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1、 4 4 无菌无菌操作技术操作技术一、外植体的选择与处理一、外植体的选择与处理二、外植体的接种和培养二、外植体的接种和培养三、试管苗的驯化与移栽三、试管苗的驯化与移栽四、常见问题与解决措施四、常见问题与解决措施一、外植体的选择与处理一、外植体的选择与处理（一）（一） 外植体的选择外植体的选择（二）（二） 外植体的处理外植体的处理（三）污染问题及解决措施（三）污染问题及解决措施（一）外植体的选择（一）外植体的选择 植物组织培养的主要作业大致包括：外植体的选择与植物组织培养的主要作业大致包括：外植体的选择与处理、培养基的制备、器具的消毒、无菌操作和环境条件处理、培养基的制备、器具的消毒、无菌操作和
2、环境条件的调控。的调控。 1. 选择优良的种质选择优良的种质 无论是离体培养繁殖种苗，或者是进行生物技术研究，无论是离体培养繁殖种苗，或者是进行生物技术研究，培养材料的选择都要从主要的植物入手，选取性状优良的培养材料的选择都要从主要的植物入手，选取性状优良的种质，或特殊的基因型。对材料的选择要有明确的目的，种质，或特殊的基因型。对材料的选择要有明确的目的，具有一定的代表性，提高成功机率，增加其实用价值。具有一定的代表性，提高成功机率，增加其实用价值。 2. 2. 选择健壮的植株选择健壮的植株 组组织织培培养养用用的的材材料料，最最好好从从生生长长健健壮壮的的无无病病虫虫的的植植株株上上，选选取
3、取发发育育正正常常的的器器官官或或组组织织。因因为为这这些些器器官官或或组组织织代代谢旺盛，再生能力强，比较容易培养成功。谢旺盛，再生能力强，比较容易培养成功。 3. 3.选择最适的时期选择最适的时期 组组织织培培养养选选择择材材料料时时，要要注注意意植植物物的的生生长长季季节节和和植植物物的的生生长长发发育育阶阶段段。如如快快速速繁繁殖殖时时应应在在植植株株生生长长的的最最适适时时期期取取材材，这这样样不不仅仅成成活活率率高高，而而且且生生长长速速度度快快，增增殖殖率率高高；花花药药培培养养应应在在花花粉粉发发育育到到单单核核期期时时取取材材，这这时时比比较较容容易易形形成愈伤组织。成愈伤组
4、织。 4.4.选取适宜的大小选取适宜的大小 建立无菌材料时，取材的大小根据不同植物材料而异。建立无菌材料时，取材的大小根据不同植物材料而异。材料太大易污染，也不需要；材料太小，多形成愈伤组织，材料太大易污染，也不需要；材料太小，多形成愈伤组织，甚至难于成活。一般甚至难于成活。一般选取培养材料的大小，在选取培养材料的大小，在0.5cm-0.5cm-1.0cm1.0cm。如果是胚胎培养或脱毒培养的材料，则应更小。如果是胚胎培养或脱毒培养的材料，则应更小。 ( (二二) )外植体的处理外植体的处理 外植体在接种前先要灭菌，外植体在接种前先要灭菌，在灭菌前，在灭菌前，又先要进行预处又先要进行预处理。理
5、。植物材料一般采取的预处理方法是，先对植物组织进行植物材料一般采取的预处理方法是，先对植物组织进行修整，去掉不需要的部分，将准备使用的植物材料在流水中修整，去掉不需要的部分，将准备使用的植物材料在流水中冲洗干净。冲洗干净。经过预处理的植物材料，其表面仍有很多细菌和经过预处理的植物材料，其表面仍有很多细菌和真菌，因此还需进一步灭菌。真菌，因此还需进一步灭菌。 常规的表面灭菌处理方法常规的表面灭菌处理方法把材料放进把材料放进75%75%的酒精中约的酒精中约3030 60s60s。用用2.5%2.5%的的CaCl0CaCl0（次氯酸钙）溶液浸泡（次氯酸钙）溶液浸泡151520min20min。无菌蒸
6、馏水冲洗无菌蒸馏水冲洗3 35 5次。次。灭菌时进行摇动，使植物材料与灭菌剂有良好的接触。灭菌时进行摇动，使植物材料与灭菌剂有良好的接触。在灭菌剂里滴入数滴在灭菌剂里滴入数滴0.1%0.1%的的Tween20Tween20（吐温）或（吐温）或Tween80Tween80湿润湿润剂，能增强灭菌效果。剂，能增强灭菌效果。 常用灭菌药剂的使用和效果常用灭菌药剂的使用和效果灭菌剂使用浓度（%）清除的难易消毒时间效 果次氯酸钠23易530很好次氯酸钙2易530很好漂 白 粉饱和浓度易530很好氯 化 汞0.11较难210最好酒 精7075易0.22好过氧化氢1012最易515好溴 水12易210很好硝
7、酸 银1较难530好抗 菌 素450mg/L中3060较好（三）污染问题及解决措施（三）污染问题及解决措施1. 污染的原因污染的原因污染污染是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。导致培养失败的现象。污染的原因：污染的原因：从病源菌方面来分析主要有细菌及真菌两大类；从病源菌方面来分析主要有细菌及真菌两大类；从污染的途径而言，主要是由于外植体带菌、培养基及器皿灭从污染的途径而言，主要是由于外植体带菌、培养基及器皿灭菌不彻底、操作人员未遵守操作规程等引起的。菌不彻底、操作人员未遵守操作规程等引起的。细菌污染的特点细菌污染的特点
8、：菌斑呈粘液状物，而且在接种后：菌斑呈粘液状物，而且在接种后1 12 2天即天即可发现。可发现。原因：材料带菌原因：材料带菌 培养基灭菌不彻底培养基灭菌不彻底 操作人员未遵守操作规程操作人员未遵守操作规程因此接种人员的手应经常用因此接种人员的手应经常用70%70%洒精擦净，镊子和接种针在使洒精擦净，镊子和接种针在使用前必须在火焰上烧红。用前必须在火焰上烧红。真菌污染的特点真菌污染的特点：污染部分长有不同颜色的霉菌，在接种后：污染部分长有不同颜色的霉菌，在接种后3 31010天才能发现。天才能发现。原因：周围环境不清洁原因：周围环境不清洁 超净工作台的过滤装置失效超净工作台的过滤装置失效 培养用
9、器皿的口径过大培养用器皿的口径过大为了减少损失，提高工作效率，必须在每个操作环节注意防为了减少损失，提高工作效率，必须在每个操作环节注意防止污染的发生。止污染的发生。 2.2.污染的预防措施污染的预防措施发现污染的材料应及时处理，否则将导致培养室环境污染。发现污染的材料应及时处理，否则将导致培养室环境污染。对一些特别宝贵的材料，可以取出再次进行更为严格的灭对一些特别宝贵的材料，可以取出再次进行更为严格的灭菌，然后接入新鲜的培养基中重新培养。要处理的污染培菌，然后接入新鲜的培养基中重新培养。要处理的污染培养瓶最好在打开瓶盖前，先集中进行高压灭菌，再清除污养瓶最好在打开瓶盖前，先集中进行高压灭菌，
10、再清除污染物，然后洗净备用。现就根据污染途径，阐述污染的几染物，然后洗净备用。现就根据污染途径，阐述污染的几种预防措施。种预防措施。 （1 1）防止材料带菌）防止材料带菌用茎尖作外植体时，可在室内或无菌条件下对枝条先进行预用茎尖作外植体时，可在室内或无菌条件下对枝条先进行预培养。培养。枝条水洗净插入无糖的营养液或自来水促使抽枝，枝条水洗净插入无糖的营养液或自来水促使抽枝，以这以这种新抽的嫩枝条作为外植体接种。这样便可大大减少材料的污种新抽的嫩枝条作为外植体接种。这样便可大大减少材料的污染。染。 或在无菌条件下对采自田间的枝条进行暗培养，待抽出徒或在无菌条件下对采自田间的枝条进行暗培养，待抽出徒
11、长的黄化枝条时采枝，经灭菌后接种也可明显减少污染。长的黄化枝条时采枝，经灭菌后接种也可明显减少污染。 选择合适的时间去田间采取外植体选择合适的时间去田间采取外植体避免阴雨天去田间采取外植体。避免阴雨天去田间采取外植体。在晴天采取外植体时，下午采取的外植体要比早晨采的污染在晴天采取外植体时，下午采取的外植体要比早晨采的污染少，因材料经过日晒后可杀死部分细菌或真菌。少，因材料经过日晒后可杀死部分细菌或真菌。 目目前前对对材材料料内内部部污污染染还还没没有有令令人人满满意意的的灭灭菌菌方方法法。在在菌菌类类长长入入组组织织内内部部时时，要要剥剥去去上上年年生生的的鳞鳞片片，甚甚至至要要除除去去韧韧皮
12、皮组组织织，只只接接种种内内部部的的分分生生组组织织，以收到一定的防污染效果。以收到一定的防污染效果。（2 2）外植体的灭菌）外植体的灭菌多次灭菌法：一是多次灭菌法：一是将将切好的外植体放入切好的外植体放入2.5%2.5%的次氯酸盐溶液的次氯酸盐溶液中消毒中消毒20-30min20-30min；二是二是在无菌蒸馏水中冲洗在无菌蒸馏水中冲洗3 3次；次；三是三是将材料将材料封闭在无菌的培养皿中过夜，保持一定温度；封闭在无菌的培养皿中过夜，保持一定温度；四是四是第二天再将第二天再将外植体用外植体用2.5%2.5%次氯酸钠灭菌次氯酸钠灭菌20-30min20-30min，然后用蒸馏水洗，然后用蒸馏水
13、洗3 3次。次。对层积过的种子可用多次灭菌法对层积过的种子可用多次灭菌法，在种子吸胀前后都要灭菌。，在种子吸胀前后都要灭菌。对易污染而难灭菌的材料用多种药液交替浸泡消毒：对易污染而难灭菌的材料用多种药液交替浸泡消毒：一是将外植体用洗涤液充分洗净并修整干净；一是将外植体用洗涤液充分洗净并修整干净；二是将材料放入二是将材料放入75%75%洒精中灭菌洒精中灭菌30-60s30-60s；三三是是在在1 1：500500的的Roccal Roccal B B（一种商品灭菌剂名）稀释液中浸（一种商品灭菌剂名）稀释液中浸5min5min；四是在四是在2.5%2.5%次氯酸钠溶液中灭菌次氯酸钠溶液中灭菌202
14、030min30min；五五是是用用无无菌菌水水冲冲洗洗5 5次次，或或放放入入无无菌菌的的0.1mol0.1mol盐盐酸酸（HClHCl）中浸中浸15-20s15-20s，再用无菌水冲洗数次。，再用无菌水冲洗数次。 （3 3）玻璃器皿的灭菌）玻璃器皿的灭菌湿热灭菌法湿热灭菌法即将玻璃器皿包扎后置入蒸汽灭菌锅中进行高温高压灭菌，即将玻璃器皿包扎后置入蒸汽灭菌锅中进行高温高压灭菌，灭菌时间可延长达灭菌时间可延长达25min25min30min30min。干热灭菌法干热灭菌法即将玻璃器皿置入电热烘箱中进行灭菌。即将玻璃器皿置入电热烘箱中进行灭菌。煮沸灭菌煮沸灭菌即将玻璃器皿放入水中煮沸进行灭菌。即
15、将玻璃器皿放入水中煮沸进行灭菌。（4 4）金属器械的灭菌）金属器械的灭菌火焰灭菌法火焰灭菌法：即把金属器械放在：即把金属器械放在95%95%的酒的酒精中浸一下，然后放在火焰上燃烧灭菌。精中浸一下，然后放在火焰上燃烧灭菌。这一步骤应当在无菌操作过程中反复进这一步骤应当在无菌操作过程中反复进行。行。干热灭菌法干热灭菌法：即将拭净或烘干的金属器械用：即将拭净或烘干的金属器械用纸包好，盛在金属盒内，放在烘箱中灭菌。纸包好，盛在金属盒内，放在烘箱中灭菌。（5）布质制品的灭菌布质制品的灭菌湿热灭菌法：工作服、口罩、帽子等布质品均用湿湿热灭菌法：工作服、口罩、帽子等布质品均用湿热灭菌法，即将洗净晾干的的布质
16、品，放入高压锅热灭菌法，即将洗净晾干的的布质品，放入高压锅中，用中，用1.11.1公斤公斤/ /厘米厘米2 2 （即（即1515磅磅/ /英寸英寸2 2），），121121 C C的温度，灭菌的温度，灭菌20 min20 min30min30min。（6 6）无菌操作室的灭菌）无菌操作室的灭菌无无菌菌操操作作室室的的地地面面、墙墙壁壁和和工工作作台台的的灭灭菌菌可可用用2%2%的的新新洁洁尔尔敏敏或或75%75%的的酒酒精精擦擦洗洗，然然后后用用紫紫外外灯灯照照射射约约20min20min。使使用用前前用用75%75%的的酒酒精精喷喷雾雾，使使空空间间灰灰尘尘落落下下。一一年年中中要要定定期一
17、、二次用甲醛和高锰酸钾熏蒸。期一、二次用甲醛和高锰酸钾熏蒸。（7 7）操操作作人人员员在在接接种种时时一一定定要要严严格格按按照照无无菌菌操操作作的的程程序进行序进行二、外植体的接种和培养二、外植体的接种和培养（一）外植体的接种（一）外植体的接种 （二）外植体的培养（二）外植体的培养外植体的接种外植体的接种是把经过表面消毒后的植物材料切碎是把经过表面消毒后的植物材料切碎或分离出器官、组织、细胞，并将它们转放到无菌培养或分离出器官、组织、细胞，并将它们转放到无菌培养基上的全部操作过程。基上的全部操作过程。整个接种过程均须无菌操作。操整个接种过程均须无菌操作。操作过程中引起的污染，主要由空气中的细
18、菌和工作人员作过程中引起的污染，主要由空气中的细菌和工作人员本身引起的。本身引起的。因此除接种室空气消毒外，应特别注意防因此除接种室空气消毒外，应特别注意防止工作人员本身引起的污染。止工作人员本身引起的污染。（一）外植体的接种（一）外植体的接种1 1操作人员需着经消毒的白色工作服，戴口罩。操作人员需着经消毒的白色工作服，戴口罩。进入进入接种室前，工作人员的双手必须进行消毒，用肥皂和水接种室前，工作人员的双手必须进行消毒，用肥皂和水洗涤能达到良好的效果洗涤能达到良好的效果, , 进行操作前再用进行操作前再用75%75%的酒精擦洗双手。的酒精擦洗双手。无菌操作室的灭菌无菌操作室的灭菌无无菌菌操操作
19、作室室的的地地面面、墙墙壁壁和和工工作作台台的的灭灭菌菌可可用用75%75%的的酒酒精精擦擦洗洗，然然后后用用紫紫外外灯灯照照射射约约20min20min。使使用用前前用用75%75%的的酒酒精精喷喷雾雾，使使空空间间灰灰尘尘落落下下。一年中要定期一年中要定期1-21-2次用甲醛和高锰酸钾熏蒸。次用甲醛和高锰酸钾熏蒸。2 2操操作作期期间间经经常常用用75%75%的的酒酒精精擦擦拭拭双双手手和和台台面面。特特别别注注意意防防止止“双双重重传传递递”的的污污染染，例例如如：器器械被手污染后又污染培养基。械被手污染后又污染培养基。 3 3在打开培养瓶时，最大的污染危险是管口边沿沾染在打开培养瓶时，
20、最大的污染危险是管口边沿沾染的微生物落入管内，解决这个问题，的微生物落入管内，解决这个问题，可在打开前用火可在打开前用火焰烧瓶口。焰烧瓶口。 如果培养液接触了瓶口，则瓶口要烧到足够的热如果培养液接触了瓶口，则瓶口要烧到足够的热度，以杀死存在的细菌。度，以杀死存在的细菌。 为避免灰尘污染瓶口，可用纸或者保鲜膜包扎瓶为避免灰尘污染瓶口，可用纸或者保鲜膜包扎瓶口和塞子，口和塞子，以遮盖瓶子颈部和试管口，相对地减少污以遮盖瓶子颈部和试管口，相对地减少污染机会。染机会。4工具用后及时消毒，避免交叉污染。5工作人员的呼吸也是污染的主要途径。通常在平静呼吸时细菌是很少的，但是谈话或咳嗽时细菌便增多，因此操作
21、过程应禁止不必要的谈话并戴上口罩。6 6由于空气中有灰尘，因此在操作时，仍要注意避免灰由于空气中有灰尘，因此在操作时，仍要注意避免灰尘的落入。尘的落入。尽量把盖子盖好，当打开瓶子或试管时，应尽量把盖子盖好，当打开瓶子或试管时，应拿成斜角，以免灰尘落入瓶中。拿成斜角，以免灰尘落入瓶中。 刀、剪、镊等用具，一般在使用前浸泡在刀、剪、镊等用具，一般在使用前浸泡在95%95%酒精中酒精中或插在器械灭菌器中，用时在火焰上消毒，待冷却后使或插在器械灭菌器中，用时在火焰上消毒，待冷却后使用。每次使用前均需进行用具消毒。用。每次使用前均需进行用具消毒。（二）外植体的培养（二）外植体的培养 接种后的外植体应送到
22、培养室去培养。组织培养的优接种后的外植体应送到培养室去培养。组织培养的优点之一点之一就是在人工控制的环境条件下，使培养物生长发育，就是在人工控制的环境条件下，使培养物生长发育，研究植物的生命活动。研究植物的生命活动。 培养室的培养条件要根据植物对环境条件的不同需求培养室的培养条件要根据植物对环境条件的不同需求进行调控。进行调控。其中最主要的是光照、温度、湿度、氧气和培其中最主要的是光照、温度、湿度、氧气和培养基的养基的pHpH值等。值等。1 1光照光照 对离体培养物的生长发育，光照条件有重对离体培养物的生长发育，光照条件有重要的作用。要的作用。通常对愈伤组织的诱导，在黑暗条件下通常对愈伤组织的
23、诱导，在黑暗条件下有利，在有光条件下培养的愈伤组织质地和颜色也有利，在有光条件下培养的愈伤组织质地和颜色也有不同。有不同。但分化器官需要光照，并随着芽苗的生长但分化器官需要光照，并随着芽苗的生长需要加强光照。需要加强光照。加强光照，可以使小苗生长健壮，加强光照，可以使小苗生长健壮，促进促进“异养异养”向向“自养自养”转化，提高移植的成活率。转化，提高移植的成活率。 普通培养室要求每日光照普通培养室要求每日光照12h-16h12h-16h，光照强度，光照强度1000lx-1000lx-5000lx5000lx。如果培养材料要求在黑暗中生长，可用铝箔或者如果培养材料要求在黑暗中生长，可用铝箔或者适
24、合的黑色材料包裹在容器的周围，或置于暗室中培养。适合的黑色材料包裹在容器的周围，或置于暗室中培养。2 2温温度度 离离体体培培养养中中对对温温度度的的调调控控要要比比光光照照显显得得更更为为突突出出。不不同同的的植植物物有有不不同同的的最最适适生生长长温温度度，大大多多数数植植物物最最适适温温度度在在2323 C-C-3232 C C之之间间。培培养养室室一一般般所所用用的的温温度度是是2525 C C2 2 C C。低于低于1515 C C或高于或高于3535 C C，对生长都是不利的。，对生长都是不利的。3 3湿湿度度 组组织织培培养养中中的的湿湿度度影影响响主主要要有有两两个个方方面面，
25、一一是是培培养养容容器器内内的的湿湿度度，它它的的湿湿度度条条件件常常可可保保证证100%100%。二二是是培培养养室室的的湿湿度度，它它的的湿湿度度变变化化随随季季节节和和天天气气而而有有很很大大变变动动。湿湿度度过过高高过过低低都都是是不不利利的的，过过低低会会造造成成培培养养基基失失水水而而干干枯枯，或或渗渗透透压压升升高高，影影响响培培养养物物的的生生长长和和分分化化；湿湿度度过过高高会会造造成成杂杂菌菌滋滋长长，导导致致大大量量污污染染。因因此此，要要求求室室内内保保持持70%-80%70%-80%的相对湿度。的相对湿度。4 4氧气氧气 植物组织培养中，外植体的呼吸需要氧气。在液体培养中植物组织培养中，外植体的呼吸需要氧气。在液体培养中，振荡培养是解决通气的良好办法。，振荡培养是解决通气的良好办法。
