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1、NMR方法解析蛋白质结构冯银刚北京核磁共振中心(http:/)北京大学化学与分子工程学院2006.4.12蛋白质结构层次n氨基酸通过肽键形成的生物高分子n一级结构、二级结构、三级结构、四级结构肽键具有双键性质而不能任意旋转主链可旋转的二面角，20种常见的氨基酸残基通常NMR中一个自旋系统是指一个氨基酸残基上的所有原子核磁共振方法解析蛋白质溶液结构n测定原子（氢原子）之间的距离信息和其他约束信息，得到空间结构模型n化学结构（氨基酸序列，即一级结构）已知，测定空间结构（三级结构，四级结构）适用范围分子量n分子量受限：谱峰重叠，分子增大造成横向弛豫时间减少（线宽增加）n同核二维1H谱：80氨基酸n异
2、核多维（二维、三维）：常规三共振（1H,15N,13C） 200氨基酸氘标记，特殊标记 已报道有700氨基酸n同核样品可以是天然提取、化学合成或分子生物学方法培养制备n标记样品通常只能通过分子生物学方法培养制备常规样品n浓度：毫摩尔每升 500uL 10kDa 5毫克每样品n均一n没有聚合n水溶液（10%重水锁场） pH98%n1H-15N HSQC 上所有谱峰得到了指认nJ. Biomol. NMR 2005, 31:263-264nBMRB 6410 http:/www.bmrb.wisc.edu由化学位移得到二级结构的信息n二级结构CSI：化学位移与无规卷曲的多肽化学位移之差TALOS：
3、基于数据库比对预测二面角可用于结构计算和分析结构计算n基本方法由实验得到各种构象约束信息：距离，二面角n约束信息是不完备的n约束信息是不精确的计算满足这些约束条件的构象n距离几何(Distance Geometry)n约束条件下的分子动力学模拟(Restrained Molecular Dynamics Simulation)约束信息n距离约束1H-1H NOE氢键n二面角约束主链侧链肽键：反式顺式n其他手性 L-氨基酸约束生成nNOE指认nUnique：只有一种可能nAmbiguous：有多种可能转化为距离n实验通常可检测 5 n距离是不精确的：距离范围n距离是大量的精确结构其中一种可能是正
4、确的多种可能都是正确的（谱峰重叠）二面角约束a a-helix: f f = -100 to -20, = -70 to -10b b-sheet: f f = -180 to -60, = 20 to 180n二面角预测：CSI或TALOS实验：HNHA,HNHB等n , 对特定的二级结构有一定的分布n拉氏图(Ramachandran plot)最佳区次佳区一般区不允许区二面角约束n二级结构判断：特征的NOE信号氢键约束-HelixParallel -StrandsAnti-parallel -StrandsH-O 2.0 N-O 3.0 N-H - - - - O根据二级结构或实验判断氢键
5、分子动力学模拟（结构计算）n模拟分子随机运动，使其达到能量的最小值n约束条件转化为MD中的能量项Vtotal= Vbond+ Vangle+ Vdihedr+ Vvdw+ Vcoulomb+ VNMRn模拟退火：克服局部的能量最小点n计算多个结构，取能量较低的若干结构作为结果Ensemble (NMR信息的不完备和不精确)KNOE(rij-rij1)2 if rijriju0 if rijlrij 90%）SANEn依赖初始结构的自动NOE指认Grx-C1的结构计算nCYANA 结构初步优化力场相对简单运行速度快无需初始结构结构相对较为粗略nAmber 结构精修具有更精细的力场参数，使用溶剂化
6、模型（或显式加溶剂）从而获得更加合理的局部构象需要整体折叠正确的初始结构运算量大，速度慢Grx-C1的结构计算nCANDID/CYANA得到初始结构（全自动）2 CPU, 8小时nSANE-CYANA循环，进行初步优化（半自动）手工分析违约和未指认的NOE每个循环 2CPU 1小时20-40个循环nSANE-AMBER循环，进行结构精修（半自动）每个循环 20 CPU 15小时1030个循环结构计算结果nPDB 1Z7P(ensemble), 1Z7R(mean) http:/www.rcsb.org/pdb结构计算结果n约束统计NOE： 4845二面角：160氢键：47手性：287n违约状况
7、距离 无0.2 二面角 无结构计算结果n结构评价Most favored regions (%)88.8Additionally allowed regions (%)10.7Generously allowed regions (%)0.5Disallowed regions (%)0.0RMSDAll residues Regular secondary structureBackbone heavy atoms0.880.32All heavy atoms1.130.68三共振方法所需时间n提取样品24周n数据采集48周n数据处理14小时每实验n共振指认24周n结构计算24周数据处理通常
8、在数据采集后立即进行，在总时间中可忽略不计数据采集与共振指认的时间可部分重叠一些其他因素n水峰压制n小分子干扰对异核实验影响不大n温度：控温装置n分辨率、信噪比与时间分辨率：间接维点数实验时间与间接维点数成正比信噪比与累加次数的平方根成正比实验时间与累加次数成正比最新的进展n谱仪：超低温探头提高灵敏度24倍nTROSY（横向弛豫优化谱）在700MHz以上高场谱仪中可以显著减小线宽，从而可用于测定更大分子量的蛋白质nRDC（残余偶极耦合）得到化学键的空间相对取向信息n自动化方法显著加速结构计算进程使用的软件nNMRPipe 数据处理http:/spin.niddk.nih.gov/bax/sof
9、tware/NMRPipe/nNMRView 指认分析http:/ 500 Euro http:/www.las.jp/prod/cyana/eg/nTALOS基于化学位移预测主链二面角 (NMRPipe的一部分)http:/spin.niddk.nih.gov/NMRPipe/talos/nSANE基于结构的NOE自动指认J Biomol NMR, 2001 19(4) 321-9 nAmber 分子动力学模拟。用于结构优化 $400 http:/amber.scripps.edu/ nPROCHECK-NMR 结构分析与评价http:/www.biochem.ucl.ac.uk/roman
10、/procheck_nmr/procheck_nmr.htmlnMOLMOL 结构分析与绘图http:/hugin.ethz.ch/wuthrich/software/molmol/其他软件n数据处理Felix $? http:/ Free http:/www.bio.cam.ac.uk/azara/PROSA (Free?) http:/guentert.gsc.riken.go.jp/Software/Prosa.htmln指认分析Felix $? http:/ $ 200 http:/hugin.ethz.ch/wuthrich/software/xeasy/index.htmlSpar
11、ky Free http:/www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/CARA Free http:/www.nmr.chn结构计算CNS Free http:/cns.csb.yale.edu/XPLOR Free http:/xplor.csb.yale.edu/xplor/XPLOR-NIH Free http:/nmr.cit.nih.gov/xplor-nih/n分子绘图PyMol Free http:/ Free http:/www.avatar.se/molscript/RasMol Free http:/www.openrasmol.org/VMD Free h
12、ttp:/www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/NMR结构解析流程生物信息学和生物化学分析样品制备（蛋白质表达纯化，标记）核磁共振数据收集化学位移指认NOE指认结构计算核磁共振初步鉴定二级结构分析参考书nNMR of Proteins and Nucleic Acids, Wuthrich K., Wiley Press, 1986 nNMR of Macromolecules, Roberts J., Oxford University Press, 1993 nProtein NMR Techniques, Ed. David G. Reid, Humana Press,1997 (Methods in Molecular Biology, V60) n蛋白质分子的溶液三维结构测定多维核磁共振方法，华庆新，湖南师范大学出版社，1995 n现代核磁共振实用技术及应用，毛希安著，科学技术文献出版社，1999 n生物大分子多维核磁共振，夏佑林等，中国科学技术大学出版社,1999
