LOGO淋巴细胞转化实验09.12.21 LOGOv淋巴细胞在体外培养时，受到刺激物的刺激后可表淋巴细胞在体外培养时，受到刺激物的刺激后可表现为细胞体积增大、代谢旺盛、蛋白质和核酸合成现为细胞体积增大、代谢旺盛、蛋白质和核酸合成增加，即向淋巴母细胞转化和增殖此现象称为淋增加，即向淋巴母细胞转化和增殖此现象称为淋巴细胞转化现象（简称为淋转）巴细胞转化现象（简称为淋转） v淋巴细胞转化率的高低可以反映机体的免疫水平，淋巴细胞转化率的高低可以反映机体的免疫水平，因此可作为测定机体免疫功能的指标之一因此可作为测定机体免疫功能的指标之一原理原理 LOGOvT T细胞、细胞、B B细胞表面具有抗原识别受体和有丝分裂原受细胞表面具有抗原识别受体和有丝分裂原受体体★★植物血凝素（植物血凝素（PHAPHA）、刀豆蛋白）、刀豆蛋白A A（（ConAConA）可选择性刺）可选择性刺激激T T细胞增殖；细胞增殖；★★脂多糖（脂多糖（LPSLPS）可刺激）可刺激B B细胞增殖；细胞增殖； LOGOv分离人外周血单个核细胞（分离人外周血单个核细胞（PBMC））v分离人淋巴细胞分离人淋巴细胞(磁珠分离，流式细胞术磁珠分离，流式细胞术)v淋巴细胞转化试验淋巴细胞转化试验实验流程实验流程 LOGO实验流程实验流程－－－－PBMC的分离的分离v基本原理：由于血液标本中各种细胞比重不同，基本原理：由于血液标本中各种细胞比重不同，红细胞、中性粒细胞比重为红细胞、中性粒细胞比重为1.0921.092，单个核细胞，单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）比重为（淋巴细胞和单核细胞）比重为1.0751.075－－1.0901.090；；FicollFicoll比重为比重为1.0771.077±±0.0010.001。
将血液标本置于分将血液标本置于分层上，经离心沉淀，比重高的红细胞、多核白细层上，经离心沉淀，比重高的红细胞、多核白细胞沉于管底，而比重小的淋巴细胞和单核细胞悬胞沉于管底，而比重小的淋巴细胞和单核细胞悬浮于血浆和分层液的界面层中浮于血浆和分层液的界面层中 LOGO← ＰＢＭＣＰＢＭＣ← 淋巴细胞分离液淋巴细胞分离液 ← 红细胞、粒细红细胞、粒细胞、血小板胞、血小板← 血浆血浆 LOGO实验流程实验流程－－淋巴细胞转化实验－－淋巴细胞转化实验基本原理：基本原理：v在特异性抗原刺激下可使相应淋巴细胞克隆发生在特异性抗原刺激下可使相应淋巴细胞克隆发生增殖；增殖；v有丝分裂原可作为多克隆刺激剂，使相应淋巴细有丝分裂原可作为多克隆刺激剂，使相应淋巴细胞发生增殖胞发生增殖 LOGOv形态计数法、形态计数法、MTTMTT法、法、CCK-8CCK-8法、同位素法法、同位素法 （一）形态计数法：计数淋巴母细胞的比例，计算转（一）形态计数法：计数淋巴母细胞的比例，计算转化百分率化百分率 （二）（二）MTTMTT法：法：MTTMTT是一种噻唑盐活细胞内线粒体琥是一种噻唑盐活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶以珀酸脱氢酶以MTTMTT为底物，形成蓝色的甲臜为底物，形成蓝色的甲臜（（FormazanFormazan）颗粒沉积于细胞内或细胞周围，经ＤＭ）颗粒沉积于细胞内或细胞周围，经ＤＭＳＯ溶解后为紫色溶液，可用酶标测定仪测定ＳＯ溶解后为紫色溶液，可用酶标测定仪测定OD570OD570的值。
的值实验流程实验流程－－结果观察－－结果观察 LOGO（四）（四）3 3H-TdR H-TdR 掺入法：掺入法：3 3H-TdRH-TdR即胸腺嘧啶核苷，是即胸腺嘧啶核苷，是DNADNA合成的前体加入合成的前体加入细胞培养细胞培养液中后被细胞摄取作为液中后被细胞摄取作为DNADNA合成的原料细胞合成的合成的原料细胞合成的DNADNA越多，则所掺入的越多，则所掺入的3 3H-TdRH-TdR就越多该方法与就越多该方法与MTTMTT比较，灵敏度高、准确性好比较，灵敏度高、准确性好三）（三）CCK-8(Cell Counting Kit-8)CCK-8(Cell Counting Kit-8)法法: :原理同原理同ＭＴＴＭＴＴ法是ＭＴＴ的升级替代产品，是ＭＴＴ的升级替代产品，可被还原成橙黄色的甲可被还原成橙黄色的甲臜，且为水溶性本方法重复性好，灵敏度高，对细胞臜，且为水溶性本方法重复性好，灵敏度高，对细胞的毒性低的毒性低 实验流程实验流程－－结果观察－－结果观察 LOGO LOGOv取静脉血取静脉血3ml,用用PBS（吸管（吸管1））稀释稀释1倍倍（滴管（滴管1））v将稀释好的静脉血沿管壁缓慢加入到淋巴细胞分离液（将稀释好的静脉血沿管壁缓慢加入到淋巴细胞分离液（3ml）的上方）的上方（滴（滴管管1））,2000rpm,20minv将滴管将滴管（滴管（滴管2））插入到白膜层，吸取单个核细胞层，转移至另一离心管中，插入到白膜层，吸取单个核细胞层，转移至另一离心管中，加入加入PBS （吸管（吸管1））至至5ml,1500rpm,10min.弃上清，再洗涤细胞弃上清，再洗涤细胞1次次（吸管（吸管1）） （滴管（滴管2））.离心之前计数细胞离心之前计数细胞v弃上清弃上清,加入完全培养基加入完全培养基（吸管（吸管2））,重悬细胞重悬细胞（滴管（滴管2））.将细胞浓度调整为将细胞浓度调整为2*106个个/ml. 将细胞加入将细胞加入96孔板孔板（加样枪）（加样枪）,100ul/孔孔vA组：加入不同浓度的组：加入不同浓度的ConA,100ul/孔孔.每个浓度为每个浓度为2复孔复孔.留留2个孔仅加个孔仅加入培养基，作为空白对照入培养基，作为空白对照. B组：加入组：加入100ul ConA(10ug/ml),则终浓度为则终浓度为5ug/ml.4复孔复孔.设空设空白对照白对照.实验步骤实验步骤 LOGOvA组：置培养箱中培养组：置培养箱中培养66h,加入加入MTT溶液溶液20ul/孔孔,继续培继续培养养6hr后后,去掉上清去掉上清,加入加入DMSO100ul/孔孔,弃分混匀弃分混匀,测测OD570nm值值. B组：置培养箱中培养组：置培养箱中培养66h，制备流式标本，上机检测，制备流式标本，上机检测 细胞数细胞数/ml＝＝4大格中细胞总数大格中细胞总数4××10104 4 ×稀释倍数稀释倍数 LOGOConA的倍比稀释的倍比稀释10ug/ml5ug/ml2.5ug/ml450µL440µL220µL220µLOriginal sample tubetube 1tube 2220µL LOGOv注意注意无菌无菌操作操作v操作中尽可能短时间内完成，以减少死细胞数操作中尽可能短时间内完成，以减少死细胞数v将稀释血加于分离液时，动作要将稀释血加于分离液时，动作要轻柔轻柔v离心时，加速度与减速度要均匀平稳，不能用离心机离心时，加速度与减速度要均匀平稳，不能用离心机““刹车刹车””档档v分离不同种属动物的分离不同种属动物的PBMCPBMC要用不同的淋巴细胞分离液要用不同的淋巴细胞分离液v细胞数量、刺激剂浓度需要在预实验中摸索最适条件细胞数量、刺激剂浓度需要在预实验中摸索最适条件注意事项注意事项 LOGO细胞培养技术细胞培养技术2009.12.21 LOGO细胞培养概述细胞培养概述v细胞培养（细胞培养（cell culturecell culture）：）：从体内取出组织或从体内取出组织或细胞，在体外模拟体内的生理环境，在无菌、适细胞，在体外模拟体内的生理环境，在无菌、适宜温度和一定营养条件下使其生长，并维持其结宜温度和一定营养条件下使其生长，并维持其结构和功能的方法。
构和功能的方法v细胞培养技术是生命科学中常用的研究手段，亦细胞培养技术是生命科学中常用的研究手段，亦是生命科学各研究领域的基础技术和基本技能是生命科学各研究领域的基础技术和基本技能 LOGO细胞培养实验的基本要求细胞培养实验的基本要求v实验前准备：超净台紫外线消毒实验前准备：超净台紫外线消毒30min30min；无菌室每周消毒；无菌室每周消毒1-21-2次；所用器材要经过严格消毒；操作前用消毒液浸泡次；所用器材要经过严格消毒；操作前用消毒液浸泡手或用手或用75%75%酒精擦拭酒精擦拭v实验中要求：实验中要求： Ω一切操作均要在火焰前方进行；瓶口、吸管使用前要经过一切操作均要在火焰前方进行；瓶口、吸管使用前要经过火焰消毒后使用火焰消毒后使用 Ω试剂瓶的瓶口应斜放在支架上，试剂用后立即封闭瓶口试剂瓶的瓶口应斜放在支架上，试剂用后立即封闭瓶口 Ω专管专用专管专用 Ω手不要从敞开的瓶口上方经过手不要从敞开的瓶口上方经过v实验后要求：实验后要求： 关闭超净台风机；用酒精纱布擦拭超净台台面，紫外线消毒关闭超净台风机；用酒精纱布擦拭超净台台面，紫外线消毒 LOGO细胞培养条件细胞培养条件v合成培养基：根据体内细胞生存所需的物质种类和数量，用化学物质模拟合成培养基：根据体内细胞生存所需的物质种类和数量，用化学物质模拟合成。
合成 常用的培养基有常用的培养基有RPMI-1640RPMI-1640、、DMEMDMEM、、IMDMIMDM等v血清：胎牛血清、新生牛血清、小牛血清血清：胎牛血清、新生牛血清、小牛血清v抗菌素：抑制可能存在的细菌和霉菌的生长，而不影响细胞的生长抗菌素：抑制可能存在的细菌和霉菌的生长，而不影响细胞的生长 常用青、链霉素；庆大霉素等 常用青、链霉素；庆大霉素等v消化液（培养贴壁细胞用）：消化液（培养贴壁细胞用）：0.25%0.25%胰蛋白酶、胰蛋白酶、EDTA液液vpHpH调整液调整液 NaHCO3 NaHCO3溶液：常用浓度为溶液：常用浓度为5.6%5.6%和和7.4%7.4% HepesHepes液：可较长时间保持较强的缓冲作用液：可较长时间保持较强的缓冲作用v培养条件：无菌、３７培养条件：无菌、３７℃℃、５％ＣＯ２、５％ＣＯ２ LOGO细胞培养基本技术细胞培养基本技术v细胞原代培养：细胞原代培养：从供体获取组织细胞的首次培养原代从供体获取组织细胞的首次培养原代细胞离体时间短，在一定程度上能反映体内的生长特性细胞离体时间短，在一定程度上能反映体内的生长特性。
适合作药物测试、细胞分化和转化等实验研究适合作药物测试、细胞分化和转化等实验研究v细胞传代培养：细胞传代培养：原代培养细胞长到一定密度时，需进行原代培养细胞长到一定密度时，需进行传代培养传代培养 √ √悬浮生长细胞传代：离心法悬浮生长细胞传代：离心法 √ √半悬浮生长细胞传代：直接吹打法半悬浮生长细胞传代：直接吹打法 √ √贴壁生长细胞传代：胰酶消化法贴壁生长细胞传代：胰酶消化法 LOGO细胞的冻存、复苏与运输细胞的冻存、复苏与运输v细胞的冻存细胞的冻存 10 10％％DMSODMSO（低温保护剂），（低温保护剂），2020％以上的血清，其余为培％以上的血清，其余为培养基，细胞数养基，细胞数1 1××10106 6个个-1-1××10107 7个二步冻结法二步冻结法v细胞的复苏细胞的复苏 从液氮罐中取出的冻存管，迅速投入从液氮罐中取出的冻存管，迅速投入3737℃℃水浴中充分摇水浴中充分摇动，使其迅速融化加入培养液离心后，弃上清，加培动，使其迅速融化加入培养液离心后，弃上清，加培养液培养养液培养v细胞的运输细胞的运输 长距离运输：补充培养液至瓶颈部，保留微量空气，拧长距离运输：补充培养液至瓶颈部，保留微量空气，拧紧瓶盖；瓶口用胶带密封，并用棉花包裹作防震、防压紧瓶盖；瓶口用胶带密封，并用棉花包裹作防震、防压处理。
处理 LOGO细胞培养常见污染及处理方法细胞培养常见污染及处理方法细菌细菌细菌细菌污染污染污染污染将污染孔内液体弃掉，加入硫酸铜或将污染孔内液体弃掉，加入硫酸铜或5mol/L NaOH;重要克隆洗涤数次后，重要克隆洗涤数次后，联用抗生素效果较好联用抗生素效果较好真菌真菌真菌真菌污染污染污染污染应用达克宁、咪唑康；反复洗涤后注射到小鼠腹腔中应用达克宁、咪唑康；反复洗涤后注射到小鼠腹腔中支原体支原体支原体支原体污染污染污染污染预防为主小牛血清是造成支原体污染的主要来源，预防为主小牛血清是造成支原体污染的主要来源，严格无菌操作严格无菌操作 LOGO 。