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1、烟草青枯烟草青枯病病黄俊斌黄俊斌 教授教授刘海龙刘海龙 黎妍妍黎妍妍研究背景研究背景烟草是一种重要的经济作物，是烟区人民脱贫致富的主要经济来源，但是烟草的病害发生严重，尤其是烟草青枯病，几乎分布于世界上所有烤烟种植区。烟草青枯病是由茄科雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起,1864年在印度尼西亚首先报道。该病在我国长江流域及其以南烟区普遍发生，其中以广东、福建、台湾、湖南、湖北、江西、广西东部、安徽南部、四川及贵州局部烟区为害严重，个别年份常常暴发流行，造成毁灭性损失。一、症状一、症状正常萎蔫 典型症状是叶片萎蔫，部分叶片变黄，茎上出现长形黑褐典型症状是叶片萎蔫，部分叶
2、片变黄，茎上出现长形黑褐色条斑，有的条斑扩展到病株顶部，根部变黑腐烂。色条斑，有的条斑扩展到病株顶部，根部变黑腐烂。枯萎茎干变褐叶肉病变茎干变褐 研究内容研究内容二、病原菌的分离和鉴定二、病原菌的分离和鉴定 1. .病原菌的病原菌的分离分离 采用稀释划线分离法。 将烟草病株基部的茎杆表面用清水洗净晾干，75的酒精表面消毒，在含有无菌水的培养皿中研磨病组织。用移菌环蘸取少量菌液在TTC培养基（青枯菌选择培养基）上划线，30培养48h。 TTC TTC平板培养平板培养48h48h后青枯菌菌株的菌落形态后青枯菌菌株的菌落形态TTC培养基：NA培养基中加入三苯基四氮唑（TTC）.烟草青枯菌分离菌株来源
3、烟草青枯菌分离菌株来源菌株烟草品种地理来源菌株烟草品种地理来源XE1-1云烟87宣恩县晓关镇XF3-1毕纳1号咸丰县忠堡镇XE1-2云烟87宣恩县晓关镇XF3-2毕纳1号咸丰县忠堡镇XE2-1毕纳1号宣恩县晓关镇RS1-1云烟87巴东县大支坪镇XE2-3毕纳1号宣恩县晓关镇RS1-2云烟87巴东县大支坪镇XE2-4毕纳1号宣恩县晓关镇RS1-3云烟87巴东县大支坪镇XE3-2云烟87宣恩县晓关镇RS1-4云烟87巴东县大支坪镇XE3-3云烟87宣恩县晓关镇RS2-1云烟87恩施市盛家坝乡XE3-4云烟87宣恩县晓关镇RS2-2云烟87恩施市盛家坝乡XE4-1云烟87宣恩县晓关镇RS3-2云烟8
4、7恩施市三岔乡XE4-2云烟87宣恩县晓关镇RS3-3云烟87恩施市三岔乡XE5-1云烟87宣恩县晓关镇RS4-1云烟87恩施市盛家坝乡XE5-2云烟87宣恩县晓关镇RS4-2云烟87恩施市盛家坝乡XE5-3云烟87宣恩县晓关镇RS6-1云烟87恩施市龙凤镇LC1-2云烟87利川市柏杨坝镇RS6-2云烟87恩施市龙凤镇LC1-4云烟87利川市柏杨坝镇RS6-3云烟87恩施市龙凤镇LC1-5云烟87利川市柏杨坝镇RS5-1云烟87来凤县旧司乡LC1-6云烟87利川市柏杨坝镇RS5-2云烟87来凤县旧司乡LC2-1云烟87利川市柏杨坝镇RS5-3云烟87来凤县旧司乡LC2-2云烟87利川市柏杨坝镇
5、RS5-4云烟87来凤县旧司乡LC2-3云烟87利川市柏杨坝镇RS7-1云烟87鹤峰县燕子乡LC2-4云烟87利川市柏杨坝镇RS7-2云烟87鹤峰县燕子乡XF1-1毕纳1号咸丰县忠堡镇RS7-3云烟87鹤峰县燕子乡XF1-2毕纳1号咸丰县忠堡镇RS7-4云烟87鹤峰县燕子乡XF1-3毕纳1号咸丰县忠堡镇RS8-1鄂烟1号建始县高坪镇XF2-1毕纳1号咸丰县忠堡镇RS8-2鄂烟1号建始县高坪镇XF2-2毕纳1号咸丰县忠堡镇RS8-3鄂烟1号建始县高坪镇XF2-3毕纳1号咸丰县忠堡镇RS8-4鄂烟1号建始县高坪镇2 病原菌病原菌的纯化的纯化和保存和保存 从TTC培养基上挑取呈不规则圆形，中心淡粉呈
6、不规则圆形，中心淡粉红色，周围白边较宽，流动性强红色，周围白边较宽，流动性强的单菌落进行纯化，2-3次后，用接种环挑取少量细菌于灭菌水中20保存。3 青枯菌的分子鉴定青枯菌的分子鉴定 通过常规PCR，利用青枯菌种的特异性引物759760，对分离获得的菌株进行分子鉴定，根据扩增结果来确定是否为青枯菌。引物序列：759 ：GTCGCCGTCAACTCACTTTCC 760：GTCGCCGTCAGCAATGCGGAATCGPCR扩增采用25L反应体系，其中10PCR buffer 2.5L，Taq酶2U，MgCl21.5mM，dNTPs200M，引物759和760各1L，DNA 5L。 反应程序为：
7、952 min； 9420s， 30 6830s， 7230s； 72延伸10min。 3.青枯菌的分子鉴定青枯菌的分子鉴定结果结果 扩增结果表明：所有分离获得的供试青枯菌菌株均可扩增得到280bp左右的特异性片段。 分离菌株的特异性分离菌株的特异性PCR鉴定结果鉴定结果注：1-22、24-46分离的烟草青枯菌；23：阴性对照；M：1000bp Marker（自上而下片段大小分别为：1000bp，700bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp）280bp280bp280bp三、烟草青枯菌菌系分化研究三、烟草青枯菌菌系分化研究1.1.青枯菌生理小种鉴定青枯菌生理小种鉴定供
8、试菌株供试菌株：从湖北恩施地区烟草青枯病病株上分离的54个青 枯菌菌株。鉴别寄主鉴别寄主：烟草、番茄、茄子、马铃薯、花生和辣椒接种方法接种方法：1mL细菌悬浮液（浓度为108cfumL ），注射到5- 7叶期的寄主茎基部。培养条件培养条件：温度30，相对湿度80%以上。小种划分小种划分：接种7天后，调查接种植株的抗感反应，根据Budenhagen、华静月等人制定的生理小种划分标准，确定菌株的生理小种归属。 青枯菌的生理小种划分标准青枯菌的生理小种划分标准小种侵染植物1号茄科植物（包括番茄、马铃薯、烟草、辣椒、茄子等）和其他科植物2号香蕉、大蕉和海里康（Heliconia）3号马铃薯和番茄、茄子
9、（偶尔侵染）4号姜，番茄、马铃薯（致病力很微弱）5号桑（致病性很强）；番茄、马铃薯、茄子、龙葵和辣椒（致病力很微弱） 烟草青枯菌接种生理小种鉴别寄主烟草青枯菌接种生理小种鉴别寄主 鉴定结果表明：54个烟草青枯菌菌株接种6种鉴别寄主均能使其致病，发病率均为100%，侵染的植物种类范围符合生理小种1号的侵染范围，因此可将供试菌株划分为生理小种1号。 2.烟草青枯菌生化型测定烟草青枯菌生化型测定 根据菌株对3种双糖（乳糖、麦芽糖、纤维二糖）和3种己醇（甘露醇、山梨醇和甜醇）的利用程度，将菌株划分为不同的生化型。测试项目生化型甘露醇山梨醇甜醇乳糖麦芽糖纤维二糖注：“+”代表能利用（培养基变黄），“”代
10、表不能利用（蓝色）青枯菌生化型划分标准青枯菌生化型划分标准 根据何礼远、华静月等提出的青枯菌5型划分标准，对分离菌株进行生化型划分，标准如下： 生化型测定结果表明：54个烟草青枯菌菌株均能利用3种双糖和3种己醇，根据青枯菌生化型划分标准鉴定均为生化型。甜醇山梨醇甘露醇纤维二糖乳糖麦芽糖 菌株对菌株对3 3种己醇和种己醇和3 3种双糖的利用（左为种双糖的利用（左为CKCK，右为接菌），右为接菌）3.3.烟草青枯菌演化型鉴定烟草青枯菌演化型鉴定 参照Fegan和Prior的方法，用7条引物扩增青枯菌株DNA，根据扩增的片段大小确定供试菌株的演化型。用于演化型鉴定用于演化型鉴定的引物序列的引物序列引
11、物序列Sequence（5-3）扩增片段分类归属片段大小Nmult21:1FCGTTGATGAGGCGCGCAATTT演化型144bpNmult21:2FAAGTTATGGACGGTGGAAGTC演化型372bpNmult23:AFATTACSAGAGCAATCGAAAGATT演化型91bpNmult22:InFATTGCCAAGACGAGAGAAGTA演化型213bpNmult22:RRTCGCTTGACCCTATAACGAGTA-759GTCGCCGTCAACTCACTTTCC青枯菌种特异性280bp760GTCGCCGTCAGCAATGCGGAATCG- DNADNA提取提取：用TaKa
12、Ra试剂盒提取菌株的DNA。 PCR扩增采用25L反应体系，其中包括： 10PCR buffer 2.5L， Taq酶2U， MgCl21.5mM， dNTPs 200M， 引物759和760各4pmol，引物Nmult21:1F，Nmult21:2F，Nmult23:AF， Nmult22:InF，Nmult22:RR各6pmol， DNA模板50ng。 反应程序为： 965 min； 9415s， 30 5930s， 7230s； 72延伸10min。 取5LPCR产物于2%的琼脂糖凝胶中电泳，电压5Vcm，通过Biorad凝胶成像仪观察结果。 反应程序为： 965 min； 9415s，
13、 30 5930s， 7230s； 72延伸10min。 取5LPCR产物于2%的琼脂糖凝胶中电泳，电压5Vcm，通过Biorad凝胶成像仪观察结果。 280bp144bp四、青枯菌的寄主范四、青枯菌的寄主范围青枯菌的寄主范围非常广泛，可侵染包括54个科的450余种植物，如烟草、番茄、茄子、辣椒、花生、马铃薯、桑树、油橄榄、甘薯等。五、烟草青枯病田间发生动态研究五、烟草青枯病田间发生动态研究调查地点：湖北恩施州宣恩县和咸丰县烟田调查时间：2013年6-8月调查方法：采用双行平行跳跃法定点定株调查调查内容：发病时期，发病率，气候条件等。 按照国家标准 (GB/T23222-2008)，以株为单位
14、分级调查，分级标准如下： 0级：全株无病； 1级：茎部偶有褪绿斑； 3级：茎部有黑色条斑，但不超过茎高1/2； 5级：茎基部黑色条斑超过茎高1/2，但未到达茎顶部； 7级：茎部黑色条斑到达茎顶部，或病株叶片全部萎； 9级：病株基本枯死。2013年咸丰点烟草青枯病发生情况年咸丰点烟草青枯病发生情况始发期始发期6月月20日，发日，发病率为病率为3.33%，病情，病情指数为指数为0.37，随着日，随着日平均气温达到平均气温达到25，7月中旬进入盛发期月中旬进入盛发期，8月底发病率达到月底发病率达到90%以上，病情指数达以上，病情指数达37以上。以上。2013年宣恩点烟草青枯病发生情况年宣恩点烟草青枯
15、病发生情况始发期为始发期为6月月8日，发病日，发病率为率为2.86%，病情指数为，病情指数为0.22，随着日平均气温达，随着日平均气温达到到26，6月下旬烟草青月下旬烟草青枯病进入盛发期枯病进入盛发期，8月中月中旬发病率达到旬发病率达到93%以上，以上，病情指数达到病情指数达到40以上。以上。 两个地区烟草青枯病始发期都在两个地区烟草青枯病始发期都在6 6月中旬，随着时间的延长，月中旬，随着时间的延长，发病率和病情指数逐渐升高，发病率和病情指数逐渐升高，7 7月下旬进入盛发期，月下旬进入盛发期，8 8月中旬进月中旬进入稳定期。入稳定期。六、烟草青枯病防治六、烟草青枯病防治1、筛选和利用抗病品种
16、筛选和利用抗病品种n 参试共计46个烟草品种 n 苗期温室鉴定：伤根灌菌接种法，接种条件：温度28 -30 ，RH80%。接种后定期（接种后第5d、7 d、10 d、15d、21d）调查发病情况。n大田病圃鉴定：烟株旺长初期，用小铁铲从烟株茎基部斜插人土使侧根受伤，随后浇灌菌液。每隔10 d 调查1 次发病情况。 n接种浓度：1108 CFU/mL。 编号编号品种名称品种名称编号编号品种名称品种名称编号编号品种名称品种名称1人参烟人参烟17蓝玉蓝玉1号号33K42Coker371Gold18G8034Feb-213烤烟烤烟-319RG1135CF2034K32620K39936CF9865云烟
17、云烟8721K326LF37中烟中烟986638822K39438龙江龙江9127K823MCN94439吉烟吉烟9号号8中烟中烟10024Coker31940LZ39RG1725NC8241翠碧翠碧1号号10CF205（中烟（中烟104）26Coker17642K611中烟中烟10327NC56743云烟云烟9712K34628NC9544南江南江3号号13云烟云烟8529V245毕纳毕纳1号号14FX200130CV8746D10115FY81331CV9116龙江龙江91132K10参参试试烟烟草草品品种种 u青枯病严重度分级标准青枯病严重度分级标准(GB/T 23222-2008) 0
18、级级全株无病全株无病1级级茎部偶有褪绿斑，或病侧茎部偶有褪绿斑，或病侧1/2以下以下叶片凋萎叶片凋萎3级级茎部有黑色条斑，但不超过茎高茎部有黑色条斑，但不超过茎高1/2，或病侧，或病侧1/2至至2/3叶片调萎叶片调萎5级级茎基部黑色条斑超过茎高茎基部黑色条斑超过茎高1/2，但，但未到达莲顶部，或病侧未到达莲顶部，或病侧2/3以上叶以上叶片调萎片调萎7级级茎部黑色条斑到达茎顶部，或病茎部黑色条斑到达茎顶部，或病株叶片全部调萎株叶片全部调萎9级级病株基本枯死病株基本枯死烟草品种抗病性鉴定标准烟草品种抗病性鉴定标准(GB/T 23224-2008) 抗病性抗病性病情指数病情指数高抗（高抗（HR） 0
19、 抗病（抗病（R） 0.120 中抗（中抗（MR） 20.140 中感（中感（MS） 40.160 感病（感病（S） 60.180 高感（高感（HS） 80.1100 苗期鉴定结果苗期鉴定结果苗期鉴定结果：苗期鉴定结果：华农温室华农温室苗期鉴定结果：华农温室苗期鉴定结果：华农温室序号序号抗性评价抗性评价序号序号抗性评价抗性评价序号序号抗性评价抗性评价大田大田苗期苗期大田大田苗期苗期大田大田苗期苗期25RHS20MRS7MSHS26RMR19MRMS22MSHS45RMR34MRHS5MSS46RMR36MRS40MSMS17RMS33MRHS44MSHS32RHS14MRHS24MSHS3RS
20、43MRMS1MSHS2MRHS10MRMS23SMS35MRS37MRHS30SHS18MRMS27MRMS6SHS28MRMS31MSS11SHS9MRHS42MSS13SHS15MRS8MSHS41SHS12MRS16MSS39SHS29MRS38MSHS4MRS21MSS以抗病品种（Coker176、毕纳1号、D101）为砧木，云烟87（感病品种）为接穗品种采用靠接法进行了嫁接。2、嫁接防病、嫁接防病团棵期嫁接烟株表现团棵期嫁接烟株表现打顶期嫁接烟株表现打顶期嫁接烟株表现可调节角度的嫁接刀，专利号：可调节角度的嫁接刀，专利号：ZL 2013 2 0354249.3 打顶期调查嫁接云烟打顶期调查嫁接云烟87植株的青枯病发病率为植株的青枯病发病率为10.87%18.42%，未嫁接的植株发病率为，未嫁接的植株发病率为78.95%，其，其中尤以中尤以D101为砧木的嫁接云烟为砧木的嫁接云烟87植株抗病效果最好。植株抗病效果最好。嫁接烟株防病效果嫁接烟株防病效果3、生物防治、生物防治（1）植物源农药：大蒜素等。（2）生防菌：荧光假单胞菌，枯草芽孢杆菌等。4、化学防治、化学防治 农用链霉素，硫酸链霉素，青枯立克等。
