《化学发光免疫分析技术》由会员分享，可在线阅读，更多相关《化学发光免疫分析技术（46页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、化学化学发光免疫分析技光免疫分析技术第十章第十章化学化学发光免疫光免疫分析技分析技术第一第一节 慨慨述述一、化学一、化学发光光二、化学二、化学发光效率光效率第二第二节 化学化学发光光剂和和标记技技术一、化学一、化学发光光剂二、二、发光光剂的的标记技技术第三第三节 化学化学发光免疫分析的光免疫分析的类型型一、直接化学一、直接化学发光免疫分析光免疫分析二、化学二、化学发光光酶免疫分析免疫分析三、三、电化学化学发光免疫分析光免疫分析四、四、临床床应用用思考思考题小小结发光免疫分析光免疫分析: :是将是将发光分析和免疫反光分析和免疫反应相相结合而建立起来的一种新的合而建立起来的一种新的检测微量抗原或抗
2、体的新型微量抗原或抗体的新型标记免疫分析免疫分析技技术。第一第一节概概 述述放放射射免免疫疫技技术酶免免疫疫技技术发光光免免疫疫技技术三大三大经典典标记技技术发光光: :是指分子或原子中的是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基子吸收能量后，由基态（较低能低能级）跃迁到激迁到激发态（较高能高能级），然后再返回），然后再返回到基到基态，并，并释放光子的放光子的过程。程。根据形成激根据形成激发态分子的能量来源不同可分分子的能量来源不同可分为: :光照光照发光、生物光、生物发光、光、化学化学发光光等。等。 光照光照发光光（photoluminescence）是指是指发光光剂（荧光素）光素）经短波短波长
3、的入射光照射后，的入射光照射后，电子吸收能量子吸收能量跃迁到激迁到激发态，在其回复至基，在其回复至基态时，发射出射出较长波波长的可的可见光（光（荧光）。光）。 生物生物发光光（bioluminescence）是指是指发生在生生在生物体内的物体内的发光光现象，如象，如萤火虫的火虫的发光，反光，反应底物底物为萤火虫火虫荧光素，在光素，在荧光素光素酶的催化下，利用的催化下，利用ATPATP能，生成激能，生成激发态氧化型氧化型荧光素，它在回复基光素，它在回复基态时多余的能量以光子的形式多余的能量以光子的形式释放出来。放出来。 化学化学发光光（chemiluminescence）是指伴随化学是指伴随化学
4、反反应过程所程所产生的光的生的光的发射射现象。某些物象。某些物质( (发光光剂) )在化学反在化学反应时，吸收了反，吸收了反应过程中所程中所产生的化学能生的化学能，使反，使反应的的产物分子或反物分子或反应的中的中间态分子中的分子中的电子子跃迁到激迁到激发态，当，当电子从激子从激发态回复到基回复到基态时，以，以发射光子的形式射光子的形式释放出能量，放出能量，这一一现象称象称为化学化学发光。光。一、化学一、化学发光光一些化学反一些化学反应能能释放足放足够的能量把参加反的能量把参加反应的物的物质激激发到能到能发射光的射光的电子激子激发态，若被激若被激发的是一个反的是一个反应产物物分子，分子，则这种反
5、种反应过程叫直程叫直接化学接化学发光。反光。反应过程可程可简单地描述如下：地描述如下：AA十十BC*BC*C*CC*Chh其中其中为光子，光子，C*C*表示表示C C处于于单线激激发态。若激若激发能能传递到另一个未参加化学反到另一个未参加化学反应的分子的分子D D上，使上，使D D分子激分子激发到到电子激子激发态，D D分子从激分子从激发态回到基回到基态时发光，光，这种种过程叫程叫间接化学接化学发光。反光。反应过程可表示如下：程可表示如下：AA十十BCBC* *CC* *十十DCDC十十D D* *DD* *DD十十hh化学化学发光效率决定于生成激光效率决定于生成激发态产物分子的化物分子的化学
6、激学激发效率（效率（CE）和激）和激发态分子的分子的发射效率射效率（EM）。）。化学化学发光反光反应的的发光效率、光光效率、光辐射的射的能量大小以及光能量大小以及光谱范范围，完全由，完全由发光物光物质的性的性质所所决定，每一个决定，每一个发光反光反应都具有其特征性的化学都具有其特征性的化学发光光光光谱和不同的化学和不同的化学发光效率。光效率。二、化学二、化学发光效率光效率第二第二节化学化学发光光剂和和标记技技术在化学在化学发光反光反应中参与能量中参与能量转移并最移并最终以以发射光子的形式射光子的形式释放能量的化合物，称放能量的化合物，称为化学化学发光光剂或或发光底物。光底物。 一、化学一、化学
7、发光光剂能作能作为化学化学发光光剂的条件：的条件：发光的量子光的量子产率高；率高；它的物理它的物理- -化学特性要与被化学特性要与被标记或或测定的定的物物质相匹配；相匹配；能与抗原或抗体形成能与抗原或抗体形成稳定的偶定的偶联结合物；合物； 其化学其化学发光常是氧化反光常是氧化反应的的结果；果；在所使用的在所使用的浓度范度范围内内对生物体没有毒性。生物体没有毒性。直接化学直接化学发光光剂 直接化学直接化学发光光剂在在发光免疫分析光免疫分析过程中不需程中不需酶的催化作用，直接参与的催化作用，直接参与发光反光反应，它，它们在在化学化学结构上有构上有产生生发光的特有基光的特有基团，可直接，可直接标记抗
8、原或抗体。抗原或抗体。1.1.吖啶酯在碱性条件下被在碱性条件下被H H2 2O O2 2氧化氧化时, ,发出波出波长为470nm470nm的光，具有很高的的光，具有很高的发光效率，其激光效率，其激发态产物物N-N-甲基甲基吖啶酮是是该发光反光反应体系的体系的发光体。光体。 2 2三三联吡吡啶钌三三联吡吡啶钌RU(bpy)3RU(bpy)32+2+是是电化学化学发光光剂，它和，它和电子供体三丙胺（子供体三丙胺（TPATPA）在阳在阳电极表面可同极表面可同时失去一个失去一个电子而子而发生氧化生氧化反反应。 三联吡啶钌三联吡啶钌电化学发光剂反应原理电化学发光剂反应原理 酶促反促反应发光光剂：是利用是
9、利用标记酶的催化作用，使的催化作用，使发光光剂（底（底 物）物）发光，光，这一一类需需酶催化后催化后发光的光的发光光剂 称称为酶促反促反应发光光剂。1鲁米米诺及其衍生物及其衍生物 2AMPPD1 1鲁米米诺鲁米米诺发光原理光原理鲁米米诺增增强发光反光反应原理原理 2AMPPD3-(2-3-(2-螺旋金螺旋金刚烷)-4-)-4-甲氧基甲氧基-4-(3“-4-(3“-磷磷酰氧基氧基) )苯苯-1,2-1,2-二氧二氧杂环丁丁烷1.1.碳二碳二亚胺（胺（EDCEDC）缩合法合法 二、二、发光光剂的的标记技技术2.2.过碘酸碘酸钠氧化法氧化法 3 3重氮重氮盐偶偶联法法 4.N-4.N-羟基琥珀基琥珀
10、酰亚胺活化法胺活化法 1 1发光光剂的的选择 22被被标记蛋白蛋白质的性的性质 33标记方法的方法的选择 44原料比原料比 55标记率率 66温度温度 77纯化与保存化与保存 影响影响标记的因素的因素第三第三节化学化学发光免疫分析的光免疫分析的类型型用用吖啶酯直接直接标记抗体抗体( (抗原抗原) )，与待，与待测标本中相本中相应的抗的抗原原( (抗体抗体) )发生免疫反生免疫反应后，形成固相包被抗体后，形成固相包被抗体- -待待测抗原抗原- -吖啶酯标记抗体复合物，抗体复合物，这时只需加入氧化只需加入氧化剂（H H2 2O O2 2）和）和NaOHNaOH使成碱性使成碱性环境，境，吖啶酯在不需
11、要催化在不需要催化剂的情况下分解、的情况下分解、发光光 。由集光器和光由集光器和光电倍增管接收、倍增管接收、记录单位位时间内所内所产生的生的光子能，光子能，这部分光的部分光的积分与待分与待测抗原的量成正比，可从抗原的量成正比，可从标准准曲曲线上上计算出待算出待测抗原的含量。抗原的含量。一、直接化学一、直接化学发光免疫分析光免疫分析发光发光Y Y Y YY Y磁微粒磁微粒被测抗原被测抗原+抗体抗体+带丫啶酯带丫啶酯标记物抗标记物抗体体Y YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY Y冲洗后冲洗后-夹心法心法（1 1）加入加入H H2 2O O2 2（pH10）直接化学直接化学发光
12、的机理光的机理磁磁微粒模式微粒模式图图Y YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY Y特点特点抗原和抗体抗原和抗体结合与未合与未结结合部分的易分离合部分的易分离磁微粒技磁微粒技术术化学化学发光光酶免疫分析免疫分析（chemiluminescenceenzymeimmunoassay，CLEIA）是用参与催化某一化学）是用参与催化某一化学发光反光反应的的酶如辣根如辣根过氧化物氧化物酶（HRP）或碱性磷酸或碱性磷酸酶(ALP)(ALP)来
13、来标记抗原或抗抗原或抗体，在与待体，在与待测标本中相本中相应的抗原的抗原( (抗体抗体) )发生免疫反生免疫反应后，形成后，形成固相包被抗体固相包被抗体- -待待测抗原抗原- -酶标记抗体复合物，抗体复合物，经洗洗涤后，加入后，加入底物底物( (发光光剂) )，酶催化和分解底物催化和分解底物发光，由光量子光，由光量子阅读系系统接接收，光收，光电倍增管将光信号倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它信号并加以放大，再把它们传送至送至计算机数据算机数据处理系理系统，计算出算出测定物的定物的浓度。度。二、化学二、化学发光光酶免疫分析免疫分析该分析系分析系统采用辣根采用辣根过氧化物氧化物酶（HRP
14、）标记抗体抗体(或抗原或抗原)，在与反，在与反应体系中的待体系中的待测标本和固相本和固相载体体发生免疫反生免疫反应后，形成固相包后，形成固相包被抗体被抗体-待待测抗原抗原-酶（HRP）标记抗体复合抗体复合物，物，这时加入加入鲁米米诺发光光剂、H2O2和化学和化学发光增光增强剂使使产生化学生化学发光。光。 辣根辣根过氧化物氧化物酶标记的化学的化学发光免疫分析光免疫分析辣根辣根过氧化物氧化物酶标记化学化学发光免疫分析示意光免疫分析示意图 该分析系分析系统以碱性磷酸以碱性磷酸酶标记抗体抗体(或抗原或抗原)，在与反，在与反应体系中的待体系中的待测标本和固相本和固相载体体发生免疫反生免疫反应后，形成固相
15、包被抗体后，形成固相包被抗体-待待测抗原抗原-酶标记抗体复合物，抗体复合物，这时加入加入AMPPD发光光剂，碱性磷酸，碱性磷酸酶使使AMPPD脱去磷酸根基脱去磷酸根基团而而发光。光。 碱性磷酸碱性磷酸酶标记的化学的化学发光免疫分析光免疫分析碱性磷酸碱性磷酸酶标记化学化学发光免疫分析示意光免疫分析示意图 分析步骤分配样品分配样品,磁颗粒磁颗粒和试剂和试剂孵育孵育使反应物使反应物结合结合在磁场中在磁场中清洗去除清洗去除未结合物质未结合物质加入加入底物底物产生产生信号信号孵育孵育,促使信号促使信号的产生的产生信号信号检测检测电化学化学发光免疫分析光免疫分析（electrochemiluminesce
16、nceimmunoassay，ECLIA）是以是以电化学化学发光光剂三三联吡吡啶钌标记 抗体抗体( (抗原抗原) )，以三丙胺，以三丙胺(TPA)(TPA)为电子供体，子供体， 在在电场中因中因电子子转移而移而发生特异性化学生特异性化学发光光 反反应，它包括，它包括电化学和化学化学和化学发光两个光两个过程。程。三、三、电化学化学发光免疫分析光免疫分析在在电化学化学发光免疫分析系光免疫分析系统中，磁性微粒中，磁性微粒为固相固相载体体包被抗体包被抗体( (抗原抗原) )，用三，用三联吡吡啶钌标记抗体抗体( (抗原抗原) )，在，在反反应体系内待体系内待测标本与相本与相应的抗原的抗原(抗体抗体) )
17、发生免疫反生免疫反应后，形成磁性微粒包被抗体后，形成磁性微粒包被抗体- -待待测抗原抗原- -三三联吡吡啶钌标记抗体复合物，抗体复合物，这时将上述复合物吸入流将上述复合物吸入流动室，同室，同时引人引人TPATPA缓冲液。当磁性微粒流冲液。当磁性微粒流经电极表面极表面时，被安，被安装在装在电极下面的极下面的电磁磁铁吸引住，而未吸引住，而未结合的合的标记抗体抗体和和标本被本被缓冲液冲走。与此同冲液冲走。与此同时电极加极加压，启，启动电化化学学发光反光反应，使三，使三联吡吡啶钌和和TPATPA在在电极表面极表面进行行电子子转移，移，产生生电化学化学发光，光的光，光的强度与待度与待测抗原的抗原的浓度度
18、成正比。成正比。电化学化学发光免疫分析示意光免疫分析示意图电化学化学发光免疫光免疫测定示意定示意图标记磁磁颗粒在粒在电场中中发光工作示意光工作示意图1.1.甲状腺激素甲状腺激素22生殖激素生殖激素33垂体激素和皮垂体激素和皮质激素激素44贫血因子血因子55肿瘤瘤标志物志物 66感染性疾病感染性疾病77糖尿病糖尿病胰胰岛素、血清素、血清C-C-肽、血、血浆胰高糖素等。胰高糖素等。88心心脏标志物志物99病毒病毒标记物物1010过敏性疾病敏性疾病1111治治疗药物物监测四、四、临床床应用用1 1什么是什么是发光免疫分析？什么是化学光免疫分析？什么是化学发光免疫分析？光免疫分析？2 2化学化学发光与
19、光与荧光的区光的区别？化学？化学发光反光反应的条件？的条件？3 3什么叫化学什么叫化学发光光剂？化学？化学发光光剂必必须具具备那些条件？那些条件？4 4吖啶酯化学化学发光的原理和特点是什么？光的原理和特点是什么？5 5酶促反促反应的的发光光剂有哪些？其有哪些？其发光原理和特点是？光原理和特点是？6 6三三联吡吡啶钌发光的原理和特点是什么？光的原理和特点是什么？7 7三丙胺在三丙胺在电化学化学发光中起什么作用？光中起什么作用？8.8.发光光剂的的标记有那些方法？影响因素有那些？有那些方法？影响因素有那些？9 9什么是直接化学什么是直接化学发光免疫分析？其特点是什么？光免疫分析？其特点是什么？10
20、10什么是化学什么是化学发光光酶免疫分析？其特点是什么？免疫分析？其特点是什么？思考思考题发光是指分子或原子中的光是指分子或原子中的电子吸收能量后，由子吸收能量后，由基基态跃迁到激迁到激发态，然后再返回到基，然后再返回到基态，并，并释放光子的放光子的过程。化学程。化学发光是吸收了化学反光是吸收了化学反应过程中所程中所产生的化学能使分子激生的化学能使分子激发而而发光。化学光。化学发光免疫分析是将化学光免疫分析是将化学发光与免疫反光与免疫反应相相结合，合，用于用于检测微量抗原或抗体的微量抗原或抗体的标记免疫分析技免疫分析技术，分分为直接化学直接化学发光免疫分析，化学光免疫分析，化学发光光酶免疫免疫分析和分析和电化学化学发光免疫分析。光免疫分析。小小 结
