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1、发酵工程发酵工程精品课程精品课程http:/ 种子的扩大培养种子的扩大培养种子扩大培养的目的与要求种子扩大培养的目的与要求种子制备实例种子制备实例种子制备的技术概要种子制备的技术概要种子的扩大培养种子的扩大培养http:/ 种种子子扩扩大大培培养养是是指指将将保保存存在在砂砂土土管管、冷冷冻冻干干燥燥管管中中处处休休眠眠状状态态的的生生产产菌菌种种接接入入试试管管斜斜面面活活化化后后，再再经经过过扁扁瓶瓶或或摇摇瓶瓶及及种种子子罐罐逐逐级级扩扩大大培培养养,最最终终获获得得一一定定数数量量和和质质量量的的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。纯种过程。这些纯种培养物称为种子。第一节 种子扩大培养的
2、目的与要求种子扩大培养的概念:种子的扩大培养种子的扩大培养v种子扩大培养的目的与要求种子扩大培养的目的与要求http:/ 接种量的需要接种量的需要q 菌种的驯化菌种的驯化q 缩短发酵时间缩短发酵时间、保证生产水平保证生产水平种子的要求：种子的要求：q 总量及浓度能满足要求总量及浓度能满足要求q 生理状况稳定，个体与群体生理状况稳定，个体与群体q 活力强，移种至发酵后，能够迅速生长活力强，移种至发酵后，能够迅速生长q 无无杂菌杂菌污染污染种子的扩大培养种子的扩大培养v种子扩大培养的目的与要求种子扩大培养的目的与要求http:/ 种子制备过程举例种子制备过程举例一、谷氨酸生产的种子制备一、谷氨酸生
3、产的种子制备制备过程制备过程斜面菌种斜面菌种一级种子培养一级种子培养二级二级种子培养种子培养发酵发酵种子的扩大培养种子的扩大培养v种子扩大培养的目的与要求种子扩大培养的目的与要求http:/ (AS1.299)培养基：蛋白胨培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏，牛肉膏1%，氯化钠，氯化钠 0.5 琼脂琼脂 2%， pH 7.0-7.2培养基特点：培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细有利于菌体的生长，原料比较精细培养条件：培养条件：32，生长，生长18-24小时小时生长斜面要求：生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过生长良好，所使用斜面连续传代不超过 3次次种子的扩大培养种子的扩大培养v
4、种子扩大培养的目的与要求种子扩大培养的目的与要求http:/ 一级一级种子（摇瓶）种子（摇瓶）培养条件：于培养条件：于1000ml三角瓶中，装液三角瓶中，装液200-250ml,32培培 养养12小时。小时。培养基：葡萄糖培养基：葡萄糖2%，尿素，尿素0.5%，玉米浆，玉米浆 2.5%， K2HPO4 0.1%培养基特点：培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基有利于菌体的生长，所使用的原料已经基 本接近于发酵培养基本接近于发酵培养基种子的扩大培养种子的扩大培养v种子扩大培养的目的与要求种子扩大培养的目的与要求http:/ 二二级级种子种子(种子罐种子罐)培养条件：在种子罐中培养（容积
5、为发酵罐的培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的1%(10%)），）， 32培养培养7-10个小时个小时培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替， 浓度为浓度为2.5%培养基的特点培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基：长菌体，更接近于发酵培养基种子的扩大培养种子的扩大培养v种子扩大培养的目的与要求种子扩大培养的目的与要求http:/ 7.0-7.2时结束，时结束，6.887.0-7.2活力旺盛活力旺盛种子的扩大培养种子的扩大培养v种子扩大培养的目的与要求种子扩大培养的目的与要求http:/ 斜面孢子斜面孢子 大米孢子大米孢子 一级种子
6、一级种子 二级种子二级种子 发酵发酵种子的扩大培养种子的扩大培养v种子扩大培养的目的与要求种子扩大培养的目的与要求http:/ 葡萄糖、葡萄糖、 蛋白胨等蛋白胨等培养基特点培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细有利于长孢子，用量少而精细培养条件：培养条件：25、7天天, 注意湿度注意湿度50%左右左右种子的扩大培养种子的扩大培养v种子扩大培养的目的与要求种子扩大培养的目的与要求http:/ 种子制备的技术概要种子制备的技术概要一、种子制备的过程一、种子制备的过程实验室阶段实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程
7、一般都在菌种室完成，验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此现象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。因此现象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。生产车间阶段生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工程归为种子培养在种子罐里面进行，一般在工程归为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。段。种子的扩大培养种子的扩大培养v种子制备的技术概要种子制备的技术概要http:/ 对于不产孢子和芽孢的微生物对于不产孢子和芽孢的微生物 获得一定数量和质量的菌体获得一定数量和质量的菌体对于不产芽孢和孢子的微生物，实验
8、室阶段的种子扩培对于不产芽孢和孢子的微生物，实验室阶段的种子扩培最终是获得一定数量和质量的菌体，如谷氨酸的种子培最终是获得一定数量和质量的菌体，如谷氨酸的种子培养。养。种子的扩大培养种子的扩大培养v种子制备的技术概要种子制备的技术概要http:/ 获得一定数量和质量的孢子获得一定数量和质量的孢子菌丝体培养步骤少，因而更容易获得量和质稳定的种菌丝体培养步骤少，因而更容易获得量和质稳定的种子，但操作繁琐。子，但操作繁琐。q 对于产孢子的微生物对于产孢子的微生物 获得一定数量和质量的菌丝体获得一定数量和质量的菌丝体便于操作，但需要更仔细的控制。便于操作，但需要更仔细的控制。种子的扩大培养种子的扩大培
9、养v种子制备的技术概要种子制备的技术概要http:/ 细菌细菌保藏斜面保藏斜面 活化斜面活化斜面q 产孢子产孢子保藏保藏 母斜面母斜面 子斜面子斜面目的目的：使菌种的传代次数尽可能的少。：使菌种的传代次数尽可能的少。种子的扩大培养种子的扩大培养v种子制备的技术概要种子制备的技术概要http:/ 缩短发酵时间缩短发酵时间q 有利于获得好的发酵结果有利于获得好的发酵结果菌丝体比孢子要有利菌丝体比孢子要有利：种子的扩大培养种子的扩大培养v种子制备的技术概要种子制备的技术概要http:/ 一是成本一是成本 二是驯化二是驯化种子的扩大培养种子的扩大培养v种子制备的技术概要种子制备的技术概要http:/
10、以蔗糖为原料以蔗糖为原料成分成分 斜面斜面 种子罐种子罐 发酵发酵麦芽汁麦芽汁 麦汁麦汁 蔗糖蔗糖 2.5-5% 20%NH4NO3 0.225% 0.11%K2HPO4 0.03% MgSO4.H2O 0.025% 0.025% KCl 0.015%琼脂琼脂 2%种子的扩大培养种子的扩大培养v种子制备的技术概要种子制备的技术概要http:/ 薯干粉薯干粉成分成分 斜面斜面 种子罐种子罐 发酵发酵麦芽汁麦芽汁 麦汁麦汁 薯干粉薯干粉 10% 22-28%(NH4)2SO4 0.5%琼脂琼脂 2%种子的扩大培养种子的扩大培养v种子制备的技术概要种子制备的技术概要http:/ （小罐）（小罐）发酵
11、发酵青霉素：三级发酵青霉素：三级发酵一级种子一级种子 （小罐）（小罐）二级种子（中罐）二级种子（中罐）发酵发酵 一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数种子的扩大培养种子的扩大培养v种子制备的技术概要种子制备的技术概要http:/ 级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响q 级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一 般般2-4级。级。q 在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要在发酵产品的
12、放大中，反应级数的确定是非常重要 的一个方面的一个方面种子的扩大培养种子的扩大培养v种子制备的技术概要种子制备的技术概要http:/ 李文东，李文东， 发酵科技通讯，发酵科技通讯，2003,7斜面斜面一级种子（一级种子（1200ml/5000ml1200ml/5000ml三角瓶）三角瓶）二级种子（二级种子（2m2m3 3）三级种子（三级种子（20m20m3 3)发酵（发酵（240m240m3 3) )背景：二级种子小种量（种子罐是发酵罐的背景：二级种子小种量（种子罐是发酵罐的1%1%左右）左右）二级二级种子大种量（种子罐是发酵罐的种子大种量（种子罐是发酵罐的5%5%以上）以上）文章：三级种子工
13、艺文章：三级种子工艺种子的扩大培养种子的扩大培养v种子制备的技术概要种子制备的技术概要http:/ %）规模规模保藏保藏牛肉膏牛肉膏 （英国）（英国） 1 1，蛋白胨（日本），琼脂粉（日本），蛋白胨（日本），琼脂粉（日本）1.81.8， 无机盐无机盐斜面斜面添加添加 0.10.1的口服葡萄糖，其余同上的口服葡萄糖，其余同上一级一级口服葡萄糖口服葡萄糖 3 3， 玉米浆玉米浆 2.42.4，尿素，尿素 0.650.65，无机盐等，无机盐等1200 ml 1200 ml /5000 ml/5000 ml二级二级玉米淀粉双酶糖玉米淀粉双酶糖 2.02.0， 玉米浆玉米浆 2.0 2.0 ，甘蔗糖蜜，
14、甘蔗糖蜜 1.0, 1.0, 尿素尿素 0.350.35， 无机盐等无机盐等1.2 / 2 m31.2 / 2 m3三级三级玉米淀粉双酶糖玉米淀粉双酶糖 4.04.0， 玉米浆玉米浆 1.5 1.5 ，甘蔗糖蜜，甘蔗糖蜜 1.0, 1.0, 液氨，复合维生素液氨，复合维生素 01 mg/L01 mg/L， 无机盐等无机盐等12 / 20 m312 / 20 m3发酵发酵玉米淀粉双酶糖玉米淀粉双酶糖 13-1413-14， 玉米浆玉米浆 0.06-0.08 0.06-0.08 ，甘蔗，甘蔗糖蜜糖蜜 1.0, 1.0, 液氨，维生素液氨，维生素 50 g50 g， 无机盐等无机盐等154 / 24
15、0 154 / 240 m3m3培养基成分表培养基成分表种子的扩大培养种子的扩大培养v种子制备的技术概要种子制备的技术概要http:/ 种量更大，生长速度快：种量更大，生长速度快：工艺工艺8 8小时产酸小时产酸（% %）1212小时产酸小时产酸（% %）发酵周期发酵周期（h)h)三级三级种子种子2.22.22.72.74.64.65.25.23232二级二级种子种子1.01.01.51.52.62.63.43.43535 糖酸转化率高且稳定糖酸转化率高且稳定工艺工艺产酸（产酸（% %）糖酸转化率糖酸转化率（% %）单罐单罐产量产量( (吨）吨）三级三级种子种子10.9310.9359.859.
16、82121二级二级种子种子9.89.858581818种子的扩大培养种子的扩大培养v种子制备的技术概要种子制备的技术概要http:/ 移入种子的体积移入种子的体积接种量接种量 接种后培养液的体积接种后培养液的体积过大过小都不好，最终以实践定，如大多数抗生素为过大过小都不好，最终以实践定，如大多数抗生素为7-15%。但是一般认为大一点好。但是一般认为大一点好。双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。倒倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。 种子的扩大培养种子的扩大培养v种子制备的技术概要种子制备的技术概要
17、http:/ 杨博， 中国油脂，2002 亚麻酸是一种人体必需多价不饱和脂肪酸，它是人体亚麻酸是一种人体必需多价不饱和脂肪酸，它是人体前列腺素的前体物质，在预防与治疗心脑血管疾病、糖尿病前列腺素的前体物质，在预防与治疗心脑血管疾病、糖尿病治疗、增强免疫力、抗癌和保护皮肤等方面具有重要的生理治疗、增强免疫力、抗癌和保护皮肤等方面具有重要的生理功能。因发酵法生产功能。因发酵法生产亚麻酸与从天然植物提取相比具有一亚麻酸与从天然植物提取相比具有一系列优点，发酵法生产系列优点，发酵法生产亚麻酸成了当今研究的一个热点。亚麻酸成了当今研究的一个热点。 亚麻酸发酵一般是采用丝状真菌来进行，丝状真菌的亚麻酸发酵
18、一般是采用丝状真菌来进行，丝状真菌的形态往往对发酵有较明显的影响，而丝状真菌发酵形态往往对发酵有较明显的影响，而丝状真菌发酵亚麻酸亚麻酸时菌丝体形态的不同对发酵的影响很少有报道。时菌丝体形态的不同对发酵的影响很少有报道。 种子的扩大培养种子的扩大培养v种子制备的技术概要种子制备的技术概要http:/ 不同接种量影响菌体的生长和发酵不同接种量影响菌体的生长和发酵种子的扩大培养种子的扩大培养v种子制备的技术概要种子制备的技术概要http:/ 林产化学与工业，2004镜镜检：检：2424小时多个杆菌首位相连成线形，处于繁殖旺盛期小时多个杆菌首位相连成线形，处于繁殖旺盛期 3030小时开始出现芽孢小时开始出现芽孢种子的扩大培养种子的扩大培养v种子制备的技术概要种子制备的技术概要http:/ 形态形态 （生长处于某个阶段、均匀等等）（生长处于某个阶段、均匀等等） 理化指标：理化指标：C、N、P的含量，的含量，pH 酶活等酶活等 无无污染污染种子的扩大培养种子的扩大培养v种子制备的技术概要种子制备的技术概要http:/
