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1、 葡聚糖凝胶柱层析葡聚糖凝胶柱层析葡聚糖凝胶柱层析葡聚糖凝胶柱层析分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质 教学目标教学目标了解：了解：层析技术的基本原理层析技术的基本原理; 有效分配系数有效分配系数Kav的计算。的计算。 理解：理解：葡聚糖凝胶的选择和准备。葡聚糖凝胶的选择和准备。 掌握：掌握：凝胶层析的原理和操作方法凝胶层析的原理和操作方法; 有效分配系数有效分配系数Kav的意义。的意义。 重点：重点： 凝胶层析的原理和实验步骤。凝胶层析的原理和实验步骤。 分配系数与被分离分子量之间的关系。分配系数与被分离分子量之间的关系。难点：难点： 掌握装柱掌握装柱,加样加样,洗脱洗脱
2、,收集样品的操作步骤。收集样品的操作步骤。蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化 蛋白质分离纯化的方法很多，主要是根据蛋白分子之间蛋白质分离纯化的方法很多，主要是根据蛋白分子之间特异性的差异，如分子大小，溶解度，电荷等建立起来的。特异性的差异，如分子大小，溶解度，电荷等建立起来的。性质性质方法方法分子大小分子大小透析、超滤、密度梯度离心、透析、超滤、密度梯度离心、凝胶层析凝胶层析等等溶解度溶解度等电点沉淀、盐析、有机溶剂沉淀等等电点沉淀、盐析、有机溶剂沉淀等电荷电荷电泳、离子交换层析等电泳、离子交换层析等吸附性质吸附性质吸附层析吸附层析对配体分子对配体分子的亲和力的亲和力亲和层析亲和层析 凝胶层析（
3、又叫分子筛层析或排阻层析）凝胶层析（又叫分子筛层析或排阻层析）指混合物随流动相经过装有指混合物随流动相经过装有凝胶作为固凝胶作为固定相定相的层析柱时，各组分因的层析柱时，各组分因分子大小分子大小不不同而被分离的技术。同而被分离的技术。凝胶层析的基本原理凝胶层析的基本原理凝胶：凝胶：一些具有立体网状结构一些具有立体网状结构和一定孔径的高分子化合物。和一定孔径的高分子化合物。 分子大于凝胶孔隙范围的物质：分子大于凝胶孔隙范围的物质：随着溶剂在凝胶颗粒间流动随着溶剂在凝胶颗粒间流动分子小于凝胶孔隙范围的物质：分子小于凝胶孔隙范围的物质：渗入凝胶颗粒的孔隙中渗入凝胶颗粒的孔隙中凝胶层析的过程凝胶层析的
4、过程凝胶层析过程的数理关系 凝胶干体积凝胶干体积Vg外水体积外水体积Vo内水体积内水体积Vi柱床体积柱床体积Vt= 1/4 D2h = Vg + Vo + Vi洗脱体积（洗脱体积（Ve）：自加入样品时算起，到组分最大浓度自加入样品时算起，到组分最大浓度出现时所流出的出现时所流出的洗脱液体积。洗脱液体积。凝胶层析的分配系数凝胶层析的分配系数*分配系数分配系数Kav：表示任何一种被分离的化合物被：表示任何一种被分离的化合物被凝胶排阻的程度。凝胶排阻的程度。*Kav与凝胶柱的总体积与凝胶柱的总体积Vt、外水体积、外水体积Vo、洗脱体、洗脱体积积Ve有关：有关： Vt和和Vo恒定，恒定，Ve随分离物分
5、子量的变化而变化随分离物分子量的变化而变化 思考：思考：为什么分离物分子量越大为什么分离物分子量越大KavKav值越小值越小 Kav = （Ve Vo）/（Vt Vo）？葡聚糖凝胶柱层析法的特点葡聚糖凝胶柱层析法的特点天然凝胶：一些糖类物质，如淀粉、琼脂及琼脂糖等。天然凝胶：一些糖类物质，如淀粉、琼脂及琼脂糖等。人工合成凝胶：人工合成凝胶：葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶两大类。和聚丙烯酰胺凝胶两大类。葡聚糖凝胶（葡聚糖凝胶（Sephadex）：由许多右旋葡萄糖单位通）：由许多右旋葡萄糖单位通过过1，6-糖苷键联结成链状结构，再由交联剂交联形成不溶糖苷键联结成链状结构，再由交联剂交联形成不
6、溶水的多孔网状高分子化合物。水的多孔网状高分子化合物。型号：型号：G200、 G150、 G100、 G75、 G50、 G25、 G15型号型号（G-X）分离范围分离范围（分子量（分子量Da）适用范围适用范围G10G257005,000脱盐、小肽等脱盐、小肽等G-501,50030,000低分子量蛋白、多肽低分子量蛋白、多肽G-753,00070,000中、低分子量蛋白、多肽中、低分子量蛋白、多肽G1004,000150,000中、高分子量蛋白中、高分子量蛋白G150G2005,000800,000高分子量蛋白高分子量蛋白Sephadex的常见规格（分级范围）的常见规格（分级范围）X： 交交
7、联联度度。X越越小小，交交联联度度越越大大，网网孔孔越越小小，适适用用于于分分离离低低分分子子量产品。反之亦然。量产品。反之亦然。 吸水量。吸水量。G-25表示：表示：1g干胶吸水干胶吸水2.5mL，依次类推。，依次类推。本实验中用本实验中用Sephadex G 50（分离分子量范围（分离分子量范围150020000），以），以蒸馏水蒸馏水为洗脱剂。为洗脱剂。待分离的蛋白质混合物：待分离的蛋白质混合物： 蛋白蛋白A（黄色，分子量在（黄色，分子量在G 50的分离范围内）的分离范围内）蛋白蛋白B（蓝色，分子量大于（蓝色，分子量大于G 50的分离范围）的分离范围）实验步骤实验步骤 凝胶的准备凝胶的准
8、备 装柱装柱加样与洗脱加样与洗脱 样品收集样品收集 1.凝胶的准备：称取凝胶的准备：称取Sephadex G 50 1g，置于，置于锥形瓶中，加蒸馏水约锥形瓶中，加蒸馏水约30ml，在沸水浴中煮沸，在沸水浴中煮沸1h，冷却到室温后再装柱。，冷却到室温后再装柱。充分溶胀后的凝胶以倾斜充分溶胀后的凝胶以倾斜法除去表面悬浮的小颗粒，法除去表面悬浮的小颗粒，反复反复23次。次。l层析柱洗净后，将层析柱烧结板下端的死层析柱洗净后，将层析柱烧结板下端的死区用蒸馏水充满区用蒸馏水充满（注意：不得留有气泡，（注意：不得留有气泡，可多加约可多加约1cm高水层，使柱内凝胶通过沉高水层，使柱内凝胶通过沉积作用更加均
9、匀），积作用更加均匀），然后关闭层析柱的出然后关闭层析柱的出口。口。l将已溶胀的凝胶悬液沿玻璃棒小心地徐徐将已溶胀的凝胶悬液沿玻璃棒小心地徐徐灌入柱中，待底部凝胶沉积灌入柱中，待底部凝胶沉积12cm时，再时，再打开出口，继续加入凝胶悬液至凝胶沉积打开出口，继续加入凝胶悬液至凝胶沉积约约10cm高高即可即可（注意：凝胶悬液尽量一次（注意：凝胶悬液尽量一次加完，以免出现不均匀或分层的凝胶带）。加完，以免出现不均匀或分层的凝胶带）。l反复加蒸馏水，平衡反复加蒸馏水，平衡10min。2. 装柱（装柱（23人一组）人一组）3. 加样与洗脱加样与洗脱l加样时先将柱的出口打开，让蒸馏水逐渐流出，待凝胶加样时
10、先将柱的出口打开，让蒸馏水逐渐流出，待凝胶床面只留下极薄的一层蒸馏水时，关闭出口床面只留下极薄的一层蒸馏水时，关闭出口（注意：不（注意：不可使凝胶柱表面干涸，可预留约可使凝胶柱表面干涸，可预留约0.2cm高水层）。高水层）。l用移液枪将用移液枪将200l样品小心加到凝胶柱表面样品小心加到凝胶柱表面（注意：加样（注意：加样时垂直伸入柱内，接近液面处集中滴加，动作要轻柔）。时垂直伸入柱内，接近液面处集中滴加，动作要轻柔）。l然后打开出口，使样品进入床面，滴加然后打开出口，使样品进入床面，滴加12倍样品体积倍样品体积的蒸馏水的蒸馏水（注意：轻柔滴加）。（注意：轻柔滴加）。l待样品完全流入床内后，再加
11、蒸馏水进行扩展洗脱。待样品完全流入床内后，再加蒸馏水进行扩展洗脱。4. 样品收集：样品收集：样品一旦加入后马上用烧杯收样品一旦加入后马上用烧杯收集流出液，注意柱床上要不断加水，直到集流出液，注意柱床上要不断加水，直到两种蛋白全部洗脱。倒出凝胶，清洗层析两种蛋白全部洗脱。倒出凝胶，清洗层析管。管。5. 结果分析：结果分析：分析为什么这两种蛋白能在凝分析为什么这两种蛋白能在凝胶柱中分离开。胶柱中分离开。注意事项注意事项装柱时需保持柱体垂直于水平面，在平衡完毕前装柱时需保持柱体垂直于水平面，在平衡完毕前不可随意晃动层析柱，以保持凝胶柱表面平整。不可随意晃动层析柱，以保持凝胶柱表面平整。实验过程中需密
12、切注意保持层析柱中的凝胶始终实验过程中需密切注意保持层析柱中的凝胶始终处于蒸馏水中，防止蒸馏水排空。处于蒸馏水中，防止蒸馏水排空。移液器使用：移液器使用： 选择适当量程选择适当量程 正确安装枪头正确安装枪头 吸液第一档，放液第二档吸液第一档，放液第二档 垂直吸液，慢吸慢放垂直吸液，慢吸慢放 吸液后不可将枪平放吸液后不可将枪平放 使用完后调至最大量程使用完后调至最大量程小小 结结1.凝胶层析的原理：混合物随流动相经过装有凝胶作为固定凝胶层析的原理：混合物随流动相经过装有凝胶作为固定相的层析柱时，各组分因分子大小不同而被分离。相的层析柱时，各组分因分子大小不同而被分离。2.凝胶层析分配系数：被分离的化合物被凝胶排阻的程度。凝胶层析分配系数：被分离的化合物被凝胶排阻的程度。Kav = （Ve Vo）/（Vt Vo）3.葡聚糖凝胶柱层析：葡聚糖凝胶为多孔网状高分子化合物葡聚糖凝胶柱层析：葡聚糖凝胶为多孔网状高分子化合物及交联度及交联度G的意义。的意义。4.掌握装柱、加样、洗脱、收集样品的操作。掌握装柱、加样、洗脱、收集样品的操作。5.实验结果实验结果思考题思考题1.为什么分离物分子量越大为什么分离物分子量越大Kav值越值越小？小？2.用凝胶柱层析分离不同蛋白质，怎用凝胶柱层析分离不同蛋白质，怎样才能得到较好的分离效果？样才能得到较好的分离效果？
