Chapter 5 G-protein coupled seven TMS (transmembranous segment) receptor（GPCR） and post-receptor signal transduction （（ G蛋白的分类蛋白的分类 ：Subtypes of G (% of homology)Each type of receptor has its own selectivity 1. Fundamental structure of G-protein Heterotrimer: (39~52KDa)、 (35~36)、 (6~10) Function of G：：Coupling to receptor, signal transduction Functional domains of G ：：NC1. N-terminal: coupling to , 2. C-terminal: coupling to receptor, Rec3. Conservative area (G1 – G5): GTP binding and GTPase4. Effector domain: coupling to effector enzymesG1G2 G3G4G5EffEff555. Others: CTx, PTx, MyristoylationMyristoylation CTx PTx, Receptor - G protein2. Function of G Intercellular signal Intracellular signal Linked to AC or PLC Gs：AC (adenylate cyclase) Gi (Go)：AC (adenylate cyclase) Gq (G11): PLC (phospholipase C) G12: PLC (not fully clarified)PLCAbout G12: Kurose H. Life science 74(2003):155-61G G蛋白蛋白（主要起信号转导）αγ异源三聚体,α亚基与GTP结合、GTP水解酶活性，它决定着G蛋白的个性，G蛋白亚型有10种以上。
γ亚基则由各种G蛋白所共用，α亚基激活，α亚基固定在细胞质膜上，提高了α亚基的局部浓度，有利于G蛋白与受体结合 低分子量（小）G蛋白，分子量2万左右的单一多肽，分解GTP的活性 包括癌基因ras的产物，15种蛋白质属于这种G蛋白类，作用多样性 Native cell membrane/G-proteins, usingð Site directed antibodies to block G-protein activationð Cholera toxin (CTx) to inhibit certain Gið Antisense oligonucleotides to block normal G-protein sysnthesis 3. Receptor agonist dependent G-protein activation agonistReceptorEffectorSilence: G bind to GDP, dissociation of G-protein and receptor①①②②③③④④⑤⑤⑥⑥ 3. Receptor agonist dependent G-protein activation agonistReceptorEffector①① Agonist binds to receptor, leading conformational change of receptor and association of G-protein and receptor①①②②③③④④⑤⑤⑥⑥ 3. Receptor agonist dependent G-protein activation agonistReceptorEffector②② GDP dissociation，formation of a transient “empty” G ①①②②③③④④⑤⑤⑥⑥ 3. Receptor agonist dependent G-protein activation agonistReceptorEffector③③ Binding of GTP to G ①①②②③③④④⑤⑤⑥⑥ 3. Receptor agonist dependent G-protein activation agonistReceptorEffector④④ Conformational change of GTP- to GTP- *, dissociation of G- protein from receptor, followed by dissociation of agonist①①②②③③④④⑤⑤⑥⑥ 3. Receptor agonist dependent G-protein activation agonistReceptorEffector⑤⑤ Dissociation of * complex to GTP- * and ，leading to signal transduction to effector.①①②②③③④④⑤⑤⑥⑥ 3. Receptor agonist dependent G-protein activation agonistReceptorEffectorReceptor and G-protein return to original silent state①①②②③③④④⑤⑤⑥⑥ 4. Endogenous GTPase de-activate G-proteinagonistReceptorEffector ⑥⑥ G is itself an enzyme, (GTPase): GTP- * + H2O GDP- + Pi GDP- + GDP- Receptor and G-protein return to original silent stateDissociation of GTP- * is1.irreversible 2.rather slow, rate constant being 0.05～5min-1, therefore has amplification effect 5. Function of dimer (not extensively studied)1）Promote the coupling of G and receptor2）Inhibit the dissociation of GDP and G during silence to reduce the basal signal 3）Localization of G-protein, promote the exchange of GDP and GTP, promote the agonist stimulated phosphorylation of receptor4））May be directly involved in signal transduction Activate PLA2 K+ channel Activate PLC IP3 pathway Involved in regulating certain subtypes of AC 受体特点：激活G蛋白（一种与三磷酸鸟苷结合的膜蛋 白质）、细胞内产生第二信使 改变 其他酶活性七跨膜型受体 G蛋白特点：介导的信号转导反应是一种慢速的过程， 经历时间长，但是敏感性高，灵活性大。
第二信使：cAMP、Ca++、IP3(肌醇1,4,5-三磷酸)、 DAG（二酯酰甘油）等 cAMP pathway Phosphatidylinositol pathway Gs、Gi、G12 Gq Adenylate cyclase (AC) Phospholipase C (PLC) Protein kinase A (PKA) Hydrolysis of 4,5-diphospho- Intracellular cAMP phosphatidyl inositol (PIP2) Protein phosphorylation IP3（Ca2+）+ DAG Biological effect Biological effect two pathwaysSignal transduction via G-protein 与G蛋白相互作用的效应蛋白•Gs :激活腺苷酸环化酶, 提高cAMP含量•Gi or Go: 抑制腺苷酸环化酶, 降低cAMP含量•Gt: 视网膜杆状细胞中视紫红质接受光,激活cGMP•Gq:激活磷脂酶C, 产生IP3+DAG•离子通道、PLA2（水解产生花生四烯酸，该酸是前列腺素、白三烯、血栓恶烷的前体，神经突触前的介质）、转运蛋白（葡萄糖转运蛋白、镁转运蛋白、Na/ H+交换蛋白） Second Messenger (Sutherland, 1972 Nobel Prize)1. A should be able to yield similar biological effect as H in respective cells. 2. H should be able to raise the A content in respective cells. 3. H should be able to effect the activity of enzymes for the synthesis or break down of A.4. The time relation should be: Change of H content earlier than change of A content, and change of A content earlier than change of biological effect. 5. Drugs effecting A content can mimic or suppress the effect of H.What is 2nd messenger? If hormone H is the 1st messenger, an intracellular molecule A is 2nd messenger, A should suffice the following requirement:第二信使：受体被激活，细胞内产生介导信号转导通路的活性物质。
1.Cyclic AMP pathway of G-protein signal transduction 1. Formation and degradation of cyclic AMP (cAMP)： Adenyl cyclase, AC ： ATP cAMP Two state: ACa and ACi, regulated by Gs and Gi Phophodiesterase, PDE：irreversible hydrolysis of cAMP Half life of cAMP is very short, only a few min 2. Activate Protein kinase A, PKA ð2 catalytic and 2 regulatory unitsðcAMP causes dissociation of catalytic and regulatory unitðCatalytic unit being activated ðDissociation and association are reversible, depends on cAMP concentration, hence the activity of PKA depends on cAMP concentration 3. Action of cAMP: PKA (inactive)PKA (active)Protein phosphorylation•PKA:I and II types R subtype difference•cAMP 刺激：浓度、应答不同取决于PKA底物、信号转导通路差异。
•cAMP•停止细胞增殖：纤维母细胞、造血细胞•促进细胞增殖：上皮和内皮细胞系统 Result of activation of PKA:phosphorylation of various proteins -AdrenoceptorPKAPhosphorylation of Ca2+channel, Glycogen synthetase,Phosphorylase kinase, Troponin IContraction force, tension, beat rate of heart increasedð Not highly specific, which one predominant depends on the specific cell ð May be one step, may be via cascadeð Sometimes, the physiological result is the harmonious complex of phosphorylation of several target proteinð The target protein may be activated or inhibited by phosphorylation. -AdrenoceptorPKAPhosphorylation of Ca2+channel, Glycogen synthetase,Phosphorylase kinase, Troponin IContraction force, tension, beat rate of heart increased Activation Action of PKA: phosphorylation of proteins DeactivationMetabolic enzymeActivationDeactivationPhosphatase CRETATACREBBasalComplex(cAMP response element) (CRE binding protein)PKAPGene Expression 生理功能•参与细胞周期的调控•细胞DNA复制的控制•组蛋白H1与真核基因表达的调节控制•基因转录的调节•蛋白合成因子及核糖体蛋白的调控蛋白质磷酸化和去磷酸化几乎调节着生命活动的所有过程，包括细胞的增殖、发育和分化，神经活动，肌肉收缩，新陈代谢，肿瘤发生等。
蛋白质磷酸化和去磷酸化常伴随蛋白质生理活性的变化，是一个动态平衡过程 •蛋白质可逆磷酸化的调节在信号转导过程中有重要作用，是细胞生命活动的调控中心 •细胞内每时每刻进行着多种多样的生物化学反应，生物体能迅速对体内的环境和外界刺激产生正确的应答，这些过程都有复杂的调控机制，其中大多数是直接或间接由蛋白质的变构作用介导的蛋白质本身的构象变化是通过变构效应和各种修饰来实现的，蛋白质磷酸化是最常见、最重要的共价修饰方式 G-蛋白的研究和含量测定的方法蛋白的研究和含量测定的方法 Inhibitory Agonist Stimulatory Agonist R R GTP GTP Gi Gs – + GDP AC GDP ATP cAMP 受体与G-蛋白偶联的测定•试剂：试剂： -[35S]-GTPS、GDP、GTPS•方法：方法： NSB: 细胞膜+ 35S-GTPS+ GTPS Basal: 细胞膜+ 35S-GTPS+GDP Reaction: 细胞膜+ 35S-GTPS+agonist 测量: 分离结合部分测cpm 计算： cpmagonist - cpmNSB cpmbasal - cpmNSB 1.What are the 2 fundamental characteristics of G-protein coupled receptors?2.There are 4 important domains of G-protein coupled receptors, what is the main function of each domain?3.Can you describe briefly about the presently accepted common structure of agonist binding site of G-protein coupled receptors?4.Describe briefly the basic structure of G-protein.5.Describe briefly the process of ligand activation of G-protein.6.Why does the activated G-protein rapidly deactivated?7.How can we measure the coupling activity and coupling activity by 35S? What is the difference between coupling activity and coupling efficiency? cAMP pathway Phosphatidylinositol pathway Gs、Gi、G12 Gq Adenylate cyclase (AC) Phospholipase C (PLC) Protein kinase A (PKA) Hydrolysis of 4,5-diphospho- Intracellular cAMP phosphatidyl inositol (PIP2) Protein phosphorylation IP3（Ca2+）+ DAG Biological effect Biological effect two pathwaysSection 5. Signal transduction via G-protein Section 7. Signal transduction via G-proteinThe Phosphoinositol pathway 1. G-蛋白信息传递中磷脂肌醇通路的蛋白信息传递中磷脂肌醇通路的两个主要第二信使两个主要第二信使 PI-4K PLC DAG PI PI(4,5)P2 IP3 ATP ADP1. PLC 即磷脂酶即磷脂酶C (Phospholipase C), 有有 、、 、、 三类，三类，与与G蛋白偶联的是蛋白偶联的是PLC . 某些受体被配基激动后通某些受体被配基激动后通过过Gq 使之激活，将使之激活，将PI(4,5)P2 水解成水解成 IP3及及DAG2. IP3 及及DAG是该通路最主要的两个第二信使，是该通路最主要的两个第二信使， IP3主主要通过调制细胞内要通过调制细胞内Ca2+ 的浓度调节细胞功能，的浓度调节细胞功能，DAG 主要通过激活主要通过激活PKC调节细胞功能调节细胞功能 细胞膜三种磷脂酰肌醇的结构细胞膜三种磷脂酰肌醇的结构 磷脂酰肌醇的水解磷脂酰肌醇的水解•PLC对三者都有水解作用，对三者都有水解作用，Ca2+浓度低时对浓度低时对PIP2的活的活力特别强力特别强 2. IP3和细胞内和细胞内Ca2+•IP3 对细胞内对细胞内Ca 2+ 的调节作用的调节作用IP3 胞浆胞浆Ca 2+ (从从10-8 ～～10-9 到到10-5 ～～10-6 mol/L) 主要机制：钙池释放主要机制：钙池释放 Ca 2+ （（ 内质网内质网IP3 受体）受体） 可能机制：胞膜可能机制：胞膜 Ca 2+ 通道开放通道开放•细胞内细胞内 Ca 2+ 的主要作用：形成的主要作用：形成 Ca 2+ - Ca-M (活性复活性复合物合物)，导致很多蛋白的磷酸化，导致很多蛋白的磷酸化 2. IP3 and intracellular Ca2+ðIP3 cytoplasmic Ca2+ (10-8 ～10-9 to10-5 ～10-6 mol/L) ðMechanism：open the Ca2+ channel of intracellular Ca 2+ pool (endoplasmic reticulum) (IP3-gated ion-channel)ð Possible mechanism: open membrane Ca2+channel activate some enzyme,ð Ca2+ bind calmodulin 3. 钙调蛋白钙调蛋白(Calmodulin, CaM))•结构：两端成球状，各有两个结构：两端成球状，各有两个 Ca 2+ 结合位点结合位点, 每个球每个球 状结构各有一凹陷，形状结构各有一凹陷，形 成钳状，易与底物结合成钳状，易与底物结合•功能：功能： Ca 2+ - CaM 复合物复合物促进促进底物蛋白与底物蛋白与CaM结合，结合， 导致底物磷酸化导致底物磷酸化 细胞功能变化细胞功能变化 Ca 2+ - CaM 复合物复合物促进促进底物蛋白磷酸化的效应底物蛋白磷酸化的效应 CaMKII is the main kinase for many Ca2+ dependent proteins, activating them by phosphorylationCa2+-CaMBind the regulatory domain of CaMKIIConformational changeATP binding site exposed ATP bound to the ATP binding site The kinase activated (At silence, regulatory unit bound to the ATP binding site) Ca2+-CaM对神经系统的双相对神经系统的双相 (精细精细) 调节调节神经储钙蛋白神经储钙蛋白(Calcineurin)：： 蛋白磷酸酶蛋白磷酸酶2B (脑钙依赖性蛋白脱磷酸，导致失活脑钙依赖性蛋白脱磷酸，导致失活) Ca2+-CaM对脑钙依赖性对脑钙依赖性 蛋白质的综合作用：蛋白质的综合作用： 活化的脑钙依赖性活化的脑钙依赖性 蛋白质调节更精细蛋白质调节更精细 4. 一氧化氮一氧化氮 (NO)和环一磷酸鸟苷和环一磷酸鸟苷(cGMP) Ca2+-CaM是是NO合成酶合成酶(nitric oxide synthase)的主要激活因的主要激活因素素 NO激活胞浆中的鸟苷酸环化酶激活胞浆中的鸟苷酸环化酶(guanylyl cyclase) 鸟苷酸环化酶鸟苷酸环化酶 (Guanylate cyclase, GC)· 两类两类GC：： 膜膜GC (心钠素受体心钠素受体) 可溶性可溶性GC（（血管内皮、脑、巨核细胞）血管内皮、脑、巨核细胞）·可溶性可溶性GC结构和激活：结构和激活： 羧基端有一个催化域羧基端有一个催化域 氨基端有血红素氨基端有血红素结合域，与血红素结合，结合域，与血红素结合，GC无活性无活性 NO的激活作用：和血红素结合使之脱落，的激活作用：和血红素结合使之脱落，GC激活激活 环一磷酸鸟苷的生成、降解和作用环一磷酸鸟苷的生成、降解和作用•cGMP的的生成和降解：生成和降解： NO (CO) NO (CO) 活化活化 PDE GTP 3’,5’-cGMP 5’-GMP催化区催化区血红素血红素催化区催化区 血红素血红素 cGMP及及PKG的生理效应的生理效应cGMP 发挥作用的三条途径：发挥作用的三条途径： 通过通过PKG 通过离子通道通过离子通道 通过影响通过影响 cAMP分解分解PKG的活化的活化 cGMP及及PKG的生理效应的生理效应•cGMP 发挥作用的三条途径：发挥作用的三条途径： 通过通过PKG 通过离子通道通过离子通道 通过影响通过影响 cAMP分解分解•PKG 的作用：多种蛋白的磷酸化的作用：多种蛋白的磷酸化 (研究较研究较PKA少少) 有些和有些和PKA同方向，意义不明同方向，意义不明 有些与有些与PKA反方向，可能属精细调节反方向，可能属精细调节 如激活如激活RNA聚合酶聚合酶 I、、抑制磷酸果糖激酶抑制磷酸果糖激酶 (PKA相反相反) 有些有特殊意义：有些有特殊意义： 如扩张血管平滑肌：如扩张血管平滑肌：(可能是可能是NO扩血管的主要机制扩血管的主要机制) 脑细胞兴奋：突触传递的长时程增加脑细胞兴奋：突触传递的长时程增加/抑制抑制 (可能是兴奋性氨基酸的重要中间环节可能是兴奋性氨基酸的重要中间环节) NO-cGMP扩血管的机制扩血管的机制 Angiotensin等等 PKG cGMP IP3 NO 细胞内细胞内Ca 2+ Ca 2+ -CaM CaMKII LMCK 活化，活化， 平滑肌收缩平滑肌收缩( )PKG 可能引起可能引起IP3形形成过程某些成分磷酸成过程某些成分磷酸化而导致抑制化而导致抑制 5. 二脂肪酰甘油脂二脂肪酰甘油脂 (diacyl-glycerol, DAG) 和和蛋白激酶蛋白激酶C (PKC)PI- 4,5-P2 IP3 + DAG 磷酸化后参予磷酸化后参予 PIP2的再生成循环的再生成循环 水解产生水解产生 花生四烯酸花生四烯酸 (arachidonic A) PKC(i) DAG•PKC(a) 及前列腺素及前列腺素 (prostaglandin)分布：各种组织，其中脑、血癌细胞量最高分布：各种组织，其中脑、血癌细胞量最高 PKC的结构和亚型的结构和亚型基本结构：经典或普通基本结构：经典或普通PKC有四个保守区段有四个保守区段 C1 C2 C3 C4 DAG结合区结合区 ATP结合位点结合位点 钙结合位点钙结合位点 催化活性部位催化活性部位亚型分类：亚型分类： A类类 (经典或普通经典或普通PKC) 钙依赖性，钙依赖性，DAG依赖性依赖性 B类类 (新新PKC) 无无C2，，无钙依赖性无钙依赖性 C类类 (不典型不典型PKC) 无无C2，，缺一半缺一半C1，，无钙及无钙及DAG依赖性依赖性每一类又分若干亚型以希腊字母区分每一类又分若干亚型以希腊字母区分 PKC的活化及作用的活化及作用•活化：假底物（活化：假底物（pseudosubstrate)与与 PKC 结合时，结合时，PKC处处于非活性状态。
于非活性状态DAG或或 Phorbol与与 PKC 的调节功能域结的调节功能域结合时，合时，PKC发生构象发生构象(conformation)改变，假底物脱落，改变，假底物脱落，PKC激活激活 •主要作用：催化多种蛋白磷酸化主要作用：催化多种蛋白磷酸化 包括某些膜受体、激酶、收缩蛋白、代谢酶、转录因子、包括某些膜受体、激酶、收缩蛋白、代谢酶、转录因子、基因表达及蛋白合成有关的酶等基因表达及蛋白合成有关的酶等 Activation of PKCðPseudosubstrate domain: a sequence of 18-19 amino acid located in DAG binding domain.ðAt silence, pseudo substrate bind with catalytic domain. ðDAG binding dissociates the pseudo substrate, PKC is activated. ðArtificial pseudo substrate can inhibit the respective PKC. PKC构效关系构效关系PKC构效关系和生理意义有待深入研究构效关系和生理意义有待深入研究 体内体内PKC的功能调节的功能调节•对正常细胞的调节作用：活化生长因子对正常细胞的调节作用：活化生长因子•对细胞粘附和分化的影响：对细胞粘附和分化的影响：•对细胞间的信息交流的影响：生长、分化、抑制调节对细胞间的信息交流的影响：生长、分化、抑制调节 生长密度生长密度•对原癌基因的表达的调节：限速步骤对原癌基因的表达的调节：限速步骤•对基因表达的调节：对基因表达的调节：•对细胞核功能的调节：核蛋白激酶对细胞核功能的调节：核蛋白激酶 PKC的反馈调节的反馈调节•PKC活化活化 对细胞生长起正调节作用对细胞生长起正调节作用 负反馈的调节：负反馈的调节： 磷脂肌醇的降解、受体含量的负调节磷脂肌醇的降解、受体含量的负调节 受体与配基的亲和力降低、抑制受体酪氨酸磷酸化受体与配基的亲和力降低、抑制受体酪氨酸磷酸化•PKC和和PKA的的“对话对话”(cross talking) Ca2+-CaM cAMP PKA活化活化 封闭封闭PIP2 水解水解 DAG PKC • PKC与与PKA途径对细胞增殖和生长有相反作用途径对细胞增殖和生长有相反作用 。