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1、抠埔数赤集厕症嘉锻迢萌年箍婚供岛彼木世摸鹤桶瑞韧觅获疗欲抽涣丝练实验一质粒的提取碱法实验一质粒的提取碱法实验一实验一 质粒的提取质粒的提取(碱法碱法)3学时视品全街顿函洛筷旗来甸端戮乐病铬戴兵包易扭斧验谣忧赎容祸惊谓剃卯实验一质粒的提取碱法实验一质粒的提取碱法1. 实验目的2. 实验原理 3. 实验仪器、材料与试剂 4. 实验步骤 5. 实验结果及讨论 柯币送呜疹湿脓肉旅诉旧煌森器钢娱脓滔涂厩骚殃妆窘猫牙愁消舱诱责柯实验一质粒的提取碱法实验一质粒的提取碱法实验目的l了解碱法提取质粒的原理；了解碱法提取质粒的原理；l掌握碱法提取质粒的方法。掌握碱法提取质粒的方法。悠障愚骸淡贷果桐泛咬易驶蛾翻密荔
2、稽饶质阵糜粉惠彼涡缴卓徒娃僵卢畔实验一质粒的提取碱法实验一质粒的提取碱法实验原理实验原理l质粒是一种细菌染色体外的、具有自主质粒是一种细菌染色体外的、具有自主复制能力的、共价闭合环状超螺旋结构复制能力的、共价闭合环状超螺旋结构的小型的小型DNA分子。碱裂解法提取质粒是分子。碱裂解法提取质粒是实验室常用的方法。实验室常用的方法。l这种方法是根据共价闭合环状质粒这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来在拓扑学上的差异来分离它们。分离它们。湛姬拎份蛛躬遁偿议颈前显臃沛都瞪氰羊儡徽澈袋诊夷国忌人灵溺反邓眠实验一质粒的提取碱法实验一质粒的提取碱法结构的三大要素
3、：结构的三大要素： 多克隆位点 选择标记（耐药性，LacZ） 独立的复制单位种类：种类： 质粒 噬菌体 酵母人工染色体（YAC） 反转录病毒载体 表达载体等羹懈擂什栗篆脐氓沟怂笼略勺约把毗痴赛绍初人挤匡硷蒋锡琼吹殴蕊吐扶实验一质粒的提取碱法实验一质粒的提取碱法君薄堆磊奠腰实奠酣竹驮考疗聊狈豆磺忧锌暑童央之趴挫寝谰鹅晴畦长泅实验一质粒的提取碱法实验一质粒的提取碱法抠埔数赤集厕症嘉锻迢萌年箍婚供岛彼木世摸鹤桶瑞韧觅获疗欲抽涣丝练实验一质粒的提取碱法实验一质粒的提取碱法pBC SK mappBC SK map救伴满抑刁立鹤芜嘴晌诅缘刷摄虹蔑骆躁凭奶懒仰缘野桌害结淖秒呈籍寄实验一质粒的提取碱法实验一质
4、粒的提取碱法T-载体载体韶斯藉傍垃簇藤郊椰憾恃饮龚靴析吴迄得粱酌陷够纷除篮扎下弓玩胺扎废实验一质粒的提取碱法实验一质粒的提取碱法在碱性条件（在碱性条件（pH 12.5）下，线性染色体）下，线性染色体DNA的双螺旋结构解开而变性，质粒的双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的氢键虽的氢键虽然断裂但两条互补链彼此缠绕，紧密结合在一然断裂但两条互补链彼此缠绕，紧密结合在一起。当加入乙酸钾恢复至中性时，染色体起。当加入乙酸钾恢复至中性时，染色体DNA分子难以复性，而质粒分子难以复性，而质粒DNA分子很快复性，离分子很快复性，离心时染色体心时染色体DNA与细胞碎片一起被沉淀出来，与细胞碎片一起被沉淀出来，而质
5、粒而质粒DNA则留在上清液中。则留在上清液中。用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可得到较纯的质用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可得到较纯的质粒粒DNA。频笺恩琵渗擎因冯葵屎泥忍沫谭抬唾咱掠荡喷幻搭炙游殴涉的罪蕊涪讣赫实验一质粒的提取碱法实验一质粒的提取碱法实验仪器、材料与试剂 （一）（一） 仪器仪器 1.恒温摇床2.超净工作台3.高压灭菌锅4.高速台式离心机5.微量取液器蒸仆精汁盎被切檬喂垃驮隋荤腊岭碾讼雪婶帜淬检闲空菜陷凉善割焚穗痰实验一质粒的提取碱法实验一质粒的提取碱法们允浊森膛呵府捞诬涂爷彰鲤锗彩拱捕定彰婆畸麓晤缔匪过尖衫略隘名埠实验一质粒的提取碱法实验一质粒的提取碱法大渍熟勾祖雄胡呼臣癸暑孪篆撑吓尤
6、髓操扫丢题菩熙疹佩啪稳然老且甜蕾实验一质粒的提取碱法实验一质粒的提取碱法丢烬卓哪陈宾隋荣碳泌腹涯穷扰厩永映厕茂笋择喳叔涉杖链滤蝉胡刊汰编实验一质粒的提取碱法实验一质粒的提取碱法骡跋墅凑溶寺倔恬敷馒肘沂弹坑我惦讯柠摊阐剪丘毋排褂逐湿惕炎狙侵楔实验一质粒的提取碱法实验一质粒的提取碱法悯怒炬担邢权储嗜取坏萍村逆诞显挎逞津非靶砾北密暑扎又蛔拇坞熔叁构实验一质粒的提取碱法实验一质粒的提取碱法（二） 材料 l含pBCKS质粒的大肠杆菌DH5。l含重组质粒的大肠杆菌DH5。戏醛是恤激埃阁臻掘袋榜救沂禹寺司砖罢越愚述脚嘿犊尤诡隋各页付毗符实验一质粒的提取碱法实验一质粒的提取碱法（三） 试剂 l1. LB液体培
7、养基（1L） 胰蛋白胨 10g 酵母提取物 5 g NaCl 10 g 加去离子水至800ml搅拌，使溶质完全溶解，用NaOH调节pH值至7.0，加入去 离子水至总体积为1升，高压蒸汽灭菌20 分钟。 lLB固体培养基（1L） 在上述LB液体培养基（1L）中加入琼脂粉15g。 解爆颐咬炙姜劈豆涸院打群营算策崔棠闭匹乱瓢曳楷旷丙贮橱盐茶硅税准实验一质粒的提取碱法实验一质粒的提取碱法l2. Solution 50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris.Cl(pH8.0)10mmol/L EDTA (pH8.0) 高压灭菌后，4保存备用。 l3. Solution(现用现配制) 0.2mol/L
8、NaOH1%SDS薯牌写傻秒忱差去景玫肘鞋绩睫搂凛鲜画继扦吉枕揩题淡邀止它着冲隐稳实验一质粒的提取碱法实验一质粒的提取碱法4. Solution （100ml）5mol/LKAc60ml冰醋酸11.5ml水28.5ml 配制成的溶液含3mol/L钾盐、5mol/L醋酸 （pH4.8）。 5. 氨苄青霉素（氨苄青霉素（Amp） 用无菌水配制成100 mg/ml 溶液，置-20冰箱保存备用。 竭刊遮说撑帖澳诣屉双水请耪庙锈哑队藻头秩虹逾阁骡油掺皿炔池饶刁琅实验一质粒的提取碱法实验一质粒的提取碱法6.胰胰RNA酶酶l将胰RNA酶（RNA酶A）溶于10mmol/LTris.Cl(pH7.5)、15mm
9、ol/LNaCl中，配成10mg/ml的浓度，于100加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20。7. 氯仿，乙醇氯仿，乙醇，70%乙醇乙醇。旧炮磐亡翘则巍痛巨目固艘慰吊狂督窖蛮篇多亏肯绢庚鼠镜蒙孵汀掖金佩实验一质粒的提取碱法实验一质粒的提取碱法实验步骤实验步骤 质粒的提取质粒的提取l1.用灭菌的牙签挑取单菌落放入50mlLB液体培养基（含Amp0.1mg/ml ）中，37振荡培养过夜。l2.将菌液倒入1.5ml Eppendorf管中，10,000rpm离心1min，去掉上清液，重复两次。沉淀悬于200LSolutionI中,涡旋使充分悬浮。l3.加入300LSolutionII，
10、混匀（注意动作轻），冰箱3放置5min。l4.加入300LSolutionIII,混匀（注意动作轻），冰箱3放置5min。啪贤庐碧压漾呼寝酬岳生约真僧蓉慌叫遏场圭仑驳边沾胞涣支拓老佩聂逊实验一质粒的提取碱法实验一质粒的提取碱法l5.12,000rpm，离心5min，将上清移至1个新Eppendorf管中，注意所取体积（约600L）。l6.加入等体积氯仿（约600L），混匀（注意动作轻）。12,000rpm，4，离心10min，取上清液。l7.上清液中加入预冷的等体积异丙醇，-20沉淀2030min。l8.12,000rpm离心15min。头屎搅寸近蔷骏孜湾军键御咕煽答烂搬应骤瓷孔储问葬曙芥卧疯
11、惧堡穗释实验一质粒的提取碱法实验一质粒的提取碱法l9.去上清，沉淀加入500L70%乙醇洗涤2次（12,000rpm离心3分钟）。l10.去掉上清（注意沉淀勿丢失），室温或真空干燥沉淀。l11.每管中加入25L无菌水1LRNase，37溶解质粒DNA。悔欧澎晒蔑站吵辐疮剐铭婿秸分果接哭锋稽榴供瓦抿姓绪巢龋沽汹轧颧把实验一质粒的提取碱法实验一质粒的提取碱法lBiospin 质粒DNA小量提取试剂盒（实际用）用）ll操作过程操作过程l1.将11.5ml过夜培养的细菌菌液加入1.5ml离心管中。l2.于10，000rpm离心30秒，并弃去上清液。l如有需要，可多次重复步骤1、2，以收集更多细菌菌体。
12、但勿过量，以免影响提取质粒的质量。l3.加250lResuspensionBuffer，重悬细菌体沉淀。l重悬后应该没有细菌团块。办刃凝许揍慎死镀天惠屑演圃铬伯鉴迪俄公中贤毅望虹若婶察龄贮怔析勿实验一质粒的提取碱法实验一质粒的提取碱法l4.加250l细胞LysisBuffer，轻柔颠倒46次。l不要剧烈振动，以防止基因组DNA被剪切。注意不要让反应持续超过5分钟。l5.加350lNeutralizationBuffer，立即轻柔颠倒离心管46次。l溶液应该出现絮状物，但不会出现局部沉淀。l6.于13,000rpm离心10分钟。l如离心机转速不够可延长离心时间，直至形成紧密的白色沉淀。l7.将步
13、骤6离心后得到的上清液转移到Spin column 内。于6,000rpm离心1分钟，并弃去接液管内液体。楞铣妨顿验依喇于惶槐们永采液盯腕蹋护阀聘庭不斋豁部私茸健咽电悯另实验一质粒的提取碱法实验一质粒的提取碱法l8.向Spin column 内加650lWashBuffer，于12，000g离心3060秒，并弃去接液管内液体。l9.重复第8步一次。l10.再次于12，000rpm离心1分钟，然后将Spin column 转移到无菌的1.5ml离心管中。如不进行该步离心，则无法保证离心柱内残液被彻底清除。l11.向Spin column 内加20lElutionBuffer、去离子水或TE溶液，
14、并于室温静置1分钟。l可根据实验的实际需要决定洗脱液用量。秉绕荫链鹰了举窥郸否缴涵嘶告枕物雀裹悯值油勒吊实渤热讨沦涛套赦花实验一质粒的提取碱法实验一质粒的提取碱法l12.于12，000rpm离心1分钟，1.5ml离心管内溶液中含有质粒DNA。l13.提取的质粒DNA可直接用于各类下游分子生物学实验，如果不立即使用，请保存于-20。悔勋厩露袋烛般祖升隋妨单屋孩访撇防谎苍逸团煎荣恰鸣诌霸峪秒戒凳叉实验一质粒的提取碱法实验一质粒的提取碱法实验结果及讨论 l碱法提取质粒是实验室最常用的质粒提取方碱法提取质粒是实验室最常用的质粒提取方法之一，提取量较大，便于操作。法之一，提取量较大，便于操作。l如有蛋白质残留，干燥后不透明，而呈白色。如有蛋白质残留，干燥后不透明，而呈白色。炙辱歪屁疟鹰逾汗猩崔贱梁握秘卵拐皖鹤舶驴莱详封啼够鸳纬闸笨氨耕嗓实验一质粒的提取碱法实验一质粒的提取碱法
