纲：汇报提纲：v 文献综述文献综述v RNA RNA干扰对干扰对A A型流感病毒基因表达及病毒复制型流感病毒基因表达及病毒复制 的抑制作用的研究的抑制作用的研究v H5N1亚型禽流感病毒亚型禽流感病毒A/chicken/Hubei/327/2004 全基因组克隆、测序全基因组克隆、测序及其感染性克隆的构建及其感染性克隆的构建 1 1 文献综述文献综述 文献综述文献综述禽流感的发生与流行禽流感的发生与流行 文献综述文献综述禽流感禽流感（Avian Inf
2、luenza, AI），是由是由A型流感病毒引起型流感病毒引起的一种禽类的烈性传染性疾病或疾病综合征。的一种禽类的烈性传染性疾病或疾病综合征。1878年，首年，首次在意大利发现了禽流感的流行。次在意大利发现了禽流感的流行。高致病性禽流感（高致病性禽流感（Highly Pathogenic Avian Influenza, Highly Pathogenic Avian Influenza, HPAIHPAI）是由是由A型流感病毒中型流感病毒中H5H5、H7H7亚型流感病毒引起，目亚型流感病毒引起，目前已经呈世界性分布，前已经呈世界性分布， 全世界全世界5050多个国家和地区（多个国家和地区（O
3、IEOIE数数据）报道了高致病性禽流感的发生和流行。据）报道了高致病性禽流感的发生和流行。我国自我国自19961996年首次报道分离到年首次报道分离到H5N1H5N1亚型高致病性禽流感病亚型高致病性禽流感病毒之后，其流行一直呈上升趋势。毒之后，其流行一直呈上升趋势。世界上高致病性禽流感感染人的发病世界上高致病性禽流感感染人的发病与死亡情况（截至与死亡情况（截至2006-6-03） 文献综述文献综述禽流感病毒的结构模式图禽流感病毒的结构模式图 文献综述文献综述 流感病毒为单股负链流感病毒为单股负链RNA，由，由8个片断组成，共编码个片断组成，共编码8种种结构蛋白和结构蛋白和2种非结构蛋白。其表面
4、有一层由双层脂质构成种非结构蛋白。其表面有一层由双层脂质构成的囊膜，镶嵌着二种重要的纤突，分别为的囊膜，镶嵌着二种重要的纤突，分别为 HA、NA。 病毒粒子的主要蛋白成分：病毒粒子的主要蛋白成分：血凝素（血凝素（HA）神经氨酸（神经氨酸（NA） 核蛋白（核蛋白（NP） 基质蛋白基质蛋白(M1,M2) 聚合酶聚合酶 （ PB1、PB2、PA） 非结构蛋白（非结构蛋白（NS1、NS2）RNARNA干扰的基本原理干扰的基本原理 文献综述文献综述ATP、RNA解旋酶解旋酶通过作用于病毒特定基因的通过作用于病毒特定基因的siRNA抑制病毒在细胞内的复抑制病毒在细胞内的复制，制，siRNA可作用于细胞中病
5、毒靶受体以干扰病毒的侵染，可作用于细胞中病毒靶受体以干扰病毒的侵染，期望达到治疗病毒性疾病的目标期望达到治疗病毒性疾病的目标。RNA干扰技术已经在多种干扰技术已经在多种病毒研究中得到了成功的应用：病毒研究中得到了成功的应用：人类免疫缺陷病毒人类免疫缺陷病毒型、型、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、甲甲型流感病毒型流感病毒、口蹄疫病口蹄疫病毒、毒、西尼罗病毒和西尼罗病毒和SARS冠状病毒冠状病毒等。等。 RNAi在病毒研究中的应用在病毒研究中的应用 文献综述文献综述病毒的感染性克隆其实就是模拟病毒复制、转录等病毒病毒的感染性克隆其实就是模拟病毒复制、转录等病毒生命周期，人工构
6、建病毒的过程。生命周期，人工构建病毒的过程。病毒的感染性克隆也称为病毒的反向遗传操作技术病毒的感染性克隆也称为病毒的反向遗传操作技术（Reverse Genetic Manipulaton）。）。病毒的感染性克隆病毒的感染性克隆 文献综述文献综述反向遗传学及其操作技术反向遗传学及其操作技术反向遗传学是直接从生物的遗传物质入手来阐述生物生命发反向遗传学是直接从生物的遗传物质入手来阐述生物生命发生的本质现象，与之相关的各种技术统称为反向遗传学操作生的本质现象，与之相关的各种技术统称为反向遗传学操作技术技术。病毒病毒反向遗传操作技术解决了对反向遗传操作技术解决了对RNA 病毒基因组难以操作这病毒基因
7、组难以操作这一困扰研究者多年的难题一困扰研究者多年的难题，开创了病毒研究的新时代。开创了病毒研究的新时代。 文献综述文献综述禽禽流流感感病病毒毒的的复复制制v以辅助流感病毒为基础的反向遗传操作系统以辅助流感病毒为基础的反向遗传操作系统核糖核蛋白转染法核糖核蛋白转染法RNARNA聚合酶聚合酶方法方法v完全完全以克隆的以克隆的cDNAcDNA为基础的反向遗传操作系统为基础的反向遗传操作系统RNARNA聚合酶聚合酶系统系统:17:17质粒系统质粒系统RNARNA聚合酶聚合酶系统系统:12:12质粒系统质粒系统双向双向RNARNA聚合酶聚合酶/转录系统转录系统: 8: 8质粒系统质粒系统流感病毒反向遗
8、传操作技术的发展历程流感病毒反向遗传操作技术的发展历程 以辅助流感病毒为基础的反向遗传操作系统以辅助流感病毒为基础的反向遗传操作系统 v核糖核蛋白转染法： 采用T7 RNA聚合酶体外转录系统，NS-CAT-NS，体外转录 vRNA聚合酶方法： RNA聚合酶I（pol I）启动子代替T7 RNA聚合酶启动子完全以克隆的完全以克隆的cDNAcDNA为基础的反向遗传操作系统为基础的反向遗传操作系统 1717质粒系统质粒系统 1212质粒系统质粒系统 20002000年，年，HoffmannHoffmann等建立了等建立了RNA聚合酶聚合酶/系统，系统， vRNA和和mRNA的合成来自于的合成来自于一
9、个模板一个模板，不需要构建专门的蛋白不需要构建专门的蛋白表达质粒，为拯救病毒而构建的质粒数将大大减少。表达质粒，为拯救病毒而构建的质粒数将大大减少。 这一系统采用共培养这一系统采用共培养的的293T细胞细胞和和MDCK细胞细胞，8质粒转染质粒转染细胞后，细胞后， RNA聚合聚合酶酶转录产生转录产生负链负链vRNA，RNA聚合聚合酶酶合成正合成正链链mRNA 。转染的。转染的293T细胞中产生的病毒随后将细胞中产生的病毒随后将感染感染MDCK细胞并大量复制细胞并大量复制。RNARNA聚合酶聚合酶/转录系统转录系统: 8: 8质粒系统质粒系统RNARNA聚合酶聚合酶/转录系统转录系统: 8: 8质
10、粒系统质粒系统双向双向RNARNA聚合酶聚合酶/转录系统转录系统: 8: 8质粒系统质粒系统v利用反向遗传学操作技术研究流感病毒的致病性利用反向遗传学操作技术研究流感病毒的致病性v利用反向遗传学操作技术研究流感病毒的生命周期利用反向遗传学操作技术研究流感病毒的生命周期v利用反向遗传学操作技术研究流感疫苗利用反向遗传学操作技术研究流感疫苗流感病毒反向遗传操作技术的应用流感病毒反向遗传操作技术的应用 “6“62”2”流感疫流感疫苗苗2 RNA干扰对干扰对A型流感病毒基因表达及病毒型流感病毒基因表达及病毒复制的抑制作用的研究复制的抑制作用的研究 2.1 2.1 2.1 2.1 研究目的和意义研究目的
11、和意义研究目的和意义研究目的和意义v本研究选用本研究选用NP和和M2基因作为基因作为RNA干扰的靶基因，针对干扰的靶基因，针对NP和和M2基因保守区段设计了基因保守区段设计了5对对siRNA。v研究了研究了siRNA对基因表达的影响及其对基因表达的影响及其对对H1N1、H5N1和和H9N2亚型亚型流感病毒在体内和体外复制的影响，筛选出能有流感病毒在体内和体外复制的影响，筛选出能有效抑制流感病毒复制效抑制流感病毒复制的的siRNA序列，为探索序列，为探索RNAi技术应用技术应用于抗禽流感研究奠定基础。于抗禽流感研究奠定基础。 研究目的和意义研究目的和意义2.2 2.2 2.2 2.2 研究内容研
12、究内容研究内容研究内容v禽禽流流感感病病毒毒A/chicken/Hubei/327/2004 NP和和M2基基因因的的克克隆隆及及M2基因跨膜区的缺失基因跨膜区的缺失(M2 ).vNP和和M2 基基因因同同eGFP共共表表达达真真核核质质粒粒的的构构建建及及其其在在HeLa细细胞中的表达胞中的表达.vNP和和M2基因特异性基因特异性siRNA的设计及其真核表达质粒的构建的设计及其真核表达质粒的构建vsiRNA对对NP和和M2基因在基因在HeLa细胞中表达水平影响的研究细胞中表达水平影响的研究.vsiRNA在在体体外外（MDCK细细胞胞上上）对对流流感感病病毒毒(H5N1, H9N2, H1N1
13、)复制的影响复制的影响.vsiRNA的体内试验和攻毒保护试验的体内试验和攻毒保护试验研究内容研究内容2.3 2.3 2.3 2.3 结果与分析结果与分析结果与分析结果与分析NPNP基因的基因的PCRPCR扩增及同报告基因（扩增及同报告基因（EGFPEGFP）融合表达质粒的构建融合表达质粒的构建 结果与分析结果与分析NP基因的基因的PCR扩增结果扩增结果质粒质粒pCDM-NP的酶切鉴定的酶切鉴定和和PCR鉴定鉴定PCR方法缺失方法缺失M2基因跨膜区基因跨膜区 结果与分析结果与分析M2M2基因的克隆、跨膜区的缺失及同报告基因（基因的克隆、跨膜区的缺失及同报告基因（EGFPEGFP）融合表达质粒的构
14、建融合表达质粒的构建 结果与分析结果与分析M2基因基因跨膜区缺失的跨膜区缺失的PCR扩增结果扩增结果质粒质粒pCDM-M2的酶切鉴定的酶切鉴定和和PCR鉴定鉴定结果与分析结果与分析NP基因同基因同EGFP在在HeLa细胞中的细胞中的融合表达融合表达M2基因同基因同EGFP在在HeLa细胞中的细胞中的融合表达融合表达质粒质粒pCDM-NP、pCDM-M2在转染在转染HeLa细胞后细胞后12小时就可以检测到特异性小时就可以检测到特异性荧光，转染后荧光，转染后24小时发出荧光的细胞明显增多，荧光主要呈弥散性分布于整小时发出荧光的细胞明显增多，荧光主要呈弥散性分布于整个细胞中，说明个细胞中，说明NP基
15、因与基因与EGFP，M2基因与基因与EGFP均发生了融合表达。均发生了融合表达。 NP、M2基因同报告基因（基因同报告基因（EGFP）在）在HeLa细胞中的细胞中的融合表达融合表达NP和和M2 基因特异性基因特异性siRNA的设计及其真核表达质粒的构建的设计及其真核表达质粒的构建BamHI+HindIII结果与分析结果与分析NP和和M2 基因特异性基因特异性siRNA真核表达质粒的构建真核表达质粒的构建siRNA表达质粒表达质粒bamHI + HindIII的双酶切鉴定的双酶切鉴定M: DNA marker (DL-15000)1: pSCMV- M48 2: pSCMV-M7543: pSC
16、MV-M949 4: pSCMV-NP749 5: pSCMV-NP1383结果与分析结果与分析结果与分析结果与分析siRNA表达质粒与表达质粒与pCDM-NP共转染共转染 siRNA表达质粒与表达质粒与pCDM-M2共转染共转染 siRNAsiRNA表达质粒与表达质粒与pCDM-NPpCDM-NP或或pCDM-pCDM-M2M2共转染共转染siRNA对对NP和和M2 基因在基因在HeLa细胞中表达水平影响细胞中表达水平影响结果与分析结果与分析siRNAsiRNA表达质粒同表达质粒同pCDM-NPpCDM-NP共转染后共转染后2424h h的流式细胞检测的流式细胞检测 结果与分析结果与分析结果
17、与分析结果与分析siRNAsiRNA表达质粒同表达质粒同pCDM-pCDM-M2M2共转染后共转染后2424h h的流式细胞检测的流式细胞检测半定量半定量RT-PCR检测检测NP、EGFP mRNA的水平的水平 结果与分析结果与分析A: pNP-EGFP + pS-NegativeB: pNP-EGFP + pS-NP749C: pNP-EGFP + pS-NP1383D: Cell Control结果与分析结果与分析A: pM2 -EGFP + pS-Negative B: pM2 -EGFP + pS-M48C: pM2 -EGFP + pS-M754 D: pM2 -EGFP + pS-
18、M949E: Cell Control半定量半定量RT-PCR检测检测M2、EGFP mRNA的水平的水平半定量半定量RT-PCR检测看家基因检测看家基因GAPDH mRNA的水平的水平 结果与分析结果与分析A：pCDM-NP pSilencer 4.1-negativeB：pCDM-NP pSCMV-NP749C：pCDM-NP pSCMV-NP1383D：pCDM-M2 pSilencer 4.1-negativeE：pCDM-M2 pSCMV- M48F：pCDM-M2 pSCMV-M754G：pCDM-M2 pSCMV-M949H：Cell ControlWestern blot We
19、stern blot 评价评价siRNAsiRNA对目的基因表达的抑制作用对目的基因表达的抑制作用 结果与分析结果与分析Western blot检测检测M2基因的表达水平基因的表达水平 A：pCDM-M2 pSilencer 4.1-negative C：pCDM-M2 pSCMV-M754B：pCDM-M2 pSCMV-M949 D：pCDM-M2 pSCMV- M48E：Cell Control Western blot检测检测NP基因的表达水平基因的表达水平A：pCDM-NP pSilencer 4.1-negative C：pCDM-NP pSCMV-NP1383B：pCDM-NP p
20、SCMV-NP749 D：Cell ControlWestern blot Western blot 检测检测GAPDHGAPDH基因的表达基因的表达 结果与分析结果与分析A：pCDM-NP pSilencer 4.1-negative E：pCDM-M2 pSCMV- M48B：pCDM-NP pSCMV-NP749 F：pCDM-M2 pSCMV-M754C：pCDM-NP pSCMV-NP1383 G：pCDM-M2 pSCMV-M949D：pCDM-M2 pSilencer 4.1-negative H：Cell ControlsiRNA对对A型流感病毒在型流感病毒在MDCK细胞中复制
21、的抑制作用细胞中复制的抑制作用 结果与分析结果与分析 在在6 6孔板上培养孔板上培养MDCKMDCK细胞，待细胞长至细胞，待细胞长至80%80%满时分别转满时分别转染染siRNA表达质粒，表达质粒，同时设置同时设置p pSilencerSilencer 4.1-negative 4.1-negative对对照和空白细胞对照。转染后照和空白细胞对照。转染后1818-24-24h h分别接种流感病毒分别接种流感病毒H1N1H1N1（10106 6 TCID TCID5050），），H5N1H5N1（10104 4 TCID TCID5050），），H9N2H9N2（10106 6 TCIDTCID
22、5050），接毒后），接毒后48-72h48-72h收获细胞及上清进行病毒收获细胞及上清进行病毒TCIDTCID5050的测定。的测定。siRNAsiRNA对对A A型流感病毒在型流感病毒在MDCKMDCK细胞中复制的抑制作用细胞中复制的抑制作用 结果与分析结果与分析siRNAsiRNA对对A A型禽流感病毒在小鼠肺中复制的抑制作用型禽流感病毒在小鼠肺中复制的抑制作用 结果与分析结果与分析各攻毒组小鼠（各攻毒组小鼠（4 4只只/ /组）注射质粒的种类和剂量组）注射质粒的种类和剂量 siRNAsiRNA对对H5N1H5N1亚型禽流感病毒在小鼠肺中复制的抑制作用亚型禽流感病毒在小鼠肺中复制的抑制作
23、用 结果与分析结果与分析 siRNA 的瞬时表达特异性抑制的瞬时表达特异性抑制H5N1亚型禽流感亚型禽流感病毒在小鼠肺脏中的复制病毒在小鼠肺脏中的复制 siRNAsiRNA对对H5N1H5N1亚型禽流感病毒在小鼠肺中复制的抑制作用亚型禽流感病毒在小鼠肺中复制的抑制作用 结果与分析结果与分析 siRNA特异性抑制特异性抑制H5N1流感病毒在体内的复制流感病毒在体内的复制 siRNAsiRNA对对H1N1H1N1和和H9N2H9N2亚型流感病毒在小鼠肺中亚型流感病毒在小鼠肺中复制的抑制作用复制的抑制作用 结果与分析结果与分析siRNA siRNA 的瞬时表达特异性抑的瞬时表达特异性抑制制H1N1H
24、1N1亚型流感病毒在小鼠亚型流感病毒在小鼠肺脏中的复制肺脏中的复制siRNA 的瞬时表达特异性抑制的瞬时表达特异性抑制H9N2亚型禽流感病毒在小鼠肺亚型禽流感病毒在小鼠肺脏中的复制脏中的复制 siRNA对对H1N1和和H9N2亚型流感病毒在小鼠肺中亚型流感病毒在小鼠肺中复制的抑制作用复制的抑制作用 结果与分析结果与分析 siRNA显著性降低显著性降低H1、H5和和H9 亚型流感病毒攻亚型流感病毒攻击小鼠的肺病毒滴度击小鼠的肺病毒滴度 siRNAsiRNA对对A A型流感病毒攻击小鼠的保护作用型流感病毒攻击小鼠的保护作用 结果与分析结果与分析攻毒保护组小鼠（攻毒保护组小鼠（8 8只只/ /组）注
25、射质粒的种类和剂量组）注射质粒的种类和剂量 siRNAsiRNA对对H1N1H1N1亚型流感病毒攻击小鼠的保护作用亚型流感病毒攻击小鼠的保护作用 结果与分析结果与分析H1N1H1N1亚型流感病毒攻击后小鼠体重的变化亚型流感病毒攻击后小鼠体重的变化*, Groups differ for weight loss, p0.05 (Students test) H1N1亚型流感病毒攻击后亚型流感病毒攻击后小鼠的存活率小鼠的存活率 siRNAsiRNA对对H5N1H5N1亚型禽流感病毒攻击小鼠的保护作用亚型禽流感病毒攻击小鼠的保护作用 结果与分析结果与分析H5N1H5N1亚型流感病毒攻击后小鼠体重的变
26、化亚型流感病毒攻击后小鼠体重的变化*, Groups differ for weight loss, p0.05 (Students test) H5N1亚型流感病毒攻击后亚型流感病毒攻击后小鼠的存活率小鼠的存活率 2.4 2.4 讨论讨论讨论讨论RNAi的设计的设计RNAi具有高度的基因特异性。在发夹式具有高度的基因特异性。在发夹式siRNA中，单个碱中，单个碱基的错配都可能会消除它的基的错配都可能会消除它的RNAi效果。因此，构建的效果。因此，构建的siRNA表达质粒必须经过测序鉴定，表达质粒必须经过测序鉴定，保证与靶基因保证与靶基因的的100%同源性。同源性。所设计的所设计的siRNA序
27、列不应与人或其它动物基因组同源。本序列不应与人或其它动物基因组同源。本研究中，研究中，“看家基因看家基因”- GAPDH的检测结果显示：所选择的检测结果显示：所选择的的siRNA没有干扰转染细胞本身的基因表达和转录。没有干扰转染细胞本身的基因表达和转录。讨论讨论NP和和M2基因作为基因作为RNA干扰的靶基因的意义干扰的靶基因的意义 NP和和M2基基因因是是A 型型流流感感病病毒毒中中最最保保守守的的基基因因，变变异异很很小小，因因而而选选择择NP和和M2基基因因作作为为RNA干干扰扰的的靶靶基基因因，这这样样找找到到的的能能有有效效抑抑制制流流感感病病毒毒复复制制的的siRNA序序列列对对所所
28、有有A型型流流感感病病毒都是有效的。毒都是有效的。本本研研究究的的结结果果也也显显示示了了，能能有有效效抑抑制制NP和和M2基基因因转转录录和和表表达达的的siRNA对对A型型流流感感病病毒毒中中不不同同亚亚型型的的病病毒毒均均有有抑抑制制作作用用，说说明明以以NP和和M2为为靶靶基基因因设设计计的的siRNA对对A型型流流感感病病毒毒的抑制作用具有广谱性。的抑制作用具有广谱性。讨论讨论RNA干扰在抗病毒研究中的应用前景干扰在抗病毒研究中的应用前景 依靠依靠RNAi 技术获得病毒复制的强有效抑制的同时，不得不技术获得病毒复制的强有效抑制的同时，不得不考虑病毒逃逸的可能性。为避免这个困难考虑病毒
29、逃逸的可能性。为避免这个困难，通常通常采用多个采用多个必需靶位点作为联合必需靶位点作为联合siRNA 治疗方法，以避免病毒逃逸突治疗方法，以避免病毒逃逸突变株的演化。变株的演化。本研究中采用本研究中采用siRNA M-48+NP-1383联合使用时的效果明显联合使用时的效果明显优于二者单独使用时的效果，这可能也是因为联合使用时优于二者单独使用时的效果，这可能也是因为联合使用时针对的是流感病毒的两个基因的靶位点，从而有效地减少针对的是流感病毒的两个基因的靶位点，从而有效地减少了病毒逃逸的可能，增强了治疗效果。了病毒逃逸的可能，增强了治疗效果。 讨论讨论2.5 结结 论论完成了禽流感病毒完成了禽流
30、感病毒A/chicken/Hubei/327/2004 NP和和M2基因的克隆，采用基因的克隆，采用PCR方法缺失了方法缺失了M2基因跨膜区的第基因跨膜区的第2655位氨基酸位氨基酸 （M2 ）。）。 实现实现了了NP和和M2 基因分别同基因分别同EGFP在在HeLa细胞中的细胞中的融合融合表达，融合蛋白表达，融合蛋白呈弥散性分布于细胞浆中。呈弥散性分布于细胞浆中。以以NP和和M2 基因为靶序列，设计合成了五个基因为靶序列，设计合成了五个siRNA，并构建了各自的表并构建了各自的表达质粒。达质粒。将将siRNA表表达达质质粒粒分分别别与与对对应应的的pCDM-NP和和pCDM-M2共共转转染染
31、HeLa细细胞胞后后，通通过过荧荧光光观观察察、流流式式细细胞胞、半半定定量量RT-PCR和和Western blot等等方方法法检检测测证证实实，针针对对NP基基因因设设计计的的2个个siRNA均均对对NP基基因因的的转转录录和和表表达达产产生生了了显显著著的的抑抑制制作作用用，针针对对M2基基因因设设计计的的3个个siRNA也也均均对对M2基基因因的的转转录和表达产生了显著的抑制作用。录和表达产生了显著的抑制作用。2.5 结结 论论设设计计的的siRNA抑抑制制流流感感病病毒毒（H5N1，H9N2，H1N1）在在MDCK细细胞胞上上的的复复制制，其其中中pSCMV- M48和和 pSCMV
32、- NP1383对流感病毒复制的抑制作用最强。对流感病毒复制的抑制作用最强。设计的设计的siRNA导入小鼠体内能有效降低导入小鼠体内能有效降低H5N1，H9N2，H1N1流感病毒感染小鼠的肺病毒滴度，流感病毒感染小鼠的肺病毒滴度，pSCMV- M48和和 pSCMV- NP1383联合使用时，攻毒小鼠体重减轻幅度较对联合使用时，攻毒小鼠体重减轻幅度较对照组小，且能部分保护小鼠遭受致死性流感病毒的攻击。照组小，且能部分保护小鼠遭受致死性流感病毒的攻击。 3 H5N1亚型禽流感病毒亚型禽流感病毒A/chicken/Hubei/327/2004全基因组克隆、测序及其感染性克隆的构建全基因组克隆、测序
33、及其感染性克隆的构建 3.1 3.1 研究目的和意义研究目的和意义研究目的和意义研究目的和意义v本研究针对本研究针对20042004年春禽流感爆发流行期间在湖北省家禽感染年春禽流感爆发流行期间在湖北省家禽感染病料中分离出的一株病料中分离出的一株H5N1H5N1禽流感病毒，对其全基因组进行克禽流感病毒，对其全基因组进行克隆、测序及遗传进化分析，根据基因核苷酸序列绘制出了隆、测序及遗传进化分析，根据基因核苷酸序列绘制出了H5N1H5N1亚型禽流感病毒基因组系统发育进化树。亚型禽流感病毒基因组系统发育进化树。v目的是揭示目的是揭示H5N1H5N1禽流感病毒湖北分离株与其它流感病毒流行禽流感病毒湖北分
34、离株与其它流感病毒流行株间的亲缘关系及遗传演化规律，为高致病性禽流感的预测、株间的亲缘关系及遗传演化规律，为高致病性禽流感的预测、监控、防制提供有力的证据监控、防制提供有力的证据。研究目的和意义研究目的和意义v反向遗传操作技术发展到现在，实现了使用完全以质粒为反向遗传操作技术发展到现在，实现了使用完全以质粒为基础的操作系统，因此可以对病毒基因组方便地操作，显基础的操作系统，因此可以对病毒基因组方便地操作，显示了良好的应用前景。示了良好的应用前景。v病毒的反向遗传操作技术在深入阐明病毒的生活周期和致病毒的反向遗传操作技术在深入阐明病毒的生活周期和致病性、基因组的结构与功能、研制基因修饰的疫苗候选
35、株、病性、基因组的结构与功能、研制基因修饰的疫苗候选株、发展病毒载体等方面可以广泛地应用。发展病毒载体等方面可以广泛地应用。研究目的和意义研究目的和意义3.2 3.2 3.2 3.2 研究内容研究内容研究内容研究内容vH5N1亚亚型型禽禽流流感感病病毒毒A/chicken/Hubei/327/2004全全基因组克隆、测序基因组克隆、测序及遗传进化分析及遗传进化分析v用于流感病毒拯救的八个转染用质粒的构建用于流感病毒拯救的八个转染用质粒的构建vH5N1亚型禽流感病毒亚型禽流感病毒湖北分离株湖北分离株的体外拯救的体外拯救v拯救病毒的鉴定拯救病毒的鉴定研究内容研究内容3.3 3.3 3.3 3.3
36、结果与分析结果与分析结果与分析结果与分析基因组八个片段的基因组八个片段的PCR扩增结果扩增结果H5N1亚型禽流感病毒基因序列及遗传进化分析亚型禽流感病毒基因序列及遗传进化分析H5N1亚型禽流感病毒基因序列及遗传进化分析亚型禽流感病毒基因序列及遗传进化分析H5N1亚型禽流感病毒基因序列及遗传进化分析亚型禽流感病毒基因序列及遗传进化分析全基因组的亚克隆及八质粒转染系统的构建全基因组的亚克隆及八质粒转染系统的构建BsmBI & BsaI流流感感病病毒毒的的拯拯救救SPFSPF鸡胚增殖鸡胚增殖拯救病毒在拯救病毒在SPFSPF鸡胚中增殖鸡胚中增殖不同代次的血凝价不同代次的血凝价 结果与分析结果与分析1,
37、51,5：The The NO.1 NO.1 generation generation virus titersvirus titers2,62,6：The The NO.2 NO.2 generation generation virus titersvirus titers3,73,7：The The NO.3 NO.3 generation generation virus titersvirus titers4,84,8：Negative controlNegative control获救病毒和野毒对获救病毒和野毒对MDCKMDCK细胞病变的比较细胞病变的比较 结果与分析结果与分析原
38、始野毒在原始野毒在MDCK细胞上形成的病变细胞上形成的病变拯救病毒在拯救病毒在MDCK细胞上形成的病变细胞上形成的病变正常的正常的MDCK细胞对照细胞对照RT-PCRRT-PCR扩增鉴定拯救病毒扩增鉴定拯救病毒 结果与分析结果与分析1 DNA marker (DL15000)2 RT-PCR product of PB2 gene3 RT-PCR product of PB1 gene4 RT-PCR product of PA gene5 RT-PCR product of HA gene6 RT-PCR product of NP gene7 RT-PCR product of NA ge
39、ne8 RT-PCR product of M gene9 RT-PCR product of NS gene拯救病毒的电镜观察结果拯救病毒的电镜观察结果 结果与分析结果与分析A：放大倍数为放大倍数为10万倍万倍 B：放大倍数为放大倍数为20万倍万倍 C：放大倍数为放大倍数为80万倍万倍Note：病毒病毒呈呈圆形或椭圆形，直径在圆形或椭圆形，直径在100100nmnm左右，病毒有囊膜，且病毒左右，病毒有囊膜，且病毒表面呈现出明显的冠状结构表面呈现出明显的冠状结构, ,具有典型的流感病毒的形态特征，具有典型的流感病毒的形态特征，电镜观电镜观察结果证实了流感病毒的拯救。察结果证实了流感病毒的拯救。
40、3.4 3.4 讨讨 论论讨论讨论八质粒拯救系统八质粒拯救系统 八质粒系统大大减少了转染质粒数目，实现了在同一个载八质粒系统大大减少了转染质粒数目，实现了在同一个载体上既控制体上既控制vRNA的转录，也控制的转录，也控制mRNA的合成。操作更加的合成。操作更加方便，效率更高。方便，效率更高。Hoffmann等（等（2000）在对人源流感病毒）在对人源流感病毒WSN进行拯救时，进行拯救时，每毫升转染上清能产生每毫升转染上清能产生8107个的感染性病毒粒子，这样的个的感染性病毒粒子，这样的效率在所有负链效率在所有负链RNA病毒的拯救中都是最高的。病毒的拯救中都是最高的。 由于质粒由于质粒pHW20
41、00的启动子是人源化，因而其用于禽源流的启动子是人源化，因而其用于禽源流感病毒的拯救效率就大大降低。因而，本试验完成的感病毒的拯救效率就大大降低。因而，本试验完成的H5N1H5N1禽流感病毒的拯救就显得尤为不易。禽流感病毒的拯救就显得尤为不易。讨论讨论基因序列的准确性基因序列的准确性 获得准确可靠的获得准确可靠的cDNA序列是流感病毒拯救的前提。序列是流感病毒拯救的前提。本研究使用高保真本研究使用高保真DNA聚合酶进行基因扩增，而每个聚合酶进行基因扩增，而每个阳性克隆送阳性克隆送3-5个进行测序，并将测序结果同个进行测序，并将测序结果同GenBank中收录的序列进行比较，从而确定一个序列比较可
42、靠中收录的序列进行比较，从而确定一个序列比较可靠的阳性克隆。的阳性克隆。这些操作尽可能地减少了这些操作尽可能地减少了PCR引入的突变，这样所获引入的突变，这样所获得的得的cDNA克隆在序列上较为可靠。克隆在序列上较为可靠。讨论讨论影响流感病毒拯救效率的因素影响流感病毒拯救效率的因素 由于八质粒转染系统需要将八个质粒转入同一个细胞，由于八质粒转染系统需要将八个质粒转入同一个细胞，这无疑对转染用质粒的纯度有较高的要求这无疑对转染用质粒的纯度有较高的要求。 转染细胞的活力也是影响拯救效率的关键因素。只有高转染细胞的活力也是影响拯救效率的关键因素。只有高活力的细胞才能提供足够量的活力的细胞才能提供足够
43、量的RNARNA聚合酶聚合酶polIpolI，polIIpolII，从而启动病毒的包装机制。从而启动病毒的包装机制。讨论讨论影响流感病毒拯救效率的因素影响流感病毒拯救效率的因素 基因的组成也可能影响拯救效率。我们依靠质粒和细胞机基因的组成也可能影响拯救效率。我们依靠质粒和细胞机制产生有感染性的病毒，无法完全模拟自然状况下的病毒制产生有感染性的病毒，无法完全模拟自然状况下的病毒复制，如质粒的比例和组成不适合，可能影响在细胞核内复制，如质粒的比例和组成不适合，可能影响在细胞核内的有效转录和复制。的有效转录和复制。流感病毒对温度异常敏感，控制好转染后的收毒时间也是流感病毒对温度异常敏感，控制好转染后
44、的收毒时间也是非常重要的，若太早，可能拯救的病毒太少，而太晚则会非常重要的，若太早，可能拯救的病毒太少，而太晚则会造成已经拯救出的病毒死亡，因而，根据细胞状态控制好造成已经拯救出的病毒死亡，因而，根据细胞状态控制好最佳的收毒时间是提高病毒拯救的关键。最佳的收毒时间是提高病毒拯救的关键。讨论讨论3.5 3.5 结结 论论 本实验通过本实验通过RT-PCR方法并采用高保真方法并采用高保真DNA聚合酶扩增，聚合酶扩增，获得了获得了湖北分离株较为可靠的全基因组序列湖北分离株较为可靠的全基因组序列，全基因组序全基因组序列列被被GenBank收录，登录收录，登录号为号为AY684703-AY684710。
45、序列分析表明序列分析表明，HA基因裂解位点氨基酸序列符合基因裂解位点氨基酸序列符合HPAIV的特征，的特征，在在NA基因茎部和基因茎部和NS基因中分别存在基因中分别存在20个和个和5个氨个氨基酸的缺失。基酸的缺失。在内部基因在内部基因PB2、PA、NP和和M特定位点的氨基酸残基与特定位点的氨基酸残基与 H5N1/2000-2003，H5N1/Thailand/2004和和H5N1/Vietnam/2004相同，而与相同，而与H5N1/97毒株在相应位置毒株在相应位置氨基酸残基差异较大。氨基酸残基差异较大。 结论毒株毒株A/chicken/Hubei/327/2004在基因组序列上同毒株在基因组
46、序列上同毒株A/Chicken/Hong Kong/61.9/02 （H5N1）的同源性最高，的同源性最高，可能由该毒株进化而来。可能由该毒株进化而来。本研究通过不断地优化实验条件，对反向遗传技术每个环本研究通过不断地优化实验条件，对反向遗传技术每个环节进行科学的、严谨的设计和摸索，完成了节进行科学的、严谨的设计和摸索，完成了H5N1亚型禽流亚型禽流感病毒中国分离株感病毒中国分离株A/chicken/Hubei/327/2004的体外拯救，的体外拯救，使流感病毒基因组的体外操作成为可能，为最终研究流感使流感病毒基因组的体外操作成为可能，为最终研究流感病毒的分子致病机制、开发新型流感疫苗奠定了坚实的基病毒的分子致病机制、开发新型流感疫苗奠定了坚实的基础。础。 结论结论敬请各位提出宝贵意见！敬请各位提出宝贵意见！谢谢 谢谢!
