生化检验技术基础课件

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1、生化检验技术基础与进展 生化检验技术基础生化检验技术基础一、比色分析1 1 1 1比色分析理论比色分析理论比色分析理论比色分析理论Beer-Lambert Beer-Lambert Beer-Lambert Beer-Lambert 定律定律定律定律 A = lg A = lg A = lg A = lg（I I I I0 0 0 0/I/I/I/I）KCL KCL KCL KCL 或或或或 I I I II I I I0 0 0 010101010-KCL-KCL-KCL-KCL I I I I0 0 0 0：入射光强度：入射光强度：入射光强度：入射光强度 I I I I：透过光强度：透过光

2、强度：透过光强度：透过光强度 K K K K：常数：常数：常数：常数 C C C C：溶液浓度：溶液浓度：溶液浓度：溶液浓度 L L L L：溶液的厚度：溶液的厚度：溶液的厚度：溶液的厚度生化检验技术基础生化检验技术基础（1 1）郎伯定律）郎伯定律 I I00IIt tllLL-dIIdl，-dIaIdl，dI/I=-adl积分积分IIttLLdI/IdI/I-adl-adl得：得：ln(Iln(I0 0/I/It t) )-aL-aLII000 0将将lnln改为改为lglg，则为：，则为：lglg（I I0 0/I/It t）-0.434aL-0.434aLKLKL令令lglg（I I0

3、0/I/It t） A A，则，则A AKLKL生化检验技术基础生化检验技术基础（2 2）比尔定律）比尔定律 A AK”CK”C（3 3）郎伯）郎伯- -比尔定律比尔定律 A AKLCKLC生化检验技术基础生化检验技术基础透光率（透光率（transmittancetransmittance，T T，透射率），透射率） T TI / II / I0 0吸光度（吸光度（absorbanceabsorbance，A A）光密度（光密度（eptical densityeptical density，D D或或ODOD） A Alg Ilg I0 0/I/I-lgT-lgT T T1010-A-A101

4、0-KCL-KCL A AKCLKCL当当L L用用cmcm，C C用用mol/Lmol/L表示，则表示，则K K即称之为摩即称之为摩尔吸光系数，用尔吸光系数，用表示。表示。当当C C1mol/L1mol/L，L L1cm1cm，则，则A A。生化检验技术基础生化检验技术基础T T与与A A的关系的关系透光率（透光率（透光率（透光率（T T） 吸光度（吸光度（吸光度（吸光度（A A）10.00010.0000.750.1250.750.1250.50.3010.50.3010.250.6020.250.6020.170.7700.170.7700.11.0000.11.0000.051.301

5、0.051.3010.012.0000.012.0000.0013.0000.0013.000生化检验技术基础生化检验技术基础2 2影响因素影响因素（1 1）化学因素的影响）化学因素的影响 溶溶液液中中溶溶质质可可因因浓浓度度的的改改变变而而发发生生离离解解、缔缔合合，与与溶溶剂剂间间的的作作用用等等原原因因而而出出现现偏偏离离比比尔尔定定律律的的现现象象。由由化化学学因因素素引引起起的的偏偏离离，有有时时可可控控制制溶溶液液条条件件设设法法减减免免。此此外外，能能产产生生荧荧光光的的物物质质也也可可导导致偏离比尔定律。致偏离比尔定律。生化检验技术基础生化检验技术基础（2 2）非单色光的影响）

6、非单色光的影响 比比尔尔定定律律的的一一个个重重要要条条件件是是单单色色光光，但但在在比比色色分分析析中中常常有有不不同同波波长长的的光光同同时时存存在在。这这就就使使吸吸光光度度发发生生改改变变，从从而而偏偏离比尔定律。离比尔定律。生化检验技术基础生化检验技术基础波长的选择可见绿色带黄深黄桔红深红深紫青紫紫蓝蓝色带绿绿色带蓝深绿Ultra-violet紫外200400深紫深红桔红深黄绿色带黄暗绿绿色带蓝蓝色带绿紫蓝青紫被测溶液颜色颜色750800610750595610560580580595500560490500480490435480400435波长(nm)生化检验技术基础生化检验技术

7、基础（3 3）光学因素的影响）光学因素的影响 散散射射是是向向空空间间各各个个方方向向，而而使使透透射射光光减减弱弱。反反射射可可使使光光能能损损失失，当当光光线线通通过过两两种种不不同同介介质质时时，则则发发生生反反射射。当当样样本本溶溶液液与与空空白白溶溶液液的的折折射射率率有有较较大大差差异异时，导致吸收值的偏差。时，导致吸收值的偏差。（4 4）非非平平行行光光通通过过吸吸收收池池时时，由由于于光光线线的的倾斜使厚度倾斜使厚度L L增大而影响测量值。增大而影响测量值。生化检验技术基础生化检验技术基础3 3比色法的误差比色法的误差（1 1）仪器误差）仪器误差 滤滤光光片片，狭狭缝缝过过宽宽

8、，光光电电池池疲疲劳劳，仪器结构，散热不良。仪器结构，散热不良。（2 2）方法误差）方法误差 （3 3）操作误差）操作误差生化检验技术基础生化检验技术基础比色法举例1. 1. 总蛋白总蛋白(TP)(TP)蛋白质中的肽键+Cu 2+ 碱性条件 紫红色络合物引起在波长540560nm范围内吸光度的上升, 与总蛋白含量成正比2. 2. 白蛋白白蛋白(ALB)(ALB)白蛋白+溴甲酚绿 pH4.2 白蛋白溴甲酚绿复合物引起在波长630nm范围内吸光度的上升, 与白蛋白含量成正比生化检验技术基础生化检验技术基础二、分光光度计1 1光源光源热光源热光源: : 钨灯、卤钨灯（钨灯、卤钨灯（320320250

9、0nm2500nm）气体放电光源：气体放电光源： 氢灯、氘灯（氢灯、氘灯（185185375nm375nm）。）。 氘氘灯灯发发光光强强度度比比氢氢灯灯强强3 35 5倍倍，是是目目前前紫外光区常用光源。紫外光区常用光源。 生化检验技术基础生化检验技术基础 2. 2. 单色器单色器 单单色色器器是是一一种种用用来来把把光光源源发发出出的的复复合合光光分分解解成成单单色色光光，并并能能任任意意改改变变所所需需波波长长的的装装置。置。 (1)(1)棱镜棱镜 玻玻璃璃棱棱镜镜的的折折射射率率大大、色色散散能能力力也也大大，因因而而分分辨辨本本领领高高。但但它它吸吸收收紫紫外外光光，因因此此只只适用于

10、适用于3503503000nm3000nm的波长范围。的波长范围。 石石英英棱棱镜镜对对紫紫外外光光吸吸收收少少，适适用用于于195-195-4000nm4000nm间间分分光光。但但由由于于石石英英棱棱镜镜折折射射率率低低于于玻璃，因而色散能力差。玻璃，因而色散能力差。生化检验技术基础生化检验技术基础 (2)(2)光栅光栅 光光栅栅是是利利用用光光的的衍衍射射、干干涉涉原原理理制制成成的的色色散散元元件件。目目前前，全全息息光光栅栅在在质质量量上上，成成本本上上都都大大大大优优于于机机械械光光栅栅。因因光光栅栅分分光光在在紫紫外外和和可可见见光光区区均均适适用用，且且色色散散力力强强、分分辨

11、辨率率高高，故故近近年年生生产产的的分分光光光光度度计计大大都都采采用用光光栅栅作作单单色器。色器。生化检验技术基础生化检验技术基础3 3比色杯比色杯 比比色色杯杯可可由由玻玻璃璃和和石石英英等等材材料料制制成成，玻玻璃璃适适用用于于350nm350nm以以上上光光区区，而而石石英英杯杯则适用于紫外和可见光区。则适用于紫外和可见光区。生化检验技术基础生化检验技术基础4 4检测器检测器 在在分分光光光光度度计计中中，把把光光信信号号转转变成电信号输出的装置称检测器。变成电信号输出的装置称检测器。 光电池光电池 光电管光电管 光电倍增管光电倍增管 生化检验技术基础生化检验技术基础双波长分光光度计

12、来自光源的光被两个单色器分别分离出来自光源的光被两个单色器分别分离出波长为波长为1 1和和2 2的两束单色光。经过折波的两束单色光。经过折波器后，两束波长不同的单色光交替地照射器后，两束波长不同的单色光交替地照射于同一样品杯。样品杯背后的光电倍增管于同一样品杯。样品杯背后的光电倍增管交替地接收到两种波长照射吸收池后所产交替地接收到两种波长照射吸收池后所产生的信号。此信号经电子电路转化为两个生的信号。此信号经电子电路转化为两个吸光度之差吸光度之差AA。生化检验技术基础生化检验技术基础三、酶法分析 酶法分析包括两方面的内容：酶法分析包括两方面的内容： 借借助助酶酶来来测测定定某某一一化化合合物物的

13、的浓浓度度，如如测测定定体体液液中中的的葡葡萄萄糖糖、甘甘油油三三酯酯、胆胆固醇、尿素、尿酸、肌酐等。固醇、尿素、尿酸、肌酐等。 借借助助酶酶来来测测定定另另一一种种酶酶的的活活性性，实实际际上上是是用用酶酶来来测测定定待待测测酶酶的的产产物物，如如转氨酶、肌酸激酶、淀粉酶等。转氨酶、肌酸激酶、淀粉酶等。生化检验技术基础生化检验技术基础葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖O O2 2H H2 2OO葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶 葡萄糖酸葡萄糖酸H H2 2O O2 2H H2 2O O2 2苯酚苯酚4-4-氨基安替比林氨基安替比林 过氧化物酶过氧化物酶 醌亚胺醌亚胺H H2 2O O尿素尿素尿素尿素H H2

14、2OO脲酶脲酶2NH2NH4 4+ +COCO2 2NHNH4 4+ +-酮戊二酸酮戊二酸NADHNADH谷氨酸脱氢酶谷氨酸脱氢酶 谷氨酸谷氨酸NADNAD+ +H H2 2O O生化检验技术基础生化检验技术基础肌酸激酶（肌酸激酶（CK）磷酸肌酸ADPCK肌酸ATP葡萄糖ATPHK葡萄糖-6-磷酸ADP葡萄糖-6-磷酸NADPG6PDH6-磷酸葡萄糖酸NADPHH+丙氨酸氨基转移酶（丙氨酸氨基转移酶（ALTALT）丙氨酸-酮戊二酸ALT丙酮酸谷氨酸丙酮酸NADHH+LDH乳酸NAD+H2O生化检验技术基础生化检验技术基础酶催化特点高度的特异性高催化效率作用条件温和生化检验技术基础生化检验技术基

15、础酶的活性部位底物结合部位催化部位生化检验技术基础生化检验技术基础酶的辅助因子金属离子辅基和辅酶NAD ，NADP生化检验技术基础生化检验技术基础酶的分类1. 氧化还原酶2. 转移酶3. 水解酶4. 裂合酶5. 异构酶6. 合成酶生化检验技术基础生化检验技术基础酶的系统命名应将酶的一种或两种底物以及催化反应的性质明确标明。乳酸脱氢酶 L-乳酸：NAD+氧化还原酶肌酸激酶 ATP：肌酸磷酸转移酶生化检验技术基础生化检验技术基础酶的活性单位一国际单位为在一分钟内催化转变1个微摩尔的反应物的酶量.IUU U/L1Katal为每秒钟转化1mole底物的酶量1国际单位=16.67nKatal1Katal

16、=6107国际单位生化检验技术基础生化检验技术基础酶活性测定影响酶活性测定：底物、激活剂、抑制剂、缓冲液、pH、温度、酶浓度。在最适条件下以求达到最大的反应速度。但由于底物的溶解度低，或售价太高，或需连锁的酶反应，则必须对测定条件作修正。生化检验技术基础生化检验技术基础酶活性测定的最适条件1. 1.合适的底物、辅因子、活化剂、变构剂合适的底物、辅因子、活化剂、变构剂的种类和浓度的种类和浓度2. 2.指示酶和辅助酶的种类和浓度指示酶和辅助酶的种类和浓度3. 3.反应混合液的最适反应混合液的最适pHpH，缓冲液种类和缓冲液种类和浓度浓度4. 4.去除各种抑制剂去除各种抑制剂生化检验技术基础生化检验

17、技术基础酶促反应的两个阶段反应级数反应级数00级级11级级PP1. 1.可可可可逆反应逆反应逆反应逆反应 2. 2.产物抑制产物抑制产物抑制产物抑制 3. 3.酶变性失活酶变性失活酶变性失活酶变性失活v=dP/dtv=dP/dt4. 4.底物底物底物底物不饱和不饱和不饱和不饱和SS时间时间tt生化检验技术基础生化检验技术基础酶反应进程和酶浓度曲线酶量酶量EE401.E401.E越大，越大，线性反线性反产产应期越应期越短短物物2.E2.E相同，相同，SS越小，越小，P20P20线性反线性反应期越短应期越短1010550510152005101520时间时间(min)(min)生化检验技术基础生化

18、检验技术基础酶反应时间曲线时间时间(min)(min)5(t5(t0 0)反应反应时间越短，时间越短，10(t10(t1 1)线性线性范围越大范围越大15(t15(t2 2) )20(t20(t3 3) )010203040010203040酶量酶量EE生化检验技术基础生化检验技术基础米氏方程E + SESE + Pkkkk+1+2-2-1v=VSKm+Sv V2S Km生化检验技术基础生化检验技术基础米氏曲线SVVmaxKmVmax 2KmKm生化检验技术基础生化检验技术基础米氏常数米氏常数米米- -孟氏公式：孟氏公式：v vVmS/(KmVmS/(KmS)S)当当SKmSKmSKm时，则时

19、，则v vVmVm，即反应，即反应速度是一个常数，为零级反应。速度是一个常数，为零级反应。如如SSKmKm时，混合级反应时，混合级反应。生化检验技术基础生化检验技术基础米氏常数的意义如如v v0.5Vm0.5Vm，则，则KmKmSS，KmKm值等于酶促反值等于酶促反应的初速度为最大速度的一半时所需的底应的初速度为最大速度的一半时所需的底物浓度。物浓度。KmKm等于等于ESES的解离常数；而的解离常数；而KmKm的倒数可代表的倒数可代表酶和底物的亲和力。酶和底物的亲和力。KmKm是酶的特征性常数，当是酶的特征性常数，当pHpH、温度和离子、温度和离子强度恒定时，强度恒定时，KmKm只和酶及底物的

20、性质有关，只和酶及底物的性质有关，而与酶浓度无关。而与酶浓度无关。纯度不同的同一种酶，如杂质中没有可使纯度不同的同一种酶，如杂质中没有可使底物发生旁反应的其它酶或酶的激活剂和底物发生旁反应的其它酶或酶的激活剂和抑制剂，则抑制剂，则KmKm的变化不大。的变化不大。生化检验技术基础生化检验技术基础米氏常数的应用（1 1）如已知酶的）如已知酶的KmKm，可计算某一底，可计算某一底物浓度时的物浓度时的v/Vmv/Vm。（2 2）如要求）如要求v v占占VmVm一定的百分比，也一定的百分比，也可算出所需底物浓度为其可算出所需底物浓度为其KmKm的多少的多少倍。倍。（3 3）利用工具酶来测定某一底物的）利

21、用工具酶来测定某一底物的浓度时，可计算工具酶的用量。浓度时，可计算工具酶的用量。生化检验技术基础生化检验技术基础（4 4）测定几个同工酶对同一底物的）测定几个同工酶对同一底物的KmKm，可估计是原级（，可估计是原级（ Km Km常有差异）常有差异）还是次生性同工酶（还是次生性同工酶（ Km Km接近或相接近或相同）。同）。（5 5）测定正逆方向底物的）测定正逆方向底物的KmKm，可大，可大体知道该酶催化哪一方向为主。体知道该酶催化哪一方向为主。（6 6）如已知一组酶中各酶的）如已知一组酶中各酶的KmKm及其及其相应底物的浓度，有助于寻找限速相应底物的浓度，有助于寻找限速步骤。步骤。生化检验技术

22、基础生化检验技术基础Km的求取Lineweaver-Burk作图法作图法 1/v(Km/Vm)(1/S)1/VmEadie-Hofstee作图法作图法 vVmKm(v/S)Eisenthal和和Cornish-Bowden作图法作图法 设设Y轴和轴和X轴分别为求取轴分别为求取Vm及及Km的座的座标，将不同标，将不同S浓度点在浓度点在X轴的负侧；相应的轴的负侧；相应的反应速度点在反应速度点在Y轴上，连接各线，交点在轴上，连接各线，交点在Y轴上的座标为轴上的座标为Vm，在，在X轴上的座标为轴上的座标为Km。生化检验技术基础生化检验技术基础酶活性测定的基本知识 酶酶活活性性是是通通过过测测定定酶酶促

23、促反反应应过过程程中中单单位位时时间间内内底底物物的的减减少少量量或或产产物物的的生生成成量量，即即测测定定酶酶促促反反应应的的速速率率来来获获得得的。的。生化检验技术基础生化检验技术基础（1 1）定时法）定时法 测测定定酶酶反反应应开开始始后后某某一一时时间间内内（t t1 1到到t t2 2）产产物物或或底底物物浓浓度度的的总总变变化化量量来来求求取取酶酶反反应应初速度的方法称为定时法。初速度的方法称为定时法。 产产产产 2 2 2 2 物物物物 3 3 3 3 生生生生 1 1 1 1 成成成成 t t t t1 1 1 1 t t t t2 2 2 2 生化检验技术基础生化检验技术基础

24、（2 2）连续监测法）连续监测法 连连续续测测定定（每每15s15s1min1min监监测测一一次次）酶酶反反应应过过程程中中某某一一反反应应产产物物或或底底物物的的浓浓度度随随时时间间的的变变化化来来求求出出酶酶反反应应初初速速度度的的方方法法称称为为连连续续监监测测法法，又又称称动动力力学学法法或或速速率率法法。这这种种方方法法的的优优点点是是可可将将多多点点的的测测定定结结果果连连接接成成线线，很很易易找找到到成成直直线线的的区区段段，来来计计算算酶活性。此法较为准确。酶活性。此法较为准确。 分为直接连续监测法和间接连续监测法。分为直接连续监测法和间接连续监测法。 法法. .生化检验技术

25、基础生化检验技术基础连续监测法的测定时间吸吸光光度度A3A3A2A2A1A1tt11t t22t t33t t4 4时间时间生化检验技术基础生化检验技术基础（3 3 3 3）平衡法）平衡法）平衡法）平衡法 通通通通过过过过测测测测定定定定酶酶酶酶反反反反应应应应开开开开始始始始至至至至反反反反应应应应达达达达到到到到平平平平衡衡衡衡时时时时产产产产物物物物或或或或底底底底物物物物浓浓浓浓度度度度总总总总变变变变化化化化量量量量来来来来求求求求出出出出酶酶酶酶活活活活性性性性的的的的方方方方法法法法称称称称为为为为平平平平衡衡衡衡法法法法。用用用用平平平平衡衡衡衡法法法法测测测测定定定定时时时时

26、，因因因因产产产产物物物物的的的的增增增增加加加加或或或或底底底底物物物物的的的的减减减减少少少少与与与与反反反反应应应应时时时时间间间间不不不不成成成成线线线线性性性性，故故故故不不不不能能能能把把把把PPPP或或或或SSSS的的的的总总总总变变变变化化化化量量量量除除除除以以以以t t t t来来来来代代代代表表表表每每每每分分分分钟钟钟钟产产产产物物物物或或或或底底底底物物物物的的的的变变变变化化化化。另另另另外外外外，平平平平衡衡衡衡法法法法也也也也会会会会受受受受到到到到产产产产物物物物抑抑抑抑制制制制、可可可可逆逆逆逆反反反反应应应应等等等等因因因因素素素素的的的的影影影影响响响响

27、，由由由由于于于于反反反反应应应应时时时时间间间间较较较较定定定定时时时时法法法法长长长长，故故故故这这这这种种种种影影影影响响响响会会会会更更更更大大大大，测测测测定定定定结结结结果果果果也也也也较较较较连连连连续续续续监监监监测测测测法法法法低低低低。对对对对于于于于有有有有些些些些零零零零级级级级反反反反应应应应期期期期很很很很短短短短的的的的酶酶酶酶促促促促反反反反应应应应，用用用用连连连连续续续续监监监监测测测测法法法法和和和和定定定定时时时时法法法法很很很很难难难难测测测测出出出出其其其其初初初初速度，也只得采用平衡法测定。速度，也只得采用平衡法测定。速度，也只得采用平衡法测定。速

28、度，也只得采用平衡法测定。生化检验技术基础生化检验技术基础定时法与连续法比较定时法定时法定时法定时法条件无限制条件无限制条件无限制条件无限制试剂需量少，经济试剂需量少，经济试剂需量少，经济试剂需量少，经济采用放射性试剂时，采用放射性试剂时，采用放射性试剂时，采用放射性试剂时，灵敏度高灵敏度高灵敏度高灵敏度高结果不能立刻揭晓结果不能立刻揭晓结果不能立刻揭晓结果不能立刻揭晓人工操作多，费时人工操作多，费时人工操作多，费时人工操作多，费时毋需偶联酶毋需偶联酶毋需偶联酶毋需偶联酶产物会生抑制作用产物会生抑制作用产物会生抑制作用产物会生抑制作用连续法连续法连续法连续法因偶联酶使条件受限因偶联酶使条件受限

29、因偶联酶使条件受限因偶联酶使条件受限制制制制需量较大需量较大需量较大需量较大与放射性试剂来比，与放射性试剂来比，与放射性试剂来比，与放射性试剂来比，灵敏度低灵敏度低灵敏度低灵敏度低结果立刻揭晓结果立刻揭晓结果立刻揭晓结果立刻揭晓人工操作少人工操作少人工操作少人工操作少偶联酶的费用很大偶联酶的费用很大偶联酶的费用很大偶联酶的费用很大偶联作用能消耗产物偶联作用能消耗产物偶联作用能消耗产物偶联作用能消耗产物生化检验技术基础生化检验技术基础（一）工具酶及酶偶联反应 通通过过酶酶偶偶联联反反应应间间接接地地测测出出第第一一个个酶酶促促反反应应中中待待测测物物的的浓浓度度或或待待测测酶酶的的活活性性。那那

30、些些作作为为试试剂剂用用于于测测定定化化合合物物浓浓度度或或酶酶活活性性的的酶酶称称为为工工具酶。具酶。生化检验技术基础生化检验技术基础AB酶1CDC（或D）E酶2FGF（或G）H酶3IJ酶1：待测酶酶2：辅助酶酶3：指示酶E、H：辅助底物生化检验技术基础生化检验技术基础在利用工具酶的反应中，唯一的限在利用工具酶的反应中，唯一的限速因子应该是待测化合物或待测酶。速因子应该是待测化合物或待测酶。对工具酶试剂中的杂质（杂酶、抑对工具酶试剂中的杂质（杂酶、抑制剂等）的含量也有一定的限制，制剂等）的含量也有一定的限制，以减少或避免干扰测定的副反应。以减少或避免干扰测定的副反应。生化检验技术基础生化检验

31、技术基础如果工具酶制剂中污染了待测酶会对如果工具酶制剂中污染了待测酶会对测定结果产生严重影响。测定结果产生严重影响。 如天冬氨酸转氨酶（如天冬氨酸转氨酶（ASTAST）测定的工具酶）测定的工具酶是苹果酸脱氢酶（是苹果酸脱氢酶（MDHMDH），如污染），如污染0.03%0.03%的的ASTAST，则当，则当ASTAST活性为活性为7U/L7U/L时，测定误差为时，测定误差为6%6%。 而测定丙氨酸转氨酶（而测定丙氨酸转氨酶（ALTALT）的工具酶是）的工具酶是乳酸脱氢酶（乳酸脱氢酶（LDHLDH），如污染），如污染0.03%0.03%的的ALTALT，则当，则当ALTALT活性为活性为5U/L5

32、U/L时测定误差也是时测定误差也是6%6%。生化检验技术基础生化检验技术基础（二）常用监测物质的特性1 1NADHNADH或或NADPHNADPH：乳酸脱氢酶（乳酸脱氢酶（LDHLDH） NAD NAD+ +或或NADPNADP+ +苹果酸脱氢酶（苹果酸脱氢酶（MDHMDH） NAD NAD+ +或或NADPNADP+ +谷氨酸脱氢酶（谷氨酸脱氢酶（GLDHGLDH） NAD NAD+ +或或NADPNADP+ +6- 6-磷酸葡萄糖脱氢酶（磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PDG6PD） 动物动物G6PD NADPG6PD NADP+ + 微生物微生物G6PD NADG6PD NAD+ +生化检验技术基

33、础生化检验技术基础NADHNADH或或NADPHNADPH在在340nm340nm有有特特征征性性光光吸吸收收，而而它它们们的的氧氧化化型型NADNAD+ +或或NADPNADP+ +则则没没有有这这个个吸吸收收峰峰，340nm340nm波波长长处处的的吸吸光度与光度与NADNAD（P P）H H的浓度成正比。的浓度成正比。另另外外NADNAD（P P）H H有有强强烈烈的的荧荧光光，其其激激发波长为发波长为340nm340nm，发射波长为，发射波长为460nm460nm。生化检验技术基础生化检验技术基础max ：340nm生化检验技术基础生化检验技术基础肌酸激酶（肌酸激酶（CK）磷酸肌酸AD

34、PCK肌酸ATP葡萄糖ATPHK葡萄糖-6-磷酸ADP葡萄糖-6-磷酸NADPG6PDH6-磷酸葡萄糖酸NADPHH+丙氨酸氨基转移酶（丙氨酸氨基转移酶（ALTALT）丙氨酸-酮戊二酸ALT丙酮酸谷氨酸丙酮酸NADHH+LDH乳酸NAD+H2O生化检验技术基础生化检验技术基础2 2H H2 2O O2 2指示反应指示反应葡葡萄萄糖糖氧氧化化酶酶、尿尿酸酸酶酶、甘甘油油氧氧化化酶酶、胆胆固固醇醇氧氧化化酶酶：用用于于葡葡萄萄糖糖、尿尿酸酸、甘甘油油、胆胆固固醇醇的的测测定定，可可使使相相应应底底物物被被O O2 2氧氧化化成成H H2 2O O2 2，H H2 2O O2 2可可通通过下列指示反

35、应来检测过下列指示反应来检测。生化检验技术基础生化检验技术基础 使使单单一一的的色色素素原原显显色色。无无色色色色素素原原过过氧氧化化物物酶酶（PODPOD）存存在在下下被被H H2 2O O2 2氧氧化化后后可可生生成成有色的色素。有色的色素。 使使成成对对的的色色素素原原显显色色。必必须须要要两两个个色色素素原原共共同同存存在在，再再在在指指示示酶酶PODPOD的的催催化化下下生生成成色素。色素。 发发光光反反应应。H H2 2O O2 2也也可可用用化化学学发发光光反反应应来来监监测测，它它是是凭凭借借某某些些荧荧光光前前身身物物在在氧氧化化后后，处处于于激激发发状状态态的的分分子子可可

36、发发射射光光子子，光光子子量量和和H H2 2O O2 2的浓度成正比。的浓度成正比。生化检验技术基础生化检验技术基础葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖O O2 2H H2 2OO葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶 葡萄糖酸葡萄糖酸H H2 2O O2 2H H2 2O O2 2苯酚苯酚4-4-氨基安替比林氨基安替比林 过氧化物酶过氧化物酶 醌亚胺醌亚胺H H2 2O O甘油三酯甘油三酯甘油三酯甘油三酯H H2 2OO脂蛋白脂酶脂蛋白脂酶 甘油脂肪酸甘油脂肪酸甘油甘油ATPATP甘油激酶甘油激酶 -磷酸甘油磷酸甘油ADPADP-磷酸甘油磷酸甘油O O2 2 甘油磷酸氧化酶甘油磷酸氧化酶 磷酸二羟丙酮磷酸二羟丙酮H

37、 H2 2O O2 2HH2 2O O2 2+4-+4-氨基安替比林氨基安替比林+ESPAS+ESPAS过氧化物酶过氧化物酶 醌亚胺醌亚胺H H2 2O O ESPAS:N-ESPAS:N-乙基乙基-N-(3-N-(3-磺丙基磺丙基)- )-间间- -茴香胺茴香胺生化检验技术基础生化检验技术基础3 3硝基苯衍生物硝基苯衍生物芳香酯酶、磷酸酯酶和硫酸酯酶：对芳香酯酶、磷酸酯酶和硫酸酯酶：对- -硝基酚硝基酚和有机酸或无机酸形成的酯类和有机酸或无机酸形成的酯类糖苷酶：对硝基酚和糖苷衍生物糖苷酶：对硝基酚和糖苷衍生物-谷氨酰转肽酶、芳香酰胺酶和胰蛋白酶：谷氨酰转肽酶、芳香酰胺酶和胰蛋白酶：对对- -

38、硝基苯胺的氨基酰衍生物硝基苯胺的氨基酰衍生物故硝基苯酚或硝基苯胺作为底物的结合型化故硝基苯酚或硝基苯胺作为底物的结合型化合物均无色，而一旦水解或游离型产物在合物均无色，而一旦水解或游离型产物在pHpH大于大于8 8的碱性条件下能生成黄色的醌类离子型的碱性条件下能生成黄色的醌类离子型化合物，在化合物，在400nm400nm410nm410nm有光吸收峰，其吸有光吸收峰，其吸光度与浓度成正比。光度与浓度成正比。生化检验技术基础生化检验技术基础max：405nm生化检验技术基础生化检验技术基础碱性磷酸酶（碱性磷酸酶（ALPALP）磷酸对硝基苯磷酸对硝基苯H H2 2OOALPALP 磷酸盐对硝基苯酚

39、磷酸盐对硝基苯酚 - -谷氨酰转移酶（谷氨酰转移酶（ -GT -GT）-谷氨酰对硝基苯胺双甘肽谷氨酰对硝基苯胺双甘肽 -GT-GT 谷氨酰基双甘肽对硝基谷氨酰基双甘肽对硝基苯胺苯胺生化检验技术基础生化检验技术基础（三）酶法分析的类型 用用工工具具酶酶测测定定体体液液中中代代谢谢物物的的浓浓度，一般可用两种不同的测定方法。度，一般可用两种不同的测定方法。生化检验技术基础生化检验技术基础1 1代谢物浓度的酶法分析代谢物浓度的酶法分析（1 1）终点法）终点法 将将待待测测底底物物与与工工具具酶酶保保温温一一定定时时间间后后，全全部部转转变变成成可可监监测测的的化化合合物物，然然后后测测定定后后者者的

40、总量来计算待测物的总量或浓度。的总量来计算待测物的总量或浓度。 尿素尿素H H2 2O O 尿素酶尿素酶 CO CO2 22NH2NH3 3 乙醇乙醇NADNAD+ + 醇脱氢酶醇脱氢酶 乙醛乙醛NADHNADHH H+ + 反应常呈一级反应。反应常呈一级反应。 使使待待测测底底物物完完全全转转变变所所需需的的时时间间取取决决于于加入的工具酶量。加入的工具酶量。生化检验技术基础生化检验技术基础（2 2）动力学法）动力学法 待待测测物物不不必必完完全全转转变变成成可可监监测测的的化化合合物物，而而是是利利用用工工具具酶酶反反应应速速率率来来定定量量其浓度：其浓度： 一一是是利利用用零零级级反反应

41、应，如如待待测测物物是是某某个个工工具具酶酶的的激激活活剂剂或或抑抑制制剂剂，其其浓浓度度可可决决定定该该工工具具酶酶的的反反应应速速度度，可可采采用用此此方方法法。因因测测定定时时该该工工具具酶酶本本身身及及其其底底物物都都是足量的，故反应为零级反应。是足量的，故反应为零级反应。 生化检验技术基础生化检验技术基础例：测定血清中肝素ATAT 肝素肝素ATAT （ATAT 为肝素与为肝素与ATAT复合物）复合物）ATAT 凝血酶凝血酶凝血酶凝血酶-AT-AT （无活性）残余凝血（无活性）残余凝血酶酶甲苯磺酰甲苯磺酰- -甘甘- -脯脯- -精精-4NA-4NA凝血酶凝血酶 甲苯磺酰甲苯磺酰- -

42、甘甘- -脯脯- -精精4-4-硝基硝基苯胺苯胺 生化检验技术基础生化检验技术基础 二二是是利利用用一一级级反反应应，本本法法的的基基本本要要求求是是作作为为某某一一工工具具酶酶底底物物的的待待测测物物的的浓浓度度SS必必须须远远小小于于该该工工具具酶酶的的KmKm。此此时时反反应应速速度度基本上与基本上与SS成正比，呈一级反应。成正比，呈一级反应。 动动力力学学法法较较终终点点法法具具有有简简便便、省省时时、干干扰扰少少、可可测测定定低低浓浓度度物物质质、不不需需样样品品对对照照以以及及易易于于自自动动化化等等优优点点，成成为为自自动动化化分分析析的的主主要要方方法法。但但此此法法必必须须同

43、同时时测测定定标标准准样样品品的的反反应应速速度度，来来推推算算未未知知样样品品中中待待测测物的浓度。物的浓度。生化检验技术基础生化检验技术基础2 2酶活性测定的酶法分析酶活性测定的酶法分析 这类酶学分析法是用工具酶来测定待这类酶学分析法是用工具酶来测定待测酶的产物以求取待测酶的活性，适合测酶的产物以求取待测酶的活性，适合于待测酶产物不能直接监测的情况。于待测酶产物不能直接监测的情况。 也可有终点法和动力学法两种。也可有终点法和动力学法两种。 生化检验技术基础生化检验技术基础（1 1）终点法）终点法 将将底底物物与与待待测测酶酶反反应应一一定定时时间间后后，终终止止反反应应，再再用用指指示示酶

44、酶测测定定该该时时间间内产物的生成量即可算出酶活性。内产物的生成量即可算出酶活性。 生化检验技术基础生化检验技术基础（2）偶联反应的基本动力学SExP1EiP2 应先将样品与工具酶预保温，使样品中的应先将样品与工具酶预保温，使样品中的内源性干扰物充分催化消耗，然后加入底物内源性干扰物充分催化消耗，然后加入底物S S起动反应。起动反应。 起动后，因起动后，因P P从零开始升高，故工具酶反应从零开始升高，故工具酶反应速度也较低，不能代表待测酶反应速度，这速度也较低，不能代表待测酶反应速度，这一时期称为延滞期。一时期称为延滞期。 随着反应进行，进入恒态期，只要工具酶随着反应进行，进入恒态期，只要工具

45、酶用量足够，就能正确地反映酶的活性用量足够，就能正确地反映酶的活性. .生化检验技术基础生化检验技术基础 A A 延迟期延迟期 恒态期恒态期 非恒态期非恒态期 1.5 1.5 1.0 1.0 SSExExPP1 1 EiEiPP2 2 0.5 0.5 0 30 60 90 120 150 180 0 30 60 90 120 150 180 秒秒 （以（以NADHNADH减少为指示反应）减少为指示反应） 如如EiEi用用量量过过少少，ExEx的的速速度度VxVx大大于于EiEi的的速速度度，即即P P1 1生生成成的的速速度度大大于于P P1 1消消失失的的速速度度，可可导导致致P P1 1的

46、的逐逐渐渐堆堆积积，不不能能成成为为恒恒态态或或其其延延滞滞期期极极长长。但但如如EiEi用用量量足足够够，ViVi等等于于或或大大于于VxVx，则则P P1 1一一旦旦生生成成可可较较快快或或很很快快转转变变成成P P2 2，P P1 1产产生生与与消消失速度一致而成为恒态。失速度一致而成为恒态。生化检验技术基础生化检验技术基础（四）酶活性浓度的计算Vt106U/L（A/min） VsLA 吸光度变化吸光度变化V Vt t为反应系统总体积为反应系统总体积V Vs s为样品体积为样品体积 为被测物的摩尔吸光系数为被测物的摩尔吸光系数(mol(mol-1 -1 cm cm-1 -1) )L L为

47、光径为光径10106 6是将是将molmol转化成转化成molmol。生化检验技术基础生化检验技术基础常数K值的意义和设置 Vt106U/L（A/min） VsL （A/min）K Vt106 K VsL 生化检验技术基础生化检验技术基础常数K值的检验 ：pHpH；温度；单色光；仪器信号接收；温度；单色光；仪器信号接收V V：仪器加样系统：仪器加样系统对一些性质稳定的物质如对硝基酚、对硝基对一些性质稳定的物质如对硝基酚、对硝基苯胺，可以用高纯试剂配成标准品，将它们苯胺，可以用高纯试剂配成标准品，将它们作为标本进行酶的测定，根据其浓度和吸光作为标本进行酶的测定，根据其浓度和吸光度变化可计算出实际

48、度变化可计算出实际K K值。值。对对NAD(P)HNAD(P)H，可使用测葡萄糖试剂盒，对已，可使用测葡萄糖试剂盒，对已知浓度的葡萄糖标准品进行终点法测定，此知浓度的葡萄糖标准品进行终点法测定，此法产生与葡萄糖相等摩尔数的法产生与葡萄糖相等摩尔数的NAD(P)HNAD(P)H，故，故不难从吸光度变化求出不难从吸光度变化求出K K值。值。生化检验技术基础生化检验技术基础 利利用用标标准准管管的的方方法法较较简简单单，但但标标准准管管的的浓浓度度必必须须在在该该比比色色法法或或紫紫外外分分光光光光度度法法测测定定的的浓浓度度线线性性范范围围内内。标标准准曲曲线线法法可可得得浓浓度度和和吸吸光光度度

49、的的线线性性范范围围，消消除除浓浓度度过过高高偏偏离离线线性性的的影影响响，但但标标准准曲曲线线的的制制备备时时间间与与测测定定样样品品的的时时间间不不同同，容容易易产产生生试试剂剂批批号号、配配制制、实实验验温温度度、仪仪器工作状态等因素造成的误差。器工作状态等因素造成的误差。生化检验技术基础生化检验技术基础单试剂、双试剂、液体试剂1. 1. 1. 1. 单试剂的优缺点单试剂的优缺点单试剂的优缺点单试剂的优缺点 优点：优点：优点：优点：操作简便适用于各类生化分析仪操作简便适用于各类生化分析仪操作简便适用于各类生化分析仪操作简便适用于各类生化分析仪 缺点：缺点：缺点：缺点：配方复杂（稳定剂、掩

50、蔽剂），稳定性配方复杂（稳定剂、掩蔽剂），稳定性配方复杂（稳定剂、掩蔽剂），稳定性配方复杂（稳定剂、掩蔽剂），稳定性差，不能完全避免内外源物质干扰。差，不能完全避免内外源物质干扰。差，不能完全避免内外源物质干扰。差，不能完全避免内外源物质干扰。2. 2. 2. 2. 双试剂的特点双试剂的特点双试剂的特点双试剂的特点 （1 1 1 1）可较彻底排除样品空白和内外源干扰物）可较彻底排除样品空白和内外源干扰物）可较彻底排除样品空白和内外源干扰物）可较彻底排除样品空白和内外源干扰物 （2 2 2 2）更加符合酶偶联反应的特性和过程）更加符合酶偶联反应的特性和过程）更加符合酶偶联反应的特性和过程）更加符

51、合酶偶联反应的特性和过程 （3 3 3 3）试剂配方简单）试剂配方简单）试剂配方简单）试剂配方简单 （4 4 4 4）试剂稳定，便于储存，运输和使用）试剂稳定，便于储存，运输和使用）试剂稳定，便于储存，运输和使用）试剂稳定，便于储存，运输和使用 （5 5 5 5）可用抑制法直接测定某些同工酶）可用抑制法直接测定某些同工酶）可用抑制法直接测定某些同工酶）可用抑制法直接测定某些同工酶生化检验技术基础生化检验技术基础3. 3. 液体试剂的优点液体试剂的优点 （1 1）不需手工调制，省工省时）不需手工调制，省工省时 （2 2）试剂批间差小，重复性好）试剂批间差小，重复性好 （3 3）杜绝干粉试剂重溶时

52、因水质差引起）杜绝干粉试剂重溶时因水质差引起试剂变质试剂变质 （4 4）有利于急诊标本）有利于急诊标本 （5 5）按需取量，避免浪费）按需取量，避免浪费生化检验技术基础生化检验技术基础自动生化分析仪主要参数1.1.测定方法学类型的选择测定方法学类型的选择: : 终点法终点法, ,速率速率法法, ,固定时间法固定时间法2.2.温度温度3.3.波长波长4.4.样品与试剂量样品与试剂量5.5.延迟时间延迟时间6.6.测定时间测定时间7.7.浓度校正因子浓度校正因子生化检验技术基础生化检验技术基础四、免疫浊度分析法 抗抗体体（AbAb）与与可可溶溶性性抗抗原原（AgAg）反反应应，形形成成一一定定结结

53、构构的的免免疫疫复复合合物物，成成为为悬悬浮浮于于反反应应溶溶液液中中的的微微粒粒。在在沉沉淀淀反反应应中中形形成成的的复复合合物物微微粒粒具具有有特特殊殊的的光光学学性性质质，可可用用仪仪器器检检测测，提提高高了了方方法法的的速速度度、灵灵敏度和易操作性。敏度和易操作性。生化检验技术基础生化检验技术基础抗原-抗体沉淀反应的特征1. 1. 抗体过剩区：抗体过剩区：随着抗原浓度增加，随着抗原浓度增加，ICIC也相应增加，浊度增加。也相应增加，浊度增加。2. 2. 等价点：等价点：抗原抗体相当时，所有抗体抗原抗体相当时，所有抗体与抗原形成与抗原形成ICIC，浊度最大，达到等价点。，浊度最大，达到等

54、价点。3. 3. 抗原过剩区：抗原过剩区：抗原过量存在，不但不抗原过量存在，不但不会形成更多的会形成更多的ICIC，反而会引起原先的，反而会引起原先的ICIC溶解，浊度下降，产生虚假的低浓度结溶解，浊度下降，产生虚假的低浓度结果。果。生化检验技术基础生化检验技术基础1 1透射比浊测定法透射比浊测定法 是是测测定定入入射射光光强强度度由由于于溶溶液液中中粒粒子子的的散散射射而而降降低低的的程程度度，它它并并不不直直接接测测定定散散射射的的光光强强。这这一一点点与与分分光光光光度度测测定定法法极极为为类类似似。用用这这种种方方法法时时，多多用用聚聚乙乙二二醇醇（PEGPEG）作作为为反反应应增增强

55、强剂剂。这这种种非非离离子子型型聚聚合合物物可可以以降降低低抗抗原原抗抗体复合物的溶解度。体复合物的溶解度。2 2散射比浊测定法散射比浊测定法 它它是是直直接接测测定定溶溶液液中中微微粒粒所所散散射射的的光光强强。散射比浊法也已经用于自动分析仪器中。散射比浊法也已经用于自动分析仪器中。生化检验技术基础生化检验技术基础3 3免疫浊度测定中应注意的问题免疫浊度测定中应注意的问题（1 1）伪浊度的影响。）伪浊度的影响。 非特异的交叉反应非特异的交叉反应 增浊剂浓度增浊剂浓度 反应时间反应时间 样品本身的浊度样品本身的浊度 试剂的污染和变质试剂的污染和变质 器材不够清洁器材不够清洁生化检验技术基础生化

56、检验技术基础(2)(2)钩钩状状效效应应（hook hook effecteffect）的的影影响响。当当AgAg和和AbAb浓浓度度比比例例不不当当时时，不不能能有有效效地地形形成成免免疫疫复复合合物物，产产生生弱弱阳阳性性甚甚至假阴性结果。至假阴性结果。(3)(3)严格的室内质控是极必要的。严格的室内质控是极必要的。(4)(4)标准曲线的制作标准曲线的制作. .生化检验技术基础生化检验技术基础五、方法学评价（一）准确度试验 准准确确度度是是指指测测定定值值与与“真真值值”的的符符合合程程度度。是是评评价价一一项项实实验验方方法法是是否否可可取取的的重重要指标。要指标。 1 1标准物鉴定标准

57、物鉴定 为为了了确确定定和和评评价价方方法法的的准准确确性性，常常用用基基准准标标准准液液或或参参考考血血清清为为样样本本进进行行检检测测，所所得得结结果果经经统统计计学学处处理理，以以衡衡量量方方法法的的准确性。准确性。生化检验技术基础生化检验技术基础2 2回收试验回收试验 回收率的计算是（回收值回收率的计算是（回收值/ /加入值）加入值）100100，这里的回收值是指标本中，这里的回收值是指标本中加入标准液后的测定值减去标本原加入标准液后的测定值减去标本原来的测定值。回收率达到来的测定值。回收率达到10010055者为准确性符合要求的方法。者为准确性符合要求的方法。生化检验技术基础生化检验

58、技术基础回收试验应注意：回收试验应注意：回收试验应注意：回收试验应注意： 样品的选用样品的选用样品的选用样品的选用 样品最好应用新鲜混合血清。样品最好应用新鲜混合血清。样品最好应用新鲜混合血清。样品最好应用新鲜混合血清。 标标标标准准准准物物物物的的的的加加加加入入入入 应应应应先先先先配配配配制制制制成成成成适适适适当当当当浓浓浓浓度度度度的的的的标标标标准准准准物物物物溶溶溶溶液液液液，再再再再加加加加入入入入到到到到基基基基础础础础样样样样品品品品中中中中。所所所所加加加加标标标标准准准准溶溶溶溶液液液液量越少越好。量越少越好。量越少越好。量越少越好。 标标标标准准准准物物物物的的的的加

59、加加加入入入入浓浓浓浓度度度度 最最最最好好好好同同同同时时时时设设设设计计计计几几几几个个个个加加加加入入入入不不不不同同同同浓浓浓浓度度度度标标标标准准准准液液液液的的的的试试试试验验验验样样样样品品品品。加加加加入入入入标标标标准准准准液液液液后后后后的的的的试验样品的总浓度不能超过本方法的线性范围。试验样品的总浓度不能超过本方法的线性范围。试验样品的总浓度不能超过本方法的线性范围。试验样品的总浓度不能超过本方法的线性范围。 操操操操作作作作准准准准确确确确 标标标标准准准准液液液液的的的的加加加加入入入入量量量量必必必必须须须须准准准准确确确确无无无无误误误误，应经多次试验。应经多次试

60、验。应经多次试验。应经多次试验。生化检验技术基础生化检验技术基础（二）精密度试验 目目目目前前前前常常常常以以以以重重重重复复复复性性性性试试试试验验验验来来来来衡衡衡衡量量量量一一一一个个个个方方方方法法法法的的的的精精精精密密密密度度度度。一一一一般般般般来来来来说说说说，标标标标准准准准差差差差、变变变变异异异异系系系系数数数数（CVCVCVCVs/x100s/x100s/x100s/x100）小的实验方法精密。小的实验方法精密。小的实验方法精密。小的实验方法精密。 1 1 1 1批批批批内内内内精精精精密密密密度度度度试试试试验验验验 取取取取一一一一份份份份样样样样品品品品，用用用用

61、欲欲欲欲测测测测项项项项目目目目实实实实验验验验方方方方法法法法进进进进行行行行操操操操作作作作，反反反反复复复复测测测测定定定定20202020次次次次以以以以上上上上，计计计计算算算算每每每每一一一一次的测定结果，然后计算次的测定结果，然后计算次的测定结果，然后计算次的测定结果，然后计算x x x x、s s s s、CVCVCVCV。 2 2 2 2批批批批间间间间精精精精密密密密度度度度试试试试验验验验 这这这这种种种种试试试试验验验验也也也也是是是是同同同同一一一一份份份份标标标标本本本本进进进进行行行行重重重重复复复复测测测测定定定定，至至至至少少少少为为为为20202020次次次

62、次。但但但但是是是是重重重重复复复复测测测测定定定定不不不不是是是是在在在在一一一一天天天天内内内内完完完完成成成成，而而而而是是是是每每每每天天天天随随随随患患患患者者者者标标标标本本本本一一一一起起起起测测测测定定定定，再再再再计算计算计算计算x x x x、s s s s、CVCVCVCV。生化检验技术基础生化检验技术基础（三）灵敏度试验灵灵敏敏度度是是单单位位浓浓度度变变化化所所引引起起的的指指示示物物理理量量的的变变化化。在在定定量量分分析析中中是是指指被被检检测测物物单单位位浓浓度度的的变变化化所所引引起起的的物物理理量量的的变变化。化。所所选选用用的的方方法法，应应进进行行线线性

63、性试试验验，选选用用线线性性范范围围宽宽度度适适宜宜的的方方法法。线线性性检检验验所所得得结结果果，可可用用回回归归方方程程（Y Ya abXbX）处处理理，回回归归系系数数（b b）为为灵灵敏敏度度大大小小的的指指标标，回回归归系系数数大大，灵灵敏敏度度高高，反反之之亦亦然然。不不同同方方法法也也可可用用回回归归系系数数进进行行比比较较，回回归归系数大的灵敏度高。系数大的灵敏度高。生化检验技术基础生化检验技术基础（四）线性试验线线性性试试验验是是衡衡量量一一个个方方法法的的检检测测范范围围的的一一种种实实验验。通通过过线线性性试试验验，可可以以了了解解该该方方法法的的最最高检测值和最低检测值

64、。高检测值和最低检测值。超超出出上上下下限限值值的的结结果果是是不不可可靠靠的的，为为使使结结果果可可靠靠，遇遇到到这这种种情情况况应应加加大大样样品品用用量量或或稀稀释释样品后再次检测。样品后再次检测。线线性性试试验验的的方方法法基基本本同同标标准准曲曲线线的的制制备备。一一般般先先进进行行线线性性试试验验，然然后后在在线线性性范范围围内内制制备备标准曲线。标准曲线。生化检验技术基础生化检验技术基础（五）特异性及干扰试验 干干干干扰扰扰扰是是是是指指指指标标标标本本本本中中中中存存存存在在在在分分分分析析析析物物物物以以以以外外外外的的的的其其其其他他他他物物物物质质质质，致使测定结果有误差

65、。致使测定结果有误差。致使测定结果有误差。致使测定结果有误差。 首首首首先先先先确确确确定定定定被被被被试试试试的的的的可可可可疑疑疑疑干干干干扰扰扰扰物物物物是是是是否否否否会会会会引引引引起起起起误误误误差差差差，再再再再进进进进一一一一步步步步分分分分析析析析和和和和试试试试验验验验误误误误差差差差的的的的原原原原因因因因，是是是是由由由由于于于于缺缺缺缺乏乏乏乏特特特特异异异异性还是由于干扰。性还是由于干扰。性还是由于干扰。性还是由于干扰。 干扰试验的方法基本同回收试验，对加入物不干扰试验的方法基本同回收试验，对加入物不干扰试验的方法基本同回收试验，对加入物不干扰试验的方法基本同回收试

66、验，对加入物不作分析，只测定它对分析的干扰。作分析，只测定它对分析的干扰。作分析，只测定它对分析的干扰。作分析，只测定它对分析的干扰。 常考虑的干扰情况和干扰物有：血清混浊、溶常考虑的干扰情况和干扰物有：血清混浊、溶常考虑的干扰情况和干扰物有：血清混浊、溶常考虑的干扰情况和干扰物有：血清混浊、溶血、胆红素、肌酐、防腐剂、抗凝剂等。血、胆红素、肌酐、防腐剂、抗凝剂等。血、胆红素、肌酐、防腐剂、抗凝剂等。血、胆红素、肌酐、防腐剂、抗凝剂等。生化检验技术基础生化检验技术基础干扰试验应注意：干扰试验应注意： 加入干扰物的体积应小于试验样品的加入干扰物的体积应小于试验样品的1010。 可疑干扰物的加入量

67、要达到一定浓度，可疑干扰物的加入量要达到一定浓度，应加到病理标本的最高浓度值，观察到应加到病理标本的最高浓度值，观察到有干扰时，再加低浓度的干扰物进行试有干扰时，再加低浓度的干扰物进行试验，以确定最低干扰浓度。验，以确定最低干扰浓度。 考虑机体内有哪些物质可干扰，以针考虑机体内有哪些物质可干扰，以针对性进行干扰试验。对性进行干扰试验。 生化检验技术基础生化检验技术基础用病人标本作方法学比较实验新方法实验方法（新方法实验方法（新方法实验方法（新方法实验方法（Y Y Y Y）原有方法或参考方法比较方法（原有方法或参考方法比较方法（原有方法或参考方法比较方法（原有方法或参考方法比较方法（X X X

68、X）1. 1.方法学比较实验要点方法学比较实验要点方法学比较实验要点方法学比较实验要点（1 1 1 1）熟悉方法、试剂、仪器、评价方案）熟悉方法、试剂、仪器、评价方案）熟悉方法、试剂、仪器、评价方案）熟悉方法、试剂、仪器、评价方案（2 2 2 2）处于完全质量控制下）处于完全质量控制下）处于完全质量控制下）处于完全质量控制下（3 3 3 3）做）做）做）做5 5 5 5天以上天以上天以上天以上（4 4 4 4）40404040份以上标本份以上标本份以上标本份以上标本（5 5 5 5）标本分布要宽，）标本分布要宽，）标本分布要宽，）标本分布要宽，50505050（6 6 6 6）有足够量做双份测

69、定）有足够量做双份测定）有足够量做双份测定）有足够量做双份测定（7 7 7 7）标本顺序颠倒测定以消除交叉污染）标本顺序颠倒测定以消除交叉污染）标本顺序颠倒测定以消除交叉污染）标本顺序颠倒测定以消除交叉污染（8 8 8 8）2 2 2 2h h h h内分别开始内分别开始内分别开始内分别开始生化检验技术基础生化检验技术基础2. 2. 实验数据的收集和处理实验数据的收集和处理（1 1）去除人为误差结果）去除人为误差结果（2 2）查对差值大于批内精密度的结果）查对差值大于批内精密度的结果（3 3）质控）质控（4 4）初步检查：）初步检查： 计算计算xixi，yiyi；xx，yy 以以4 x4 x及

70、及4 y4 y为判断限，剔除补充为判断限，剔除补充（5 5）作图（）作图（x,yx,y），与斜率为），与斜率为1 1通过零点的通过零点的直线比较直线比较生化检验技术基础生化检验技术基础（6 6）检查）检查x x，y y关系实验点有无离群表现关系实验点有无离群表现 E Eij ij y yij ijx xij ij E E1/2nE1/2nEij ij 以以4E4E为判断限值，剔除补充为判断限值，剔除补充（7 7）对标本内分析物含量分布是否适当的）对标本内分析物含量分布是否适当的检验检验 0.975 0.975，否则应扩大数据范围，否则应扩大数据范围（8 8）线性回归统计：）线性回归统计：y y

71、bxbxa a 系统误差估计：系统误差估计：SESE（b b1 1）x xc ca a生化检验技术基础生化检验技术基础质控图的评判（一）质控图的规律（一）质控图的规律 1. 1. 质控图的绘制质控图的绘制 +3s +3s +3s +3s +2s +2s +2s +2s x x x x -2s -2s -2s -2s -3s -3s -3s -3s 5 10 15 20 5 10 15 20 5 10 15 20 5 10 15 20 次数和日期次数和日期次数和日期次数和日期生化检验技术基础生化检验技术基础2. 2. 常见的失控图形常见的失控图形 漂移漂移漂移漂移 趋向变化趋向变化趋向变化趋向变

72、化 离散度大离散度大离散度大离散度大生化检验技术基础生化检验技术基础（二）质控图的评判（二）质控图的评判控制样控制样控制样控制样品数据品数据品数据品数据 1 2s 1 2s No No 在控，该批病人标本结果可以接受在控，该批病人标本结果可以接受在控，该批病人标本结果可以接受在控，该批病人标本结果可以接受 Yes NoYes NoYes NoYes No 1 3s 1 3s NoNo 2 2s 2 2s NoNo R 4s R 4s NoNo 4 1s 4 1s NoNo 10x 10x Yes Yes Yes Yes YesYes Yes Yes Yes YesYes Yes Yes Yes YesYes Yes Yes Yes Yes失控。扣留该批病人标本结果，寻找失控原因失控。扣留该批病人标本结果，寻找失控原因失控。扣留该批病人标本结果，寻找失控原因失控。扣留该批病人标本结果，寻找失控原因生化检验技术基础生化检验技术基础（三）失控的处理（三）失控的处理1.寻找失控原因寻找失控原因 试剂空白，标准，质控物，仪器，试剂空白，标准，质控物，仪器， 复溶过程，失效期，操作复溶过程，失效期，操作2. 记录记录 当时情况，查找原因的步骤，当时情况，查找原因的步骤， 最后处理办法最后处理办法生化检验技术基础生化检验技术基础生化检验技术基础生化检验技术基础