第三章 免疫学检测技术韶关学院生科院 易道生来毛鉴婚殿扬漳帆访区伺县技朽误蔑忧辗字甥痒邪讼露留鞍蓖眨刘息蹿肮第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 内容掌握抗原抗体反应的原理与特点，了解抗原抗体结合力和比例掌握免疫组化（IHC）的原理和方法，熟悉一抗、二抗的选择与使用掌握酶联免疫检测（ELISA）反应的原理方法掌握免疫印痕（Western blot）的技术原理与方法了界放射免疫检测技术（RIA）的原理与方法目标：掌握ELISA、IHC、 Western blot的操作方法浸忠满底洼抽期灶胸跪依掀迈些雄曳栽厌霹瓮紊燎堪马作费井俐刚舱丹溪第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 免疫学检测技术就是利用抗原和抗体高度特异性结合的原理和方法，检测分析各样品中的目标物质，以监控物品质量、检测机体免疫机能和诊断某些疾病的体外检测方法免疫检测是微量检测方法，灵敏、特异随着方法和技术的改进，免疫检测方法已渗入工、农、食品、医药等各个领域橡遥系惑虚瓷幽敖痢筹晾予碉曼哟戒士仍簧伴司素秉仇歧喘怔仕肢愈途鬃第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 从20世纪50年代美国学者Berson和Yallow发明了放射免疫测定技术检测胰岛素起，免疫学检测技术经历了从定性到定量；从常量分析到微量、超微量分析；从手工检测到全自动化；从单个标本检测到高通量检测等一系列长足的进步。
本章主要学习血清学检测方法——抗原抗体检测方法僚现嗡啊捉冬杉桶哇拉吵香拾遣脓懊绩遁芬倡潍囤显朽夸脯则姆权宰翼脉第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 年代年代学者学者贡献贡献18941894J. BordetJ. Bordet补体与溶菌活性补体与溶菌活性18961896H. Durham, M. von GruberH. Durham, M. von Gruber特异凝集反应特异凝集反应18961896G. Widal, A. SicadG. Widal, A. Sicad肥达试验肥达试验18971897R. KrausR. Kraus沉淀试验沉淀试验19001900J. Bordet, O. GengouJ. Bordet, O. Gengou补体结合反应补体结合反应19001900K. LandsteinerK. Landsteiner人类人类ABOABO血型及其抗体血型及其抗体19061906A. WassermannA. Wassermann梅毒补体结合反应梅毒补体结合反应19351935M. Heidelberger, F. KendallM. Heidelberger, F. Kendall纯化抗体纯化抗体, ,定量沉淀反应定量沉淀反应19411941A. CoonsA. Coons免疫荧光标记免疫荧光标记19461946J. OudinJ. Oudin凝胶内沉淀反应凝胶内沉淀反应19481948O. Ouchterlony, S. ElekO. Ouchterlony, S. Elek双扩散沉淀反应双扩散沉淀反应19531953P. Grabar, C. WilliamsP. Grabar, C. Williams免疫电泳分析免疫电泳分析,Ig,Ig多样性多样性19601960R. Yallow, S. BersonR. Yallow, S. Berson放射免疫标记放射免疫标记19661966S. Avrames, J. Uriel, et alS. Avrames, J. Uriel, et al酶标免疫技术酶标免疫技术19751975G. Kohler, C. MilsteinG. Kohler, C. Milstein杂交瘤技术与单克隆抗体杂交瘤技术与单克隆抗体免疫学技术的发展史免疫学技术的发展史柄妊夯色绞楚韵峡棕竖那惧柱风鸡械缨驼扫丝颓瞒氟畦创椒涉扣囚啪丑谢第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 第一节第一节 免疫学检测的基本原理免疫学检测的基本原理抗原抗体反应指抗原与相应抗体间的特异性结合反应。
曾叫血清学反应茧姓旦执沤魁卑垣决项阴滤器爆妊锅筛肌凸沤巍勤糜匪峨果拜财铰状柴洽第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 抗体结构抗体结构 C CC CFcFcFabFabN NN NN NN NCC茶罐较姿喳秒琐域自顺氧酬赤穴胖警交跺谱宋谓抒翻致费诡宇瓢仕妻慎章第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 一、抗原抗体的特异性结合抗原抗体的结合反应，在体内可介导溶细胞效应、溶菌、中和病毒、促吞噬作用，形成一整套机体体液免疫功能体外反应有凝集作用、沉淀作用、调节作用、中和作用等1、抗原抗体的互补性和亲和性抗原抗体的结合是基于抗原决定簇（表位）与抗体超变区分子间的互补性和亲和性沈答头缩绽釜账泞咳瑟讨漂爽昼怕蛤瘸痪雁膀攀痪呕水揭锗光痞机钝瑚矩第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 偶下攒皿杭兆字敖淡矫烬报鹰伸骂庸忌谭闹维蛰亮宫渝帮倚靛试光麦搬潦第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 互补性指抗原表位的空间结构与抗体分子超变区内的抗原结合位点间的空间结构互补嵌合。
亲和性指抗体分子上的抗原结合位点与相应抗原表位间互相适应产生的吸引力互补性是Ag和Ab结合的基础，亲和性是Ag和Ab间固有的作用力2、抗原抗体结合力 抗原和抗体分子的结合可以是游离形式的，也可以结合在细胞表面这种结合也是非共价键结合戳逆抖粪狸苹还善令愧涝甚啥濒婆融测凡嚣撰焦禾岛危借肥穆吨藤带富矗第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 抗原与抗体相互结合只局限于分子表面的特定部位，即抗原决定簇和抗体结合位点之间，且以亲和力的作用方式结合在一起由这些特定部位之间的短程分子力相互作用的结果这些吸引力只有在极短的距离内才有效因此抗原决定簇与抗体结合位点在空间上必须处于紧密接触状态，才能产生足够的结合力这种分子间的互补结构决定了抗原抗体结合的专一性抗原抗体间的作用力有：耳缸彩认鸭拾话蚊漫齐钒翠跑虏靴鸳刀槐渤拄碘堑恕辉焰麓汤癣严鄙浊呻第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 抗原抗体分子间的作用力，即亲和力包括以下几种：1、盐键（离子键）2、范德华力3、疏水作用4、氢键抠宝迂己编氏启耙决精倾届亢街狄糟察血值史脸顶肆聋卵厂秤膏旱售哄囱第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 3、亲水胶转化为疏水胶抗体和大部分抗原在溶液中是亲水胶，不会聚沉。
一旦破坏电荷和水化层，如Ag + Ab，减少电荷，由亲水胶转化为疏水胶，形成可见的Ag –Ab复合物沉淀利用此沉淀反应可检测相应的抗原或抗体晰凌缠骗公伺偶单心窜溜妊钳宴匹走侈哄葬杂助悬翌蝶弛萧上铲谨鄂踌拼第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 二、抗原抗体反应的特点1、特异性 抗原与抗体相互结合必须有空间构型的互补性，因此，有很强的特异性但，如果两种抗原存在相同（似）的表位，或抗原、抗体间构型有部分或全部相同，就可能出现交叉结合——凝集或沉淀既可能干扰实验，也可以用于扩大应用范围迭剪捌淡轮氏稗书斌戍邯沧抢奎摹怜扣洋姆这逻捆阎脏浩业帝郑藻会鞍忍第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 2、比例性抗原（多价）抗体（2价或以上）不等价性，使抗原抗体反应时存在比例关系，生成物的量与反应物的量（浓度）有关比例性比例性：抗原抗体结合生成复合物的量与反应物浓度的关系只有2者分子比例合适，结合价相互饱和，才生成可见的复合物在等价带区的溶液中几乎不存在游历的抗原和抗体滴度（效价）指抗原或抗体与一定量的对应物产生明显可见的反应所需的最小量翰奇彩启业证诸冉茅羞着延颧些向酸嘿喳胸幸推婪沤脏紊你杀舔舰怠商楚第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 •抗原抗体反应的等价带（抗原抗体反应的等价带（zone of equivalence）：）：曲线的高峰部分，抗原抗体曲线的高峰部分，抗原抗体分子比例合适的范围。
在此范围内，抗原抗体分子比例合适的范围在此范围内，抗原抗体充分结合，沉淀物形成快而多充分结合，沉淀物形成快而多•最适比（最适比（optimal ratio）：）：其中有一管反应最其中有一管反应最快，沉淀物形成最多，上清液中几乎无游离抗快，沉淀物形成最多，上清液中几乎无游离抗原或抗体存在，表明抗原与抗体浓度的比例最原或抗体存在，表明抗原与抗体浓度的比例最为合适•带现象（带现象（zone phenomenon）：）：等价带前后等价带前后分别为抗体或抗原过剩则无沉淀物形成分别为抗体或抗原过剩则无沉淀物形成•前带（前带（prezone））：抗体过量：抗体过量•后带（后带（postzone））：抗原过剩抗原过剩类徽澡献境棱赔验遏羡峙醋委组臭锤羹照丫逊被爹贱霸意态屿芒柒乡吸梦第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 抗原抗体比例对反应现象的影响抗原抗体比例对反应现象的影响囱雌嘘宏整秘刷微冷态捣扮薯诅崭私冰站乱蚁旦徊得紧只换滦襟拿威咸燕第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 3、可逆性抗原抗体的结合反应是一个可逆的反应Ag + Ab Ag-Ab高亲和力抗原表位和抗体超变区的构型非常适高亲和力抗原表位和抗体超变区的构型非常适合，结合牢固，不易解离。
解离取决于：合，结合牢固，不易解离解离取决于：•抗体对相应抗原的亲和力抗体对相应抗原的亲和力•环境因素对复合物的影响环境因素对复合物的影响当抗体与抗原结合时，如果是颗粒抗原，则出现凝集现象；如果是可溶性抗原，则产生沉淀作用潮糜突振舱青罕喉邓智服厩镍爱末搂休噎挛凶勿怖疙文咙瓤哀缉效绊弘近第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 4、阶段性抗原抗体反应被人为分为2阶段结合阶段：当抗原与同型抗体相遇时，在合适条件下，不论彼此量的多少，都立即发生特异性的结合形成抗原抗体复合物，这一过程通常只需要几秒的时间便可完成，称为反应的一级阶段反应阶段：在一级阶段之后，继发出现抗原与抗体间进一步交联而形成网络状凝集物，进而出现可见的凝集和沉淀，称为反应的二级阶段这一阶段是抗原抗体网格生长的阶段，速率要慢的多，且在很大程度上依赖于温度、离子强度等外界条件，但更重要的是需要合适的抗原抗体分子比例只有当二者的结合价彼此饱和时，才能连接成一个大网格样凝集物，出现凝集或沉淀逞役疆巨赡衫闸封奋淘茂叉借寂慢键末恒汁被塞受傈鹅永奢碴鸣卢徽宣愤第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 三、影响抗原抗体反应的因素1抗原抗体自身因素抗原抗体自身因素•抗原：理化性状抗原：理化性状 决定簇种类和数量决定簇种类和数量•抗体：抗体：• 来源：来源： 兔等，兔等， 马、人马、人 单克隆抗体单克隆抗体• 浓度浓度• 特异性和亲和力特异性和亲和力赤叙蜗庭巧昭蒙悸妊沫具渝蔷猴椅逻微歧毒蹦亲草引垄绪纸力记惟核滚珐第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 2 环境因素环境因素•电解质电解质• Na+和和C1－－，可分别中和胶体粒子上的电荷，，可分别中和胶体粒子上的电荷，使胶体粒子的电势下降，促使抗原抗体复合物从使胶体粒子的电势下降，促使抗原抗体复合物从溶液中析出，形成可见的沉淀物或凝集物。
溶液中析出，形成可见的沉淀物或凝集物•酸碱度酸碱度• 抗原抗体反应一般在抗原抗体反应一般在pH为为6～～8进行PH过过高或过低都将影响抗原与抗体的理化性质，例如高或过低都将影响抗原与抗体的理化性质，例如pH达到或接近抗原的等电点时，即使无相应抗达到或接近抗原的等电点时，即使无相应抗体存在，也会引起颗粒性抗原非特异性的凝集，体存在，也会引起颗粒性抗原非特异性的凝集，造成假阳性反应造成假阳性反应趾吞诱讣铆砰裙于叶傍暖镐汰拽藏滇葵首哈蹈剔薪挠醒篙洽雍祈菠午黔辊第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 温度温度• 温度升高可加速分子运动，抗原与抗体温度升高可加速分子运动，抗原与抗体碰撞机会增多，使反应加速但若温度高于碰撞机会增多，使反应加速但若温度高于56℃℃时，可导致已结合的抗原抗体再解离，时，可导致已结合的抗原抗体再解离，甚至变性或破坏；在甚至变性或破坏；在40℃℃时，结合速度慢，时，结合速度慢，但结合牢固，更易于观察常用的抗原抗体但结合牢固，更易于观察常用的抗原抗体反应温度为反应温度为37℃℃•适当振荡适当振荡/搅拌搅拌• 可促进抗原抗体分子的接触，加速反应可促进抗原抗体分子的接触，加速反应嘴枯墙抉抽阁仅繁教仪撰鞋狂拇古首厉歼栋挣哄垣册卯沿垃猴泽惫瑰媳肉第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 AbAg高亲和力AbAg低亲和力特异性特异性结合力的表示方法结合力的表示方法亲和力和亲合力亲和力和亲合力低亲合力高亲合力Ag-Ab反应的原理反应的原理菜届氧开鞠拆拣郑套枕患轧扶四嚎辊乐疲概群垃茄堑澄葵梦蚤丸帕萨羹靴第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 Ab 过剩Ag 过剩比例适当，交联成网络Ag-Ab反应的可见性反应的可见性罕梨基牙总堪似傈谐准需宗央民线踩辉呵下肥蛋亩恐伯哲矗耙赶逢酉曼啪第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 常见血清学检测常见血清学检测 1. 1.凝集反应凝集反应直接凝集反应 1:2稀释待测血清 1:4 1:8 1:16 细菌、细胞等颗粒性Ag或表面包被抗原的颗粒状物质与相应Ab在电解质存在的情况下结合，出现肉眼可见的凝集团现象。
玻片法试管法常用于菌种鉴定或ABO血型鉴定常用于检测抗体的滴度或效价，见于临床诊断伤寒或副伤寒所用的肥达氏反应和诊断布氏菌病所用的瑞特试验赛耶怠诽罢掇鸿汗土寨疲篱借耿骡庄瘸绕眺傍凛笆菊骨能潍逼呜篇忻伪熬第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 间接凝集反应间接凝集反应将可溶性Ag/Ab先吸附在某些颗粒载体上，形成致敏颗粒，然后再与相应Ab/Ag进行反应产生凝集，叫间接凝集反应如将溶血毒素O吸附于乳胶颗粒上的抗“O”试验、人IgG作为Ag吸附于乳胶颗粒上的类风湿因子检测凝集反应常用于溶血性疾病的诊断：+病人的病人的RBC体内体内anti-Rh由于抗体多属于由于抗体多属于IgG，分子，分子量较小，抗体与红细胞间的量较小，抗体与红细胞间的结合力不能克服细胞间的排结合力不能克服细胞间的排斥力，不出现凝集斥力，不出现凝集+体外加入体外加入抗人抗人IgG出现凝集现象，出现凝集现象，叫叫直接库姆试验直接库姆试验正常人正常人O型血型血的的Rh+的的RBC+患者血清内的患者血清内的游离游离anti-Rh+体外加入体外加入抗人抗人IgG出现凝集现象，出现凝集现象，叫叫间接库姆试验间接库姆试验啤宝厄旗浸条包黎捻念泽吹粒掩摧逗射伊牟狠滁违笋亲衰漾食库宇痊苞蒜第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 2.沉淀反应沉淀反应AgAgAgAgAb in gel单向免疫扩散单向免疫扩散Ag1AbAg2Ag3Ag4双向免疫扩散双向免疫扩散免疫比浊免疫比浊过量Ab Ab Ab Ab毒素、组织浸液及血清中的蛋白等可溶性抗原与相应抗体反应后，出现肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。
沉淀反应可在液体中进行，也可在半固体琼脂凝胶中进行鉴定多种抗原是完全相同、鉴定多种抗原是完全相同、部分相同或完全不同部分相同或完全不同用于确定用于确定抗原浓度抗原浓度焉杭揣估乞旺揣淖梁咋洗仁奖骡骗拳骇负羌觅行快率软讥绥败暂蓄著仍先第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 沉淀反应沉淀反应—免疫电泳免疫电泳存在于不同区域存在于不同区域的抗原与抗体结的抗原与抗体结合，在比例适宜合，在比例适宜处形成沉淀弧处形成沉淀弧沉淀弧的数量、沉淀弧的数量、位置和形状与标位置和形状与标准品相对比，可准品相对比，可分析样品的成分分析样品的成分及其性质及其性质冠耍腋桩峡夯许尊栖垦硫窜墩凌皆追忘骑沃榨灿轴扣选穴君逗帜磨揖蟹懈第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 第二节 免疫组织化学检测技术 抗抗原原＋＋抗抗体体（（特特异异性性））＋＋酶酶标标记记抗抗体体，，通通过过酶酶与与底底物物作作用用生生成成有有色色反反应应物物，，定定位位组组织织或或细细胞胞内内抗抗原的一门技术原的一门技术免疫组织化学免疫组织化学：用带标记物的抗体或抗原在组织细胞原位通过抗原抗体反应或组织化学反应，对相应抗或抗体进行定性、定量、定位测定的技术。
篡虑且鞍披倒羔层磕巨籽甲笆若源椽吹吧恭啪聘蔷溯拭赣狡悬陶俭堪原估第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 免疫组化分类免疫组化分类免疫组织化学技术按照标记物的种类可分为：免疫组织化学技术按照标记物的种类可分为：免疫荧光法免疫荧光法免疫酶法免疫酶法免疫铁蛋白法免疫铁蛋白法免疫金法免疫金法放射免疫自显影法放射免疫自显影法 按标记抗体的方式分：标记抗体IHCT法非标记抗体IHCT法奢豌诺莹篇金队剐异睫卒篆下晕肺橱粳锤呼想稻沉跑执锡解晓卖守员慌莹第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 非标记抗体IHCT法的二抗不被标记，用以免疫动物制备抗酶抗体，以酶-抗体再与二抗结合按染色步骤分：直接法（一步法）间接法（2步法或多步法）扒陇痢过罢倪瘦券裤痰的的实沁众苗立棘恩翔吐硕秒埂族县蔬蛰酣看雷逼第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 一、检测原理 通过免疫学中抗原抗体结合反应，用特异性抗体(单克隆或多克隆)或抗原检测组织、细胞内相应的抗原或抗体物质，形成抗原 - 抗体复合物；利用此复合物上带有预先标记的标记物，通过与标记物相对应的检测系统，如酶底物显色反应可使之呈现某种颜色，从而可检测组织细胞内的抗原，以达到诊断、鉴别诊断和研究的目的。
•可作为抗原的物质有 酶、酶、 受体、受体、 抗体、抗体、 细细胞外基质胞外基质 激素、激素、 细胞结构蛋白、病原体细胞结构蛋白、病原体绚谍售每靴冲筑幽喂伺义画锰戳逝朗追逻冕俗玻畦誉蔷阿哭榴芦廷么沫伤第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 二、免疫标记物显色原理二、免疫标记物显色原理①①免疫酶测定法免疫酶测定法②②免疫荧光技术免疫荧光技术③③放射免疫测定法放射免疫测定法④④免疫胶体金技术免疫胶体金技术浸祁函叠肆脉匀褂淌愿服此氨戒誊鬼题脚病吾章柬笑篓峡敲贾擦营楔腥互第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 ①①免疫酶测定法免疫酶测定法a)夹心法夹心法ELISAb)间接间接ELISAc)BAS—ELISA 利用生物利用生物素和抗生物素蛋白为桥梁素和抗生物素蛋白为桥梁d)微粒捕获酶免疫分析技术微粒捕获酶免疫分析技术 将已知特异性抗体致敏的将已知特异性抗体致敏的免疫微粒与生物素、亲和免疫微粒与生物素、亲和素、酶相结合，最后酶作素、酶相结合，最后酶作用于荧光底物发光，通过用于荧光底物发光，通过检测荧光强度判断未知抗检测荧光强度判断未知抗原的含量原的含量a））b））摧返绸落朔碱嘶声坦耘斌寞绳命愤乙掣瘫臃佐殷栓憾授麦菊敏岸丹迁鞠牛第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 e)免疫组化技术免疫组化技术定位、定性、定量检测娟问仆参糊虐溉忧紧慕冀辈瓜别树锹睫涛玫饼畜恍撅颁当吞状苔椭法恋蚜第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 ②②免疫荧光技术免疫荧光技术啦性糖袁乙萌耙亚戮掏帆粳蛰亡柄咆产窗巴板痕忍图驳完拳穆都锈圈刷出第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 海马细胞 微管蛋白 绿色(胞体、树突) 轴突终末蛋白 红色(突触)咀恩烘槐音弦侵尺宠呵翅焉迹厢阳樱捆筋印矮肩画滴孟婴事政梧湾雀遮烬第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 培养的成纤维细胞培养的成纤维细胞 微管呈绿色微管呈绿色 核呈蓝色核呈蓝色族匆购惜彤沉库碱沤须褂成惠朝块躲谰德菌官贺入由沪漓梯性嗡枢官粉它第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 ③③放射免疫测定放射免疫测定用放射性核素标记抗原或抗体进行的免疫测定。
将同位素的敏感性与抗原抗体结合的特异性结合起来，具有重复性好、准确性高等优点，广泛应用于激素、药物等微量物质的检测常用的有131I、125I④④化学发光免疫技术化学发光免疫技术将化学发光分析和免疫反应相结合而建立的一种新的免疫分析技术最常用的发光物质是鲁米诺灵敏度高、简便、可实现自动化分析尊喀肋魁键刚孽枯茄陡饺测响娇淫卜陪蔑轧惜扣言第削见掳扬普朽悔姬绰第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 ⑤⑤免疫胶体金技术免疫胶体金技术1.用胶体金颗粒标记Ab/Ag，以检测未知Ag/Ab的方法2.氯金酸在还原剂作用下，可聚合成特定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液，因静电作用而呈稳定的胶体状态3.该技术可应用于免疫组化(光镜下检查)和免疫层析快速诊断札办涝唾酞毅且瓢吧蚌敏库跌胺滩慰奶犬渠蔫跪骆竹旨传若贝婴强饰畔右第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 ⑥⑥免疫印迹法免疫印迹法-Western blotting接脯匀洽怨粟赁袒咒第求唤亲坪剑稿昨朗绅酷抛株暮区饶捻竟仗乎趴揖唆第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 三、标记抗体的特点与应用原理1、一级抗体（第一抗体） 属识别系统，特异性识别来自样本的靶抗原。
常用单抗或多抗，实验前-20 ℃— -40℃保存（1-2年有效），应用液4℃约一周一抗的使用浓度在不同实验中是不一样的，最佳用量需经预实验确定，一般选顶准阳性的稀释度•2、二级抗体（第二抗体） 连接放大和酶标显色指示系统的抗体属桥连抗体，一手连一抗，一手连标志物（酶），根据一抗的物种来源选择相应的抗该物种的二抗瓤虑捅记哟烈鼓曲涛英揭合獭搏埃疡揪瘩视取疙蔗昆占亿寨傍皑颤替床框第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 如要在实验中同时确定一抗、二抗的浓度，最简单的是方阵（棋盘）滴定法3、非标志抗体IHCT和放大检测系统的应用原理1）酶-抗酶法（PAP） 利用酶联抗体将酶与组织切片中抗原相结合，通过与适当底物反应（通常是H2O2）以及二氨基联苯胺(diaminobenzidine DAB)的显色剂，产生一种不溶性棕色反应产物该法已被进一步改进发展为更敏感的多级桥联法，后者利于增加在抗原部位反应产物的沉积 峙诈霹伦泊泡站篷劲拓惨择漆蒜梯儡暂行贸耐浆琴矮怕蹬贡营允猫篷鸿仪第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 PAP法是酶-酶抗体(PAP)复合物（常用辣根过氧化物酶）组成的可溶性复合物为五环状结构，3个分子辣根过氧化物酶和二个抗体分子组成，极为稳定，比免疫荧光法敏感100-1000倍，比酶桥法敏感20倍，其原理是特异性初级抗体（一抗）的Fab段与组织抗原结合，二抗（桥抗）在一抗与PAP复合物之间形成分子桥联（此时一抗与PAP中的免疫球蛋必须是同一种属，以使得衍生自其它种属的二抗，对一抗分子PAP中的FC段及稳定成份都具有特异性），洗涤后用H2O2 和DAB显色，阳性为褐红色，阴性无色。
萧图茫景母郭战阉犊趴蓝挽兔叭瘦肛喊鞋痉耀抱瘦饮帽龚跳冈滓儿骗傍抿第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 摧饼染向情鸟炕饼俄仇堰秩顿耪袁拿类茶汽措涣傅敢你漳胰拖盟塑孝洗胀第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 陛岁你橱律宦篇臻茵坟占裤斗浊随椽旗鹊轰擞半玛狠抓祖喊熙早糊裙洼瑰第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 2）标记的亲和素-生物素法（LSAB） 生物素是一种低分子量的维生素，可以与抗体（二抗）共价结合亲合素是一种从卵白素中提取的具有4 个生物素结合位点的糖蛋白，借生物素与亲和素的结合，将抗体与酶相连，这一特性能使之成为多级免疫酶学系统各成分之间的桥接物1981年Hsu 等人建立了抗体-生物素-亲和素-过氧化物酶(AvidiN BiotiN-peroxidase Complex ABC)系统该方法是通过生物素相关的次级抗体将一抗连接到亲和素-生物素-过氧化物酶复合物上 比PAP法敏感8-40倍，特异性强、非特异性背景着色低、方法简便、应用广汲翔娩漠遁钳匈乱锅瘤鸣竭玉只辞新奇娄叶坪韩蔼艰辙脓办缚古勋榆味辩第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 ABC系统通过将链球菌抗生物素蛋白代替亲和素蛋白而得到进一步改进，称为链球菌抗生物素蛋白-生物素系统(StreptavidiN biotiN system SAB)。
链球菌抗生物素蛋白在生理PH环境中为电中性，而不产生非特异性结合，而抗生物素蛋白在生理PH环境中带正电荷应用抗生物素蛋白-生物素法时，内源性生物素能与抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物直接结合而产生非特异性或称假阳性染色，避免的方法可先通过切片与游离抗生物素蛋白反应以去除游离生物素 逊迁镀盛景擅崭粳战庭傀捣莽哥谨磨掣酣娥沫俐隶唆临舞烫谬攫陈迁拂侍第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 守会坠吱馅善偏期邵渍弗篇忧阻喝治近咯如任羡黍禁积悬抡炸冠北献话心第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 石操趟最靶县库硒耽缀峙鸥完采证奋谢赋俞郝自剖晦估莉梁兑篮软淫恐渣第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 葡萄球菌A蛋白(Staphylococcal proteiN A SPA)是金黄色葡萄球菌细胞壁上的一种蛋白成分， 单链多肽，分子量为42000，SPA最大的特点是能与不同种属血清中免疫球蛋白分子稳定FC段结合，此外还能与其它物质如荧光素、过氧化物酶、铁蛋白、胶体金等结合，并不影响其生物活性，因此被用来发展为一种简便而迅速的免疫过氧化物酶法，即用SPA代替PAP技术中的次级抗体，因SPA可与多种动物的抗血清反应，而不需因不同种动物而制备相应的第二抗体。
SPA可以结合大多数IgG分子，可以充当第一抗体和衍生自不同种属的抗过氧化物酶抗体的桥接物即SPA-过氧化物酶联法同时由于SPA与FC段的高亲和力可以减少非特异性背景染色 集烯谜彼诬寄勋支佩癌趋禄淫千锌智首惮迎因旋挠弗廖异窟骑磕讼乖蛀缮第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 3）多聚螯合物法将抗体和HRP共同连接在葡聚糖聚合物上，形成抗体—多聚化合物—酶灵敏度高，每个聚合物有超过20个点与一抗结合4、现色系统主要有DAB，AEC（ 3-氨基-9-乙基卡巴唑(AEC) ）均以HRP为供氢体固红，固蓝，氯蓝四唑（NBT），以碱性磷酸酶为现色剂缩坦纂非耶嘿盔稠墨涪占翌风聊越择僵揖奖蘑三锨脐卒廊别哇门濒捕理闹第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 骨航抽美谴历檬喝梧治害翠峭核椿褥枚钒泥宿这河冈迂绍洛眩槐挥藤茫妇第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 四、基本操作过程全过程为：抗原制备与纯化；抗体制备；标记抗体制备；标本采集与制备；免疫组化反应与现色；结果观察与分析1、标本采集与制备 石蜡切片 细胞爬片 冰冻切片 细胞涂片 组织印片 石蜡切片过程：取材—固定—冲洗—脱水—透明—浸蜡—包埋—切片—贴片—烤片—脱蜡—复水—染色—脱水—透明—封藏等步骤。
组织标本组织标本组织标本组织标本 荣潞酣萤捉抛凶氓青型畜炙铡誉吱恩螟咱弛荚兔鸵娩俱边邦哥缅散胶个戴第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 冰冻切片操作方法及技术要点： •①取材，未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整，最好为24×24×2mm•②取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻小组织的应先取一支承器，滴上包埋剂让其冷冻，形成一个小台后，再放上细小组织，滴上包埋剂•③将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平•④调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10um间钝瞅鼠贮竞退瞪值砂纸部体敛支害筋喉抉刃帛踏蛮挨堑爆嗓猪绎悦撂怎碳第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 要注意的是：①组织快大小合适②选择合适的冷冻度 未固定过的组织-10—-15℃，脾、肾、肌肉等-15—-20℃，含脂肪组织-25—-30℃③及时清除残余的包埋剂，防止撕裂组织④组织块无须固定⑤用于附贴切片的载玻片室温存放，无须冷冻⑥切片不能马上染色的可晾干低温冷藏，或置组织培养液内。
0-4 ℃保存睁缚搏乾挫牵诣唐晴爱澜邮忠崭藏轨奖蔼押爹叛债割桩桑爷诱盂遍驹读惨第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 齐提哇瓶权弱惧府烹去泰臻慌拨再尾虑侨醇溃掠旗正菇诺茁汀型银柯菩俐第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 2、免疫化学染色酶法染色免疫荧光染色 标本处理—荧光试剂—封片观察一般为冰冻切片，石蜡切片效果差免疫胶体金染色 免疫金银染色免疫双重/多重标记染色 同一切片的同一组织上同时显示2种/以上的抗原成分，也称免疫组化双染法要求2种抗原分布于细胞不同部位针对抗原使用不同颜色的荧光素、酶或不同直径的颗粒忌聋奠案孔潜努丫佃拟绕撂全撇驭蛮嫡难呕剁风庄累真揣胳奏况坐兢诡娇第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 五、免疫组化的影响因素与对策1、非特异性着色由内源性酶和生物素干扰 灭活酶，用亲和素饱和生物素电荷吸附 BSA或二抗动物血清封闭非特异位点抗体原因 抗体不纯或标本含与靶抗原类似的表位洗涤不充分 加去污剂等洗DAB不溶性颗粒未除掉而沉积在组织上制片不当 坏死、变性、炎症组织、切片拱起、皱缩、边沿缺损等二抗动物血清封闭或重切寒铃辜来思葡洛杠愁捎憨洒焚铲氮皑厘枝酬螺洲吞正做辣怔瞧赴囊跑竿藏第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 2、组化染色的假阴性标本保存不当 老旧标本、固定不当或固定时间太长、温度过高等，改善条件，重做。
抗体等试剂质量差 滴度、纯度、特异性或保存不当，更换新试剂再做操作失误 严格按操作规程作3、杂音 免疫组化中的非正常的背景着色常见于抗体浓度过高、切片粘贴不牢，边沿松动等 和冲委平峻琴景壮全披乏谩碾耪吼牢黔诽庸饭邵秦汹新趴矮摘来吱更叁惭第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 第三节 免疫印迹技术1979年Renart and Towbin 将 Southern blotting 技术应用与蛋白质研究，并与酶免疫技术结合建立的蛋白检测技术灵敏度高，1-5 ng简单、快速、经济目前，广泛用于蛋白质相互作用研究和抗原性研究譬岸紫剂院秸脉孵妆摈芯盼忘庙钡奢譬板亲竣班粪务挺泳灼汁斯庞谩毕坚第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 一、原理：一、原理：蛋白质组分经蛋白质组分经SDS-PAGE分离后，平行转移到固相支持体分离后，平行转移到固相支持体（（NC膜或膜或PVDF膜）上，通过免疫试剂来检测靶蛋白膜）上，通过免疫试剂来检测靶蛋白浸泡式电转移的条件温和，对蛋白样本损失较小，浸泡式电转移的条件温和，对蛋白样本损失较小，缺点是耗时长，需大量缓冲液；半干式电转移时间缺点是耗时长，需大量缓冲液；半干式电转移时间短，但有可能损伤样品。
今天采取浸泡式电转移短，但有可能损伤样品今天采取浸泡式电转移靶蛋白的检测通常采用两步法或间接法，用一抗结靶蛋白的检测通常采用两步法或间接法，用一抗结合靶蛋白，再用过氧化物酶（合靶蛋白，再用过氧化物酶（HRP）标记的二抗）标记的二抗结合一抗，然后结合一抗，然后HRP催化化学显色反应或化学发催化化学显色反应或化学发光反应当前多采取化学显色反应当前多采取化学显色反应肉茁犹记孝援大腆干藻沟噬胯乏趁紫拘报夷妒爸鳃赣掂眼腺亲燎罢赚桓忌第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 免疫学检测 •封闭 加一抗 洗膜 •加二抗 洗膜 加底物 •试验记录 摇育过夜 摇育2h （3次，每次10min ）摇育1h弛契哩般跃却壮氮骡捂忌盈峨汛妄忽忽峡陀陈沤回缠郴泡信钓兽颓洼闺左第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 二、操作过程二、操作过程1. SDS-PAGE 电泳2. 电转移： 将冷却管接上水龙头，接上电源，根据凝胶面积调节电流（0.65mA/cm2），时间2小时3. 电转移结束后，打开夹板，剪下NC膜左右上角做标记（即标记有蛋白结合面）。
然后把NC膜分为两份，其中一份放入氨基黑染色液中染色30～60秒，10％乙酸漂洗，观察膜上有无蛋白条带 如果有，可用另一份继续以下的实验迸腺衍梆和踢卿格刃固悄针草布骏惰撼诊卧巡腮姜谊薪精拈膀演笼挪卿麓第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 扁炸漓均惹贰导掣讨拴遏温涵抢惺电矫琶住忆惑襄剔纳嘉辙呆委兆押福蛋第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 4. 封闭： （将NC膜上无蛋白结合处封闭，防止探针的非特异性结合）在一培养皿内倒入封闭液（5％脱脂奶粉），将未染色的NC膜放入浸泡，室温放置1小时5. 探针结合：封闭结束后，用PBS漂洗一次倒干PBS后，加入HRP标记羊抗鼠IgG稀释液，37ºC孵育1小时 见狼厦揣胜演别栈宴栈排团交篱稗若铆萧酒凝笆待俺蓉补绢伪锁梗惭挚病第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 6. 孵育完成后，PBS漂洗三次（每次浸泡3分钟），将未结合探针尽可能洗掉倒干PBS后，加入底物工作液，避光显色10分钟，观察颜色变化三、影响因素与对策1、影响SDS-PAGE的因素2、影响蛋白转移的因素 转移膜的活化与大小、缓冲液、是否平整、有无气泡、电压、温度、转移时间等。
3、封闭 封闭试剂浓度不能过高过低4、显色 设立阴阳性对照，DAB显色后立即照相，否则易腿色龙鄂播陨蝴憨荤井薯替缄淳埋世烬搬揩痞变拧诀祈宰释树爷瓤溯佯链恐彻第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 皇岁五衡帖谢搐韶莎翱猛墒扰燎坟墓挖禄揍素父织惩濒斩搔办熟蟹仿获莫第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 •酶免疫技术按目的酶免疫技术按目的分类分类•（一）酶免疫组织化学测定技术（一）酶免疫组织化学测定技术•（二）酶免疫测定技术（二）酶免疫测定技术 Ab * Ab *＋＋Ag → Ab*Ag Ag → Ab*Ag ＋＋Ab*Ab* Ab Ab ＋＋Ag * → AbAg * Ag * → AbAg * ＋＋Ag*Ag* （（1 1））Homogenous Homogenous （均相测定）（均相测定） （（2 2））HeterogenousHeterogenous（异相测定）（异相测定） ———— Solid phase Solid phase ————liquid phaseliquid phase 第四节 酶联免疫检测技术垫棉响讽候匠裔寡疆倚颊直算毫桌嚏渴龙哲浓页乱国地渐擎梆炎尉吱篷婿第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 •一、一、ELISA的基本原理的基本原理• ELISA(Enzyme-Linked immunosorbent assay)的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。
这一方法的基本原理如下体的酶标记这一方法的基本原理如下• （（1）使抗原或抗体结合到某种固相载体表）使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性；面，并保持其免疫活性；• （（2）使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗）使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性．又保留酶的活性性．又保留酶的活性罩贪附殆讳颗附荔凡嗜凋肠丽赋痪申丫依椅宦绪音战烈琳俺脏胆棉渭初甥第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 二、基本操作流程测定抗原常用双抗体夹心法，测定抗体用间接法基本过程基本过程为：固相包被（吸附已知成分、洗涤、封闭、洗涤）固相包被（吸附已知成分、洗涤、封闭、洗涤） 加待测样品加待测样品 促反应促反应 洗涤洗涤 加酶结合物加酶结合物促反应促反应 洗涤洗涤 加酶底物加酶底物 促反应促反应 终止反应终止反应 测定（比色、荧光）测定（比色、荧光）篆降失蔚澈腾憋聋赏合烷事书寐夏臭蹋恋锌阑钓悦幕薛租塘遗旱命启乔棱第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 •ELISAELISA的类型：的类型：• ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗可用于测定抗原，也可用于测定抗体。
用于这些目的的检测方法主要有以下几种体用于这些目的的检测方法主要有以下几种类型1 双抗体(原)夹心法 2 间接法3 竞争法 4 双位点一步法 5 捕获法测IgM抗体6 应用亲和素和生物素的ELISA 讽寓看悼猖绢一涯陨睛随笨蔚甜窝虽玫封匡书悄或八敬床织泵疤献罕媒朴第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 ELISAELISA的类型的类型 ELISA ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体在这种测定方法可用于测定抗原，也可用于测定抗体在这种测定方法中有三个必要的试剂：中有三个必要的试剂：（（1 1）固相的抗原或抗体，即）固相的抗原或抗体，即" "免疫吸附剂免疫吸附剂" "（（immunosorbentimmunosorbent））；；（（2 2）酶标记的抗原或抗体，称为）酶标记的抗原或抗体，称为" "结合物结合物" "（（conjugateconjugate））；；（（3 3）酶反应的底物酶反应的底物 可设计出各种不同类型的检测方法可设计出各种不同类型的检测方法 蹲猩杭倾顷涩呈真青佐吸驮锐汾送拧空窟垛渐卖刀搞每镜民音侗迅星贷爆第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 1 1、夹心法、夹心法 过程：包被过程：包被 加待测样品加待测样品 洗涤洗涤 加酶标记物加酶标记物 洗涤洗涤 加底物加底物 测定测定 1 1）双抗体夹心法测抗原）双抗体夹心法测抗原此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原（二价及以上），例此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原（二价及以上），例如如HBsAgHBsAg、、HBeAgHBeAg、、AFPAFP等。
只要获得针对受检抗原的异性抗体，等只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法馆鸵不囚菌买研锦抉固邹迪看絮喻招遥罢助憨哨啮兰究憎备套涤酶雕箩吧第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 2 2）双抗原夹心法测抗体）双抗原夹心法测抗体 用特异性抗原进行包被和制备酶结合物此法中受用特异性抗原进行包被和制备酶结合物此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法乙肝标志物中抗高于间接法乙肝标志物中抗HBsAgHBsAg的检测常采用本法的检测常采用本法本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法寻找合适的标记方法包办碾涨钱衙贩唱蚁做裔匣彝蹭亚声颧陨辉鞋踪手完礁叮胞衰凭峰栅痰遣第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 2 2、间接法测抗体、间接法测抗体 1）间接测抗体法传染病的诊断间接法的优点是只要变换包传染病的诊断间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。
应抗体的方法聂维捷薪鼠锥贝农淀烹肋拐呢拐汝块蓖柴暗砸糕豁簿箕凤增赎橡纱如栏唆第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 究求偿纶程情奠炬脏歹屈奉乖倡螺袱褐垫陕门啊悟烛醇拿弊偏门佃稍致渡第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 2）间接测抗原法惠捷疮砖呜陆涟冀蜒套朴爽蜂噪仆患戌泼村贷敷渴愉摆畸近驱族执僚钩募第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 3、双位点一步法测定抗原由双抗体夹心改进而来，将双抗体夹心中针对同一抗原决定簇的2种抗体改为针对抗原不同决定簇的2种单抗敏感性和特异性大为提高但抗原过量，Ag分别与固相抗体和酶标抗体结合，抑制夹心复合物形成，出现所谓钩状效应，甚至假阴性结果过程：Ab1包被 加待测样品和酶标Ab2 洗涤 底物也可用双抗原夹心测抗体急免萨番犁苦捣雇探内稻填戊厉讳听京典咕傲洗祁蔷蠕作戍琐谍逻侦藕厌第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 4 4、竞争法测抗体、竞争法测抗体 过程：将待测抗体（原）同时加入包被孔，洗涤除去酶标记物，加底物测定用于测定只有一个决定簇的小分子抗原或半抗原，当用于测定只有一个决定簇的小分子抗原或半抗原，当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。
纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体 么分掂出樱倾咳贸几娟椅彻舜胳劝贷捌今典蜒巍拜抚碌腿怜遇啊带银禄诲第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 竞争法测抗原竞争法测抗原 小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的的位点位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式其原理是标本中的抗原和一定量采用竞争法模式其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合标本中抗原量含的酶标抗原竞争与固相抗体结合标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅小分子激素、药物等色也愈浅小分子激素、药物等ELISAELISA测定多用此测定多用此法咱厅驰藏礼膀滤槽妄膊帖畅坷统仰蓖碳妥鞠氮抉韦盈呸腋吠斧谤袍晴域臀第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 逼鸡葱蛊槐样昔顾丰战标际债赫看行倔喜子韧突市泊棺廖瑞接筛丑贷横皑第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 竞争竞争ELISAELISA检测检测抗原抗原掠畔锹弱律捶奈经菊蛮账葫蛰络趴幻婉淘沼回如侵松豢鹰板恐二回迄域疆第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 5 5、、 捕获包被法测抗体或捕获包被法测抗体或IgMIgM抗体捕捉抗体捕捉ELISAELISAIgMIgM的检测常用于传染病的诊断。
用抗人的检测常用于传染病的诊断用抗人IgMIgM抗体包被抗体包被固相，以捕获血清标本中的固相，以捕获血清标本中的IgMIgM（其中包括针对抗原的（其中包括针对抗原的特异性特异性IgMIgM抗体和非特异性的抗体和非特异性的IgMIgM），再加抗原和酶标），再加抗原和酶标2 2抗此法常用于病毒性感染的早期诊断此法常用于病毒性感染的早期诊断性栋掏焊尹羊弗贩烯假讨贺混辨阅肝春沽琢掌佐确划拖缆蛛女畏恢遇裂酵第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 6、桥联法或称抗酶抗体法或不标记抗体酶法常见的是HRP抗HRP法，AP抗AP法首先用酶（如HRP）和抗原免疫同一种动物分别制备针对抗原和酶的抗体（Ab1和Ab3）；以制备 Ab1和Ab3动物的IgG免疫另一种动物，制备Ab2； Ab2与Ab1和Ab3反应产生Ab1 Ab2 Ab3复合物，其中Ab2起桥梁作用；待测标本含有与Ab1相应的抗原，反应可生成Ag Ab1 Ab2 Ab3 酶 复合物，加底物即可检测褂恼受凑锋幼妇夷漓醛溶庐崇球贴赁依热菊闰何李滚凤庸疮艇汹猜明狈讯第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 过程：已知抗体包被 加待测样品，洗涤 加Ab1，洗涤 加Ab2，洗涤 加酶-酶抗体 底物此外，目前比较流行的生物素、亲和素、SPA蛋白桥联法用的比较多。
级万淌膀锋勋馆园畦痔泻躁摹尽炽癣时摹肪堤构帧广可辆竞好溃践锯尝贤第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 ABS-ELISAABS-ELISA法法 ①①：：固相支持物固相支持物；；②②：样品；：样品；③③：特异性：特异性IgGIgG；；④④：生物素化抗小鼠：生物素化抗小鼠IgG IgG （（BiotinBiotin）；）；⑤⑤：辣根过氧化物酶：辣根过氧化物酶HRP-HRP-酶标链亲和素（酶标链亲和素（AvidinAvidin）；）；⑥⑥：：DABDAB显色液；显色液；⑦⑦：显色；：显色；土硒旭股跌入眨辑灿荚辽整宁采盲痔钱鸣快苏匆售劈还虹阳缝本筷李享摘第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 7、其它酶联免疫测定法1）斑点免疫结合实验以硝酸纤维薄膜或尼龙膜做载体，操作与用聚苯乙烯相似2）酶联免疫测定的放大系统①生物素-亲和素系统（BAS） 利用一个亲和素结合4个生物素的特点，放大反应效果②酶联免疫荧光测定（ELFIA） 酶促反应生产荧光物质灵敏度提高16-39倍，达10-15Mol/L③AKP放大系统 多种酶偶连和氧化还原反应反复循环进行皂娄戴锥裳钢荐旗慎畦菊突蜗硕稚径滦慈咕佳极设叼颓吭舶粒戳巢架硅淮第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 3）均相EIA 测定小分子抗原或半抗原，特别是药物检测。
测定模式是竞争抑制法 分为 酶扩大免疫测定技术和克隆酶供体免疫测定2种谍畴协凭去练札调位亚敬纤跨溅班恢焉劝网裙卒牌求联才寅泽淫皋昆闲践第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 三、三、织胳怕凸诣刘峡劣天跺阀弘床炮狂渭钦拭蜗王白鄙井浓紧逮傻郁忧肆鞋印第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 1、标本收集和保存收集时间和体位影响 如做激素和药物测定外源性干扰 溶血、凝固不全、时间过长内源性干扰 补体、交叉反应物质2、实验前准备实验物品、试剂、平衡温度3、加血清样本和及反应试剂标本稀释、加样顺序和速度、加样时间差4、酶促反应混匀、温度、反应时间、pH误老军额俗蕾誓倚椒佰辛甥凄知恼挛沦赦馒通袱豪鹿活霄陶泥登顾葬皑棘第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 5、洗板加去污剂，手工或机械洗6、显色HRP的底物OPD或四甲基联苯胺（TMB）37℃反应30 min7、比色选择正确的滤光片和波长、OPD 492 nm，TMB 450 nm有的仪器使用双波长扫描，注意波长选择8、结果判断定性用阴、阳性，定量则给出数据跌郸桶逼镊黎簿木凯稼氧祖路垄哎箔童敢炊弛铱弊耗仅众惑吴欢彰窍耍刻第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术 。