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1、复 习 题1、-热稳定性较好，可用来进行特定核苷酸序列的体外扩增；2、-可以在体外以mRNA为模板合成cDNA；3、为避免载体自连，可以用-将DNA的5磷酸基团去除。4、-可以去除DNA片段中突出的单链尾巴。5、寄主控制的限制与修饰现象涉及到的两种酶是-和-。6、质粒的复制类型可分为和两种。7、质粒的三种构型在琼脂糖凝胶电泳中速度最快的是。8、pUC18/19是载体。9、pUC118、119是载体。10、-年被公认为基因工程元年。第四章第四章第四章第四章 目的基因的获取目的基因的获取目的基因的获取目的基因的获取第一节第一节第一节第一节 化学合成目的基因化学合成目的基因化学合成目的基因化学合成目
2、的基因第二节第二节第二节第二节 PCRPCRPCRPCR扩增获得目的基因扩增获得目的基因扩增获得目的基因扩增获得目的基因第三节第三节第三节第三节 筛选基因文库获取目的基因筛选基因文库获取目的基因筛选基因文库获取目的基因筛选基因文库获取目的基因第四节第四节第四节第四节 转座子标签法获得目的基因转座子标签法获得目的基因转座子标签法获得目的基因转座子标签法获得目的基因第五节第五节第五节第五节 图位克隆获得目的基因图位克隆获得目的基因图位克隆获得目的基因图位克隆获得目的基因第六节第六节第六节第六节 mRNAmRNAmRNAmRNA差别显示技术获得差异表达的基因差别显示技术获得差异表达的基因差别显示技术
3、获得差异表达的基因差别显示技术获得差异表达的基因第七节第七节第七节第七节 酵母双杂交系统获得目的基因酵母双杂交系统获得目的基因酵母双杂交系统获得目的基因酵母双杂交系统获得目的基因第一节 化学合成目的基因要求： 已知目的基因的核苷酸序列； 较短的DNA片段。应用范围： 1）合成PCR引物 2）寡核苷酸探针 3）人工接头 4）较小的基因 固相亚磷酸三酯法固相亚磷酸三酯法一、基本原理二、支持物 可控微孔玻璃珠（CPG）三、单体uu3位 二异丙基亚磷酸酰上的磷酸的羟基用甲基或-氰乙基保护uu5位 二甲氧基三苯甲基 （DMT）四、反应步骤 第一步-核苷酸单体1的去封闭（Deblocking） 去除CPG
4、所连核苷上的DMT，以暴露5羟基 第二步-核苷酸单体2的活化（Activation） 形成亚磷酰胺四唑这种活性中间体 第三步-连接（Coupling） 亚磷酰胺四唑与CPG所连的核苷酸缩合 第四步-盖帽（Capping） 封闭未反应的核苷酸单体1 第五步-氧化（Oxidation） 三价磷氧化为五价的磷 多次循环直到合成所需的长度，用浓氨水将DNA从固相上洗脱下来，真空抽干，样品溶于适量水中进行纯化分析。化学合成的单元操作化学合成的单元操作化学合成的单元操作化学合成的单元操作OHGHHHHOCH2ODMTPOMeNCHMeMeCHMeMeHDMTDMT： 二甲氧基三苯二甲氧基三苯二甲氧基三苯二
5、甲氧基三苯甲基甲基甲基甲基激活激活激活激活缩合缩合缩合缩合氧化氧化氧化氧化脱取代基脱取代基脱取代基脱取代基可控微孔玻璃珠可控微孔玻璃珠可控微孔玻璃珠可控微孔玻璃珠CPGCPG连接臂连接臂连接臂连接臂五、基因的组装 目前合成能力200b以内，若要合成更长的基因，则需要先合成短的序列，然后再拼接到一起啊，称为基因的组装。 第二节第二节 PCRPCR扩增获得目的基因扩增获得目的基因 一、一、PCRPCR扩增目的基因的基本原理扩增目的基因的基本原理PCRPCR：特异性：特异性DNADNA序列体外引物定向酶促序列体外引物定向酶促 扩增技术扩增技术。5555目的基因目的基因目的基因目的基因55变性变性变性
6、变性加热加热加热加热5555引物引物引物引物退火退火退火退火5555底物底物底物底物聚合聚合聚合聚合55555555加热加热加热加热变性变性变性变性55555555555555555555555555555555555555555555555555退火退火退火退火 引物引物引物引物底物底物底物底物聚合聚合聚合聚合加热加热加热加热变性变性变性变性引物引物引物引物退火退火退火退火底物底物底物底物聚合聚合聚合聚合1 1223 3二、 特点：1.反复循环便于获得大量的基因拷贝；2.多用于基因检测，如用于基因重组表达，须进行DNA序列分析。三、逆转录PCR（RT-PCR) mRNA cDNA PCR1、
7、已知目的基因序列的RT-PCR2、从基因编码部分氨基酸序列出发的RT-PCR mRNA 5 AAAAAA3 RT-GSP 逆转录 5 AAAAAA3 RT-GSP 变性、退火 5 AAAAAA3 3 5 GSP 3 5 5 3已知目的基因编码的蛋白N端部分氨基酸序列信息，可以以此设计特异引物，从总RNA中获得目的基因。 N端 C端氨基酸序列：氨基酸序列：Val Phe Asn Ala Trp Lys Asp His核苷酸序列核苷酸序列:GTN:GTNTT(T/C)TT(T/C)AA(T/C)AA(T/C)GCNGCNTGGTGGAA(A/G)AA(A/G)GA(T/C)GA(T/C)CA(T/
8、CCA(T/C) ) 引物引物1 1 引物引物2 2简并引物简并引物1 1：GTNGTNTT(T/C)TT(T/C)AA(T/C)AA(T/C)GCNGCNTGGTGGAA AA 共共1616种种简并引物简并引物2 2：GCNGCNTGGTGGAA(A/G)AA(A/G)GA(T/C)GA(T/C)CA CA 共共1616种种反义引物：反义引物：oligooligo（dTdT）12-1812-18已知序列 mRNA 5 AAAAAA3 TTTTTTT5( (反义引物反义引物) ) 逆转录逆转录 mRNA 5 AAAAAA3 TTTTTTT5( (反义引物反义引物) ) 加入简并引物加入简并引物
9、1 1、变性、退火、延伸、变性、退火、延伸 TTTTTTTT5TTTTTTTT5 引物引物1 AAAAAAA31 AAAAAAA3 加入简并引物加入简并引物2 2、变性、退火、延伸、变性、退火、延伸 AAAAAAA3AAAAAAA3 TTTTTTTT5TTTTTTTT5四、依据基因部分序列信息获得基因全长序列1、反向PCR (inverse PCR, IPCR)2、盒式PCR3、RACE技术n n反向PCR：根据已知DNA区的序列设计引物，以包含已知区和未知区的环化DNA分子为模板来扩增未知DNA区序列的PCR技术。RE 已知区域 RE 酶切酶连引物 A1、S1引物 A2、S2克隆测序n n盒
10、式PCR：是利用cassete（即人工合成的带有适当限制酶的粘性末端较长的双链DNA分子）和cassete上的引物，特异性扩增目的基因组DNA未知区域的一种有效方法。n nRACE技术：通过PCR技术进行cDNA末端快速克隆的技术。以mRNA为模板逆转录成cDNA第一条链后，用PCR技术扩增出某个特异位点到3或5之间的未知序列的方法，分别称3-RACE或5-RACE。第三节第三节 筛选基因文库获取目的基因筛选基因文库获取目的基因一、基因组文库的构建一、基因组文库的构建 二、二、cDNAcDNA文库的构建文库的构建三、筛选基因文库获取目的基因三、筛选基因文库获取目的基因基因文库（gene lib
11、rary） 通过克隆的方法将某一基因组DNA或cDNA保存于适当宿主菌或噬菌体中形成转化子群，所有重组DNA序列总和代表该基因组的DNA全部或部分序列。基因文库的完备性指在构建的基因文库中任一基因存在的概率。它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系如下： N = ln ( 1 P ) / ln ( 1 f ) P = 任一基因被克隆的概率 f = 克隆片段的平均大小 生物基因组的大小 例如：人的单倍体DNA总长为2.9 x 109 bp，基因文库中克隆片段的平均大小为15 kb，则构建一个完备性为0.9的基因文库至少需要45万个克隆；而当完备性提高到0.9999时，基因文库至少需要180万个克隆
12、。For example : 期望值为0.99，插入片断为20kb20kb的的 E.coli (4.6106 bp) 和 human (3109 bp) 基因组的克隆数的计算N E.coli= =1.1 103 ln( 1-0.99) ln1-(2104/4.6106)Nhuman= = 6.9 105 ln(1-0.99) ln1-(2 104/3 109)一、基因组文库一、基因组文库（genomic library）的构建的构建1.1.概念：将某一生物基因组概念：将某一生物基因组DNADNA片段化并全部克隆后所片段化并全部克隆后所获得的重组子群体的总称。获得的重组子群体的总称。2.2.基因
13、组文库应具备的条件基因组文库应具备的条件重组克隆总数不可过大；重组克隆总数不可过大；克隆基因的完整性；克隆基因的完整性；部分重叠序列大小合适；部分重叠序列大小合适；克隆片段易于从载体上卸载；克隆片段易于从载体上卸载；重组克隆能稳定保存扩增筛选。重组克隆能稳定保存扩增筛选。3.3.基因组文库的构建过程基因组文库的构建过程1)1)基因组基因组DNADNA的制备的制备 原则：完整性好、纯度高。原则：完整性好、纯度高。AAAAAAAA2）基因组DNA的片断化限制性内切酶酶切部分酶切物理方法：超声波处理、小孔喷射、高速搅拌 3）载体和受体的选择 载体 承载片段大小 受体 plasmid 15kb 大肠杆
14、菌 -DNA 23kb 噬菌体 cosmid 45kb 大肠杆菌 YAC 1000kb 酵母菌4）DNA片断和载体的连接黏性末端连接效率比平末端高定向连接可以提高重组率防止载体自连5）重组体转化宿主细胞 至此，建成了基因组文库的初库6）初库的扩增 初库经过扩增形成终库。二、二、cDNAcDNA文库文库(complementary DNA (complementary DNA library)library)的构建的构建1 1、cDNAcDNA文库：文库：以以mRNAmRNA为模板在反转录酶为模板在反转录酶的作用下将形成的互补的作用下将形成的互补DNADNA（cDNAcDNA）经过）经过重组扩增
15、得到的基因文库。重组扩增得到的基因文库。2.特点：长度小, 操作方便；便于筛选某一特定功能的基因；利于获得较多的模板；可在原核细胞中表达有生物活性的蛋白；不同种类不同状态的细胞的cDNA文库不同；不能研究基因组的结构功能；3. cDNA文库的构建过程1）mRNA的提取与纯化提取：选用目的基因mRNA表达最丰富的组织细胞为材料来源；纯化：将提取的mRNA在寡聚脱氧胸苷酸纤维素中进行亲和层析。2）cDNA第一条链的合成以Oligo(dT) 为引物，从模板3末端开始，沿53方向合成；随机引物：以68个核苷酸为随机引物，从mRNA的不同结合点合成全长cDNA第一链。mDNAmDNAc c c cDNA
16、DNA第一链的合成第一链的合成第一链的合成第一链的合成 55ppp5ppp5GGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOHOH 3355ppp5ppp5GGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOHOH 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 5555ppp5ppp5GGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOHOH 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 55cDNAcDNA第一链第一链第一链第一链引物引物引物引物退火退火退火退火逆转录酶逆转录酶逆转录酶逆转录酶dNTPsdNTPs 3）
17、cDNA第二条链的合成自身引物法置换合成法引导合成法c c c cDNADNA第二链的合成（第二链的合成（第二链的合成（第二链的合成（自身引物法）自身引物法）自身引物法）自身引物法）煮沸煮沸煮沸煮沸NaOHNaOHAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA55ppp5ppp5GGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOHOH 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 55TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 55TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 55AAAAAAAAAAAAAAAAAAA
18、AAAAAAAAAOHOH 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTOHOH 33KlenowKlenowdNTPsdNTPsS1S1cDNAcDNA第二链的合成（置换合成法）第二链的合成（置换合成法） DNApolDNApol dNTPsdNTPsRNaesHRNaesH55ppp5ppp5GGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOHOH 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 55AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAApp 5555S1S1 AAAA AAAATTTTTTOHOH 33TTTTTTTTTTT
19、TTTTTTTTTTTTTTTTTpp 5555TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTOHOH 33AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 5555TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 3333T4-DNA T4-DNA ligaseligase 4）cDNA与载体连接和导入宿主细胞三、筛选基因文库获取目的基因1.核酸分子杂交法2.免疫学筛选法从基因文库中筛选目的基因从基因文库中筛选目的基因从基因文库中筛选目的基因从基因文库中筛选目的基因密集铺板（密集铺板（密集铺板（密集铺板（1-101-10万）万）万）万）杂杂杂杂交交交交挖挖挖挖取取取
20、取铺铺铺铺板板板板铺铺铺铺板板板板目的重组克隆目的重组克隆目的重组克隆目的重组克隆第四节 转座子标签法获得目的基因基本原理转座子插入某一基因或其关键调控基因内部会造成隐性性状表达或产生突变，据此获得含有转座子的纯合体并构建基因组文库，以转座子特异基因为探针筛选阳性克隆，从中得到转座子两侧序列，以之为探针筛选正常的基因组文库获得目的基因。转座子标签法 导入导入 转座子转座子 含转座子的显性纯合体含转座子的显性纯合体AA* AA* 隐性纯合体隐性纯合体aaaa 突变或隐性表型突变或隐性表型A*aA*a 显性表型显性表型 AaAa aa A*a A*A* aa A*a A*A* 筛选筛选 构建基因文
21、库构建基因文库第五节第五节 图位克隆获得目的基因图位克隆获得目的基因图位克隆（图位克隆（mapbased cloningmapbased cloning），又称定位），又称定位克隆，基于某些生物已制备出精确的遗传图克隆，基于某些生物已制备出精确的遗传图谱。根据一些已知的与目的基因紧密连锁的谱。根据一些已知的与目的基因紧密连锁的分子标记可以获得目的基因。分子标记可以获得目的基因。一、染色体步移一、染色体步移二、染色体登陆二、染色体登陆一、染色体步移（chromosome walking） 按照已知的分子标记基因制备探针，与文库杂交得到阳性克隆，再用该阳性克隆内基因末端为探针，再与文库杂交，如此重
22、复，直到350kb以后，得到的阳性克隆为目的基因。 已知的分子标记基因 350kb 未知的目的基因n n染色体步移的缺点 得不到重叠克隆而被打断，前功尽弃 遇到重复序列而改变步移方向二、染色体登陆（chromosome landing） 构建插入片段平均长度大于目的基因与其紧密连锁的分子标记之间的距离的基因文库，可以通过筛库直接获得含有目的基因的大克隆，从中分离目的基因，称为染色体登陆。第六节 mRNA差别显示技术获得差异表达的基因mRNA差异显示技术（mRNA differetial display）：将mRNA逆转录和PCR技术结合起来的一种RNA指纹图谱技术，因此称DDRT-PCR。是一
23、种快速有效的克隆差异性表达基因的方法。原理： 用3 -端锚定引物和反转录酶合成cDNA的第一链；用3 -端锚定引物和5-端10-mer随机引物组成引物对，以反转录第一链为模板进行PCR扩增（DDRT-PCR），在标准的序列胶中电泳2-3小时，可显示出50-100条长度在100-500bp之间的DNA条带。3 -锚定引物： P.Liang等人设计合成了全部12种不同的引物，用以反转录mRNA，合成第一链cDNA。这种引物通常叫作3-端锚定脱氧核苷酸引物，并用5-T11MN或5-T12MN通式表示。其中M为除了T以外的任何一种核苷酸（即A、G或C），而N则为任何一种核苷酸（即A、G、C或T），故M
24、N共有12种不同的排列组合方式。mRNA: 5-NMAAAAAAAA-3(12种序列) 3-NMTTTTTTTTT-5 5-随机引物： 10-mer，更好的同第一链结合，从而呈现出更多种的mRNA。一般用20种随机引物和12种3-端锚定引物组成的全部240组引物对PCR扩增后，所产生的大约20 000条条带，涵盖了在一定的发育阶段某种类型细胞中所表达的96%的mRNA。第七节 酵母双杂交系统分离目的基因有效的分离能与已知的靶蛋白质相互作用的蛋白质的编码基因。应用于真核基因的表达调控，细胞粘合因子间的相互作用、信号转导通路以及细胞周期与分化、反式因子的鉴定与分离等研究。基本原理： 许多真核生物的
25、转录激活因子都是由两个结构上可以分开的、功能上相互独立的结构域组成（example）； 应用重组DNA技术，也可以将来自同一个转录因子的、或者两种不同转录因子的、分开的两种结构域，在体内重新组装成具有功能的转录因子，从而激活UAS（上游激活序列）下游启动子调节的报告基因的表达。Example: 酿酒酵母的半乳糖苷酶基因的转录激活因子GAL4，在N端1147位氨基酸区段有一个结合域（ DNA-binding domain, DNA-BD ）；在C端768881位氨基酸区段有一个转录激活域（transcription activation domain,AD）DNA -BD 能识别激活序列并与之结合；AD通过同转录机制中的其它成份之间的结合作用启动下游基因进行转录。 用DNA重组技术将它们分开，即使在同一个寄主中表达，也不会直接发生相互作用不能激活相关的效应基因进行转录。获取目的基因的选择策略获取目的基因的选择策略n n已知目的基因的部分序列，或其他物种中同源基因的保守序列；n n已知基因表达的蛋白产物；n n已知与目的基因紧密连锁的分子标记或有可操作的功能性转座子；n n组织、细胞或诱导特异表达。思考题： 试述构建基因文库的原理和步骤?
