第十一章第十一章 高效液相色谱法高效液相色谱法(HPLC) §§11-1 概述概述 高效液相色谱法与经典液相色谱法高效液相色谱法与经典液相色谱法经典液相柱经典液相柱色谱装置色谱装置高效液相色谱仪高效液相色谱仪经典液相色典液相色谱HPLC固定相粒径固定相粒径流流动相相驱动方式方式流流动相流速相流速150-200 μm重力或低重力或低压泵很慢很慢3-10 μm高高压泵快快(1-10mL/min)例：分离例：分离20种氨基酸种氨基酸柱长：柱长：170 cm柱径：柱径：0.9 cmF：：30 mL/ht分离分离: >20 h经典柱色经典柱色谱谱HPLCt分离分离：：1 h §§11-2 基本理论基本理论一一 色谱柱柱效的基本关系式色谱柱柱效的基本关系式二二 分离度分离度 三三 速率方程速率方程溶质在液相流动相溶质在液相流动相中的扩散系数，约中的扩散系数，约为气相中扩散系数为气相中扩散系数的万分之一的万分之一 流动相流速对板高的影响流动相流速对板高的影响1)小颗粒填料，填充均匀；小颗粒填料，填充均匀；2) 选择较低的流动相流速；选择较低的流动相流速；3) 选择粘度小的溶剂作流动相，改善传质。
选择粘度小的溶剂作流动相，改善传质 修正的速率方程：修正的速率方程：提高柱效提高柱效途径途径 §§11-2 高效液相色谱分离方法高效液相色谱分离方法一一 吸附色谱法吸附色谱法1 分离原理分离原理Kad值越大，保留时间越长值越大，保留时间越长 2 固定相固定相硅胶－强极性硅胶－强极性氧化铝－弱极性氧化铝－弱极性活性炭－非极性活性炭－非极性分子筛分子筛－强极性－强极性高分子多孔微球高分子多孔微球(GDX)固体吸附剂固体吸附剂 硅胶表面结构硅胶表面结构 硅胶表面结构经热处理发生的变化硅胶表面结构经热处理发生的变化 3 流动相流动相(洗脱剂洗脱剂) 越大，越大，表明流动相溶剂分子对吸表明流动相溶剂分子对吸附剂的亲和能力越强，则越易从吸附附剂的亲和能力越强，则越易从吸附剂上将被吸附的溶质洗脱下来剂上将被吸附的溶质洗脱下来 溶剂分子在单位吸附剂表面上的溶剂分子在单位吸附剂表面上的吸附自由能吸附自由能溶剂强度参数溶剂强度参数 硅胶固定相分离苯，甲苯，硅胶固定相分离苯，甲苯，乙苯，丙苯，丁苯乙苯，丙苯，丁苯流动相：流动相：干燥正庚烷干燥正庚烷1份水饱和的正庚烷份水饱和的正庚烷2份干燥正庚烷份干燥正庚烷水饱和的正庚烷水饱和的正庚烷改变流动相的改变流动相的组成可改变分离组成可改变分离的选择性的选择性 4 应用应用 具有具有不同官能团的化合物不同官能团的化合物 具有相同官能团，但数量不同的化合物具有相同官能团，但数量不同的化合物 异构体异构体例：几种取代位置不同的硝基例：几种取代位置不同的硝基苯胺的分离。
在硅胶吸附剂上苯胺的分离在硅胶吸附剂上的滞留顺序：的滞留顺序：邻位邻位< <间位间位< <对位对位邻邻硝硝基基苯苯胺胺间间硝硝基基苯苯胺胺对对硝硝基基苯苯胺胺适合分离的物适合分离的物质质 二二 分配色谱法分配色谱法分离原理分离原理K不仅与固定相的不仅与固定相的种类有关，也与流种类有关，也与流动相的种类有关动相的种类有关 固定相极性固定相极性>流动相极性流动相极性正相分配色谱正相分配色谱组分极性越大，组分极性越大，保留时间越长保留时间越长反相分配反相分配色谱色谱固定相极性固定相极性<流动相极性流动相极性组分极性越小，组分极性越小，保留时间越长保留时间越长 三三 离子交换色谱法离子交换色谱法阳离子交换树脂阳离子交换树脂阳离子交换阳离子交换阴离子交换阴离子交换1 分离原理分离原理 2 固定相固定相阳离子阳离子：：－－SO3H(强强)－－CO2H(弱弱)阴离子：阴离子：－－N+R3(强强)－－NH2 (弱弱)基基质质合成树脂合成树脂纤维素纤维素硅胶硅胶离子交换剂离子交换剂 3 流动相流动相水相水相缓冲液缓冲液+有机改性剂有机改性剂调节选择性的调节选择性的主要参数主要参数盐种类及浓度盐种类及浓度pH值值各种阴离子的在阴离子交换剂上的滞留次序：各种阴离子的在阴离子交换剂上的滞留次序：用柠檬酸离子洗脱比用氟离子洗脱快用柠檬酸离子洗脱比用氟离子洗脱快 4 应用应用离子及可离解的化合物离子及可离解的化合物如氨基酸、核酸、蛋白质等如氨基酸、核酸、蛋白质等 四四 化学键合相色谱化学键合相色谱采用化学键合相采用化学键合相的液相色谱的液相色谱固定相非常稳定，在使用中不易流失。
由于固定相非常稳定，在使用中不易流失由于可将各种极性的官能团键合到载体表面，因可将各种极性的官能团键合到载体表面，因此它适用于种类繁多样品的分离此它适用于种类繁多样品的分离特点特点 1. 键合固定相制备键合固定相制备ODS(C18)键合相键合相硅胶硅胶十八烷基十八烷基氯硅烷氯硅烷非极性非极性硅烷化反应硅烷化反应使用使用pH范围：范围： 2-8 键合固定相类键合固定相类型型疏水基团疏水基团烷烃（烷烃（C8和和C18）、）、苯基等苯基等极性基团极性基团丙氨基丙氨基氰乙基氰乙基醚和醇等醚和醇等离子交换基团离子交换基团胺基、季铵盐胺基、季铵盐磺酸、羧酸磺酸、羧酸 2. 键合相色谱法分类键合相色谱法分类 反相键合相色谱反相键合相色谱:常用固定相：常用固定相：C18分离对象分离对象非极性非极性中等极性化合物中等极性化合物常用流动相常用流动相甲醇甲醇-水水乙睛乙睛-水水反相键合相色谱反相键合相色谱疏溶剂分离机制疏溶剂分离机制固定相极性固定相极性<流动相极性流动相极性 正相键合相色谱正相键合相色谱 固定相极性固定相极性 > 流动相极性流动相极性 离子性键合相色谱离子性键合相色谱将各种离子交换基团化学键合到硅胶基质将各种离子交换基团化学键合到硅胶基质表面上，就形成了离子性键合相色谱的固表面上，就形成了离子性键合相色谱的固定相。
其分离原理与离子交换色谱类同其分离原理与离子交换色谱类同 例：甲苯和苯酚的分离流动相：甲醇例：甲苯和苯酚的分离流动相：甲醇-水水出峰顺序：苯酚，甲苯出峰顺序：苯酚，甲苯出峰顺序：甲苯，苯酚出峰顺序：甲苯，苯酚十八烷基十八烷基键合相键合相二醇基二醇基键合相键合相 保留时间：保留时间：<例：以例：以ODS键合色谱柱、甲醇键合色谱柱、甲醇- -水为流动相分离以水为流动相分离以下两种苯甲酸，试判断出峰次序下两种苯甲酸，试判断出峰次序没食子酸没食子酸3,4-二羟基苯甲酸二羟基苯甲酸固定相固定相: 非极性非极性; 流动相流动相: 极性极性组分极性组分极性: 3,4-二羟基苯甲酸二羟基苯甲酸<没食子酸没食子酸 五五 尺寸排阻尺寸排阻(凝胶凝胶)色谱法色谱法排阻色谱分离示意图排阻色谱分离示意图相对分子质量差别相对分子质量差别大于大于10％％的化合物的化合物才可以分离才可以分离1 分离原理分离原理 2 固定相固定相是一种经过是一种经过交联而具有立体交联而具有立体网状结构的多聚体，其中含网状结构的多聚体，其中含有大量液体（一般是水），有大量液体（一般是水），柔软而富于弹性柔软而富于弹性凝胶凝胶3 流动相流动相不采用改变流动相组成的不采用改变流动相组成的方法控制分离度方法控制分离度 分离方法的选择分离方法的选择 §§11-3 高效液相色谱仪高效液相色谱仪 高压泵高压泵流动相流动相溶剂溶剂废液废液色谱柱色谱柱进样口进样口检测器检测器 一一 高压输液系统高压输液系统1 高压泵高压泵要求要求输出压力高输出压力高平稳、脉冲小平稳、脉冲小流量稳定可调流量稳定可调耐腐蚀耐腐蚀 2 梯度洗脱装置梯度洗脱装置 低压梯度低压梯度 高压梯度高压梯度 通过改变流动相的组成来调整组通过改变流动相的组成来调整组分的分的k k值，改变分离因子值，改变分离因子αα值，值，以达到最短时间内得到最佳分离以达到最短时间内得到最佳分离的目的。
的目的梯度洗脱梯度洗脱 等度洗脱与梯度洗脱等度洗脱与梯度洗脱 梯度洗脱梯度洗脱的特点的特点 改善分离改善分离, , 加快分析速度；加快分析速度； 改善峰形改善峰形, , 减少拖尾减少拖尾; ; 可能引起可能引起基线漂移基线漂移分配比变化范围宽的分配比变化范围宽的复杂样品应采取复杂样品应采取梯度洗脱方式分离梯度洗脱方式分离 3 贮液瓶及流动相贮液瓶及流动相1) 对样品有一定的溶解度，以防在柱头产生沉淀对样品有一定的溶解度，以防在柱头产生沉淀2) 适用于所选择的检测器适用于所选择的检测器3) 化学惰性好，以免破坏固定相化学惰性好，以免破坏固定相4) 低粘度，增加样品的扩散系数，提高柱效低粘度，增加样品的扩散系数，提高柱效5) 纯度高溶剂不纯会增加检测器噪声，产生伪峰溶剂不纯会增加检测器噪声，产生伪峰对流动相溶剂对流动相溶剂的一般要求的一般要求 二二 进样系统进样系统 准备状态准备状态 进样状态进样状态 六通阀进样六通阀进样 装置装置 自动进样器自动进样器 三三 色谱柱色谱柱内径：内径：1～～6 mm，，柱长：柱长：5～～30 cm；；柱填料粒径：柱填料粒径：5µm 分离柱分离柱 四四 检测系统检测系统1 紫外吸收检测器紫外吸收检测器(a) 可变波长紫外检测器可变波长紫外检测器(b) 二极管阵列检测器二极管阵列检测器氘灯氘灯光栅光栅流流通通池池测测量量光光电电二二极极管管参比光电二极管参比光电二极管2 二极管阵列检测器二极管阵列检测器 两种检测器的色谱图两种检测器的色谱图(a)：：可变波长紫外检测器；可变波长紫外检测器；(b)：：二极管阵列检测器二极管阵列检测器(b)(a) 紫外检测器紫外检测器灵敏度高，灵敏度高，精密度及线性范围较好精密度及线性范围较好 ，可用于梯度洗脱。
可用于梯度洗脱 流动相选择有限制流动相选择有限制一些常用溶剂的紫外截止波长一些常用溶剂的紫外截止波长溶剂溶剂CS2氯仿氯仿 四氢四氢呋喃呋喃苯苯乙睛乙睛甲醇甲醇水水紫外截紫外截止波长止波长/nm380245212210 190205187 3 荧光检测器荧光检测器 灵敏度高，选择灵敏度高，选择性好，可用于梯度性好，可用于梯度洗脱 4 示差折光检测器示差折光检测器 利用组分与流动利用组分与流动相的折射率之差进相的折射率之差进行检测 通用性好，灵敏通用性好，灵敏度较低，不适用于度较低，不适用于梯度洗脱梯度洗脱 5 化学发光检测器化学发光检测器 6 电化学检测器电化学检测器①①电导检测器电导检测器②②安培检测器安培检测器7 质谱检测器质谱检测器 。