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1、第六部分第六部分 酶的定向进化与稳定酶的定向进化与稳定性探究性探究 第一节第一节 定向进化简介定向进化简介第二节第二节 定向进化的应用定向进化的应用第三节第三节 蛋白质的稳定性蛋白质的稳定性第四节第四节 蛋白质不可逆失活的原理和机蛋白质不可逆失活的原理和机理理第一节第一节 定向进化简介定向进化简介一理论来源二概念三定向进化的选择策略四杂合酶一理论来源利用基因工程原理可以在实验室中模拟生物进化过程 l化学进化l生物进化二概念酶分子改造l化学修饰，定点突变 定向进化定向进化示意图定向进化示意图随机突变随机突变+ +定向选择目标突变体定向选择目标突变体细菌细菌诱发突变的诱发突变的因素因素5050 0
2、 0C C培养培养突变体库突变体库选择压力选择压力（温度）（温度）温度耐受型突温度耐受型突变体变体最适生长温度为最适生长温度为37370 0C C最适生长温度提高了！最适生长温度提高了！ Strategies for the development of effective enzymes定向进化l属于蛋白质的非合理设计，它不需要事先了解酶的空间结构和催化机制，人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制（随机突变、基因重组和自然选择），在体外改造酶基因，并定向选择（或筛选）出所需性质的突变酶。 澄清一个事实：定向进化澄清一个事实：定向进化不是不是定点突变定点突变定向进化：突变定向进化：突变 筛
3、选筛选 突变位点是随机的，不确定的；突变位点是随机的，不确定的； 突变位点的数目也是不确定的；突变位点的数目也是不确定的； 突变的效应更是不可预知的；突变的效应更是不可预知的； 理论上讲，凡是能够引起突变的因素（物理的，化学的，理论上讲，凡是能够引起突变的因素（物理的，化学的， 生物的）都可以应用于定向进化中突变体的产生。生物的）都可以应用于定向进化中突变体的产生。定点突变：定点突变： 突变位点是确定的，突变的个数也是预知的；突变位点是确定的，突变的个数也是预知的； 突变的效应可能是已知的，也可能是未知的；突变的效应可能是已知的，也可能是未知的； 定点突变的方法一般是以定点突变的方法一般是以P
4、CRPCR技术为基础的。技术为基础的。三定向进化的选择策略l关键突变和筛选l突变采用回交法l筛选蛋白酶选择平板初选，配合活性染色和X光片消化分析DNA shuffling体体外外定定向向进进化化成功实例成功实例Lipase genes (Lipase genes (lipB52, lipB68lipB52, lipB68) isolated from ) isolated from Pseudomonas Pseudomonas fluorescensfluorescens B52B52、B68B68Genbank AccssionGenbank Accssion number AY62300
5、9 number AY623009、AY694785AY694785成功实例成功实例 Lipase gene (Lipase gene (lipB52lipB52）expressed expressed in Pichia pastoris KM71KM71 Zhengbing Jiang, Yitao zheng, Yu Luo, Gang Wang, Hongping Wang, Yushu Ma and Dongzhi Wei*. Cloning and Expression of a Novel Lipase Gene From Pseudomonas fluorescens B52.
6、 Molecular Biotechnology. 2005 ( 31), 095-102. SDS-PAGE analysis of lipase on expression and purificationfunctional lipase secreted by Recombinants screened with BMMY platesEnantioselective esterification of R-phenylethanol,S-phenylethnol remained at its original formeep98.7% and conversion 48.1% at
7、 40oC for 48 hours.Model Chiral Reaction Catalyzed by Lipase B52Transesterification between soybean oil and methanol.Conversion 90% at 40oC for 35 hoursProduction of Biodiesel via Transesterification Catalyzed by Lipase B52Characterization of a psychrophilic lipase from Pseudomonas fluorescens strai
8、n B68p-nitrophenyl caprate as substrate.Optimal temperature as 20C ，50% activity at 0C。Hydrolyzation activity of lipase lipB68 Chiral selectivity of lipB68 Model Reaction：Chiral resolution of -phenylethanol and -phenylpropanol via esterification.Reaction system contained: 0.5mmol of racemic -phenyle
9、thanol or -phenylpropanol dissolved in 10ml toluene containing 1mmol of vinyl acetate, with 0.5g immobilized enzyme added. Samples taken at 120hour and subjected to GC analysis. Production of Biodiesel via Transesterification Catalyzed by Lipase B68Yield to 92% at 20 C and 24 hours with immobilized
10、lipB68.The lowest temperature reported previously.Production of biodiesel from soybean oil by immobilized lipB68Lipase R&D from uncultured microorganism Lipase genes (lipJ02, lipJ03) isolated from environmental sampleCloned with Genome-Walking. Genbank Accssion number AY673674、AY700013Lipase R&D fro
11、m uncultured microorganism Lipase genes (lipJ02, lipJ03) expressed in Pichia pastoris KM71Zhengbing Jiang, Dongzhi Wei* et al., Applied Microbiology and Biotechnology, 2006, Online First. Functional lipase secreted by Recombinants screened with BMMY platesSDS-PAGE analysis of lipase on expression an
12、d purifiedProdrugs of ibuprofenSynthesis of ibuprofen glucopyranside derivative (a) methyl -D-glucopyranoside, (b) ibuprofen, (c) 6-O-(2R -(4-isobutylphenyl) propionyl) -D-glucopyranoside (d) 6-O-(2S-(4-isobutylphenyl) propionyl) -D-glucopyranoside Xiang-Guo Zhao, Dong-Zhi Wei*, A facile enzymatic p
13、rocess for the preparation of ibuprofen ester prodrug in organic media J. Molecular Catalysis B: Enzymatic,2005, 36:47-53.Dongzhi Wei*, Ping Zou, J. Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2002,18:273-278. Biosynthesis of Ethylglucoside Lactate Wei Dongzhi*, Yu ying, Biocatalysis and Biotransformation, 20
14、03,21(3)135-139. Enzymatic Synthesis of Ethyl-glucoside Monooleate with Lipase in Solvent-free Medium Qingxun Song, Dongzhi Wei*, J. Molecular Catalysis B: Enzymatic,2002,18:261-266.Qing-Xun Song, Dong-Zhi Wei*, et al., Biotechnology Letters, 2004, 26(23): 1777 - 1780. Qingxun Song, Dongzhi Wei*, et
15、 al., Bioprocess and Biosystems Engineering, 2006, Online first. Studies of Vitamin ester synthesis by immobilized lipase from Candida sp.四杂合酶来自不同酶分子中的结构单元或是整个酶分子进行组合或交换，以产生具有所需性质的优化酶杂合体。 第一节结束点击返回第二节第二节 定向进化的应用定向进化的应用一提高酶分子的催化活力二提高酶分子的稳定性三提高底物的专一性和增加对新底物催化活力的进化五对映体选择性的定向进化六变换催化反应专一性一提高酶分子的催化活力L天冬氨酸
16、酶定向进化研究l进行4轮易错PCR，筛选了3000个菌落。l得到酶活力提高28倍的突变体，该酶的pH稳定性和热稳定性均优于天然酶二提高酶分子的稳定性T4溶菌酶11个不同的单点突变株将Tm提高0.8-1.4.8株大肠杆菌核酸酶HI单点突变中，7株Tm提高了0.7-4.2三提高底物的专一性和增加对新底物催化活力的进化Gulick分离到了一株谷胱苷肽转硫酶，对于癌症治疗中烷化剂的耐受力提高了9倍Widersten利用噬菌体呈现技术来增加谷胱苷肽转移酶与亲电底物结合力，没有成功 四对映体选择性的定向进化S型选择性的转氨酶转化-丁酮，仅有65%的手性专一性。通过10 000个随机突变的菌株的筛选，获得1
17、0个手性专一性在80%-94%之间的酶 五变换催化反应专一性来源于铜绿假单胞菌的脂肪酶对于底物p-硝基-苯基-2-甲基葵酸盐的S构型的选择性2%。经过4轮易错PCR突变和筛选后，它对底物的S型的选择性达到81% 第二节结束点击返回第三节第三节 蛋白质的稳定性蛋白质的稳定性蛋白质稳定性的分子原因测定蛋白质稳定性的方法蛋白质稳定性的分子原因 金属离子、底物、辅因子和其他相对分子质量配体的结合作用蛋白质-蛋白质和蛋白质-脂的作用盐桥和氢键二硫键 图一 图二对氧化修饰敏感的氨基酸含量较低氨基酸残基的坚实装配疏水相互作用点击返回Disulfide bond点击返回Disulfide bond点击返回Pr
18、otein protein interation点击返回测定蛋白质稳定性的方法参数度量如何测定Tm熔化温度实验变性剂浓度50%变性所需的变性剂浓度实验G(H2O)构象稳定性变性剂伸展曲线G(25)构象稳定性热变性曲线Ts最大稳定性温度稳定性曲线相对活力/%时间t时保留的活力实验加速降解试验预测温度T时的寿命阿伦尼乌斯图第三节结束点击返回第四节第四节 蛋白质不可逆失活的原理蛋白质不可逆失活的原理和机理和机理第四节第四节 蛋白质不可逆失活的原理蛋白质不可逆失活的原理和机理和机理1.蛋白水解酶和自溶作用2.聚合作用3.极端pH4.氧化作用5.表面活性剂和去污剂6.变性剂7.重金属离子和巯基试剂8.热9.机械力10.冷冻和脱水11.辐射作用proteasome点击返回
