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1、2 Biosynthesis of RNATranscriptionReplicationreversetranscript一、转录（一、转录（Transcription）概概念念：DNA的的遗遗传传信信息息转转移移到到RNA分分子子中中的的过过程程，即即通通过过酶酶促促合合成成与与基基因因编编码码链链碱碱基基序序列列相相同同的的RNA链链，转录产物有转录产物有3种种RNA：mRNA, rRNA, tRNA。DNA-Dependent Synthesis of RNA不对称转录不对称转录 在在生生物物体体内内，DNA的的两两条条链链中中只只有有一一条条用用于于转转录录，另另一一条条链链可可能能
2、对转录起调节作用对转录起调节作用。 用于转录的链为用于转录的链为模板链模板链（template strand）/负链负链/反义链反义链/非编码链非编码链； 另一条链称为另一条链称为非模板链非模板链/正链正链/有义链有义链/编码链编码链。 由于转录只在由于转录只在DNA的一条链进行，所以称为的一条链进行，所以称为不对称转录不对称转录。基因的有义链并不总是在染色体基因的有义链并不总是在染色体DNA的同一条链上的同一条链上。基因的转录是有选择的基因的转录是有选择的：时间（不同的发育时期）、空间：时间（不同的发育时期）、空间（不同的器官组织（不同的器官组织/细胞）细胞） 。 区别于区别于复制！复制！
3、转录的起始点转录的起始点 是指是指mRNA开始转录的第一个碱基，此点常用开始转录的第一个碱基，此点常用+1表示。表示。启动子：启动子：RNA聚合酶识别、结合和开始转录的聚合酶识别、结合和开始转录的一段一段DNA序列。序列。在在RNA转录起点的转录起点的上游上游，约，约100200 bp。注意原核启动子在注意原核启动子在-35 和和-10区域的保守序列区域的保守序列-35序列提供了序列提供了RNA聚合酶识别信号，聚合酶识别信号，-10序列有助于序列有助于DNA局部局部双链解开。双链解开。转录单位转录单位 ( transcript )：被转录成单个被转录成单个RNA分子的一段分子的一段DNA |
4、| | | | 5终止序列终止序列promoter起始位点起始位点调节区调节区转录因子转录因子：参与参与RNA聚合酶进行转录活动的辅助因子，为蛋白质。聚合酶进行转录活动的辅助因子，为蛋白质。终止子终止子：提供转录停止信号的提供转录停止信号的DNA序列（核苷酸片段）。序列（核苷酸片段）。upstream-1 1 2downstream(一一) RNA合成的酶促反应合成的酶促反应 n1ATPn2GTPn3CTPn4UTP+ DNA template AMPn1GMPn2CMPn3UMPn4RNARNA polymeraseMg 2+ , Zn 2+(n1+n2+n3+n4)PPiRNA Is Sy
5、nthesized by RNA Polymerase新合成链的新合成链的5 端常是端常是GTP或或ATP，它们的，它们的5 三磷酸基团在转三磷酸基团在转录过程中保留完整。录过程中保留完整。转录时，转录时，DNA双链只双链只部分解链部分解链，新，新RNA链与模板链形成链与模板链形成RNA-DNA杂交链。杂交链。底物：底物：NTP；方向：方向：5 3有转录起始位点，合成有转录起始位点，合成不需要引物不需要引物，RNA聚合酶聚合酶“无校正功能无校正功能”碱基配对：碱基配对：dT- A, dA- U, dC- G, dG- C基本特点！基本特点！（二）原核生物（二）原核生物RNA的合成的合成E.co
6、li RNA polymerase分子量分子量46500，由五个亚基构成，即，由五个亚基构成，即2。全酶全酶= 核心酶（核心酶（2）+ 因子因子E.coli只有一种只有一种DNA指导的指导的RNA聚合酶，此聚合酶，此细菌的三类细菌的三类RNA均由这同一种酶起作用均由这同一种酶起作用。因子因子转录开始时转录开始时识别转录起始点识别转录起始点，使全酶结合在起始位点上，形成全酶，使全酶结合在起始位点上，形成全酶-DNA复合复合物物, 而在转录合成开始后被释放，由而在转录合成开始后被释放，由核心酶催化核心酶催化RNA的合成的合成。结合调控序列结合调控序列催化磷酸二酯键形成催化磷酸二酯键形成与模板与模板
7、DNA结合结合识别启动子识别启动子, 起动合成起动合成因子先识别因子先识别-35区保守序列，并与之结合，该区是聚合酶的初始区保守序列，并与之结合，该区是聚合酶的初始识别位点。识别位点。原核中，原核中，-35与与-10区之间的距离（区之间的距离（1619bp）对于转录很重要，而）对于转录很重要，而之间的碱基序列对转录并不重要。之间的碱基序列对转录并不重要。转录过程转录过程起始起始延长延长终止终止转录起始转录起始转录起始转录起始因子识别因子识别DNA上的起始位点上的起始位点形成全酶形成全酶-DNA二元复合物二元复合物DNA解链，形成转录泡解链，形成转录泡（transcription bubble）
8、亚亚基基催催化化形形成成RNA的的第第一一个个核核苷苷三三磷磷酸酸（GTP或或ATP），形形成成启启动动子子、全全酶酶和核苷三磷酸组成的三元起始复合物和核苷三磷酸组成的三元起始复合物合成合成8-9nt RNA后，后，亚基被释放脱离亚基被释放脱离核心酶核心酶终止终止 转转录录终终止止需需要要终终止止信信号号，即即转转录录终终止止子子（terminators ）的）的DNA序列序列。两类终止子：两类终止子： -非依赖性终止子非依赖性终止子 -依赖性终止子依赖性终止子 转转录录终终止止需需要要终终止止因因子子NusA：在在RNA合合成成的的延延伸伸和和终终止止时时NusA可可代代替替因因子子，和和因
9、因子子一一样样， NusA与与RNA聚聚合合酶酶的的核核心酶结合，但不那么牢固。心酶结合，但不那么牢固。延长延长 以以NTP为原料和能量，为原料和能量，DNA模板链为模板，靠核心酶的催化，模板链为模板，靠核心酶的催化，核苷酸间通过核苷酸间通过3,5-磷酸二酯键成核糖核酸链磷酸二酯键成核糖核酸链(RNA) -非依赖性终止子：非依赖性终止子： 在终止点之前具有一段在终止点之前具有一段富含富含G-C的回文序列的回文序列；富含；富含G-C的区域之后是的区域之后是一连串的一连串的dA碱基序列碱基序列，它们转录的，它们转录的RNA链的链的末端为一连串末端为一连串U（连续（连续6个）个）。转录出的转录出的R
10、NA形成的发夹结构中断了形成的发夹结构中断了DNA-RNA杂合体的形成杂合体的形成-依赖性终止子依赖性终止子 有的终止子要有的终止子要 因子的帮助才能终止因子的帮助才能终止转录。其回文结构不富转录。其回文结构不富含含G-C区，其后无寡聚区，其后无寡聚U。细菌中少见，噬菌体中广泛存在。细菌中少见，噬菌体中广泛存在。（三）真核生物转录作用（三）真核生物转录作用真核生物有三种真核生物有三种RNA聚合酶：聚合酶：RNA聚合酶聚合酶I、 II、 IIIP562565真核生物的启动子由转录因子而不是真核生物的启动子由转录因子而不是RNA聚合酶所识别聚合酶所识别对对-鹅膏蕈碱的敏感性鹅膏蕈碱的敏感性不敏感不
11、敏感敏感敏感中等敏感中等敏感（四）（四） 转录过程的选择性抑制剂转录过程的选择性抑制剂按照作用的按照作用的对象、性质对象、性质不同，分为不同，分为2种：种：一、模板功能的抑制剂一、模板功能的抑制剂 嵌合剂：嵌合剂： 如如放线菌素放线菌素D (p 266)嵌入嵌入dG-dC之间之间 溴乙锭溴乙锭EB为高灵敏度荧光试剂为高灵敏度荧光试剂 吖啶吖啶二、二、RNA聚合酶的抑制剂聚合酶的抑制剂 原核生物：利福霉素（衍生物：利福平）原核生物：利福霉素（衍生物：利福平） 真核生物：真核生物： -鹅膏蕈碱鹅膏蕈碱（五）转录后加工（五）转录后加工 (post-transcriptional processing
12、)定义：各种定义：各种RNA合成时，先以合成时，先以DNA为模板生成分子量较为模板生成分子量较大的大的RNA前体（前体（primary transcript），然后在专一酶），然后在专一酶的作用下切除多余的部分，或进行修饰，最后才生成有的作用下切除多余的部分，或进行修饰，最后才生成有活性的活性的“成熟成熟”RNA。原核生物：原核生物：mRNA不需加工，不需加工，转录的同时即进行翻译。转录的同时即进行翻译。但但rRNA、 tRNA前体需要加工。前体需要加工。真核生物：三种真核生物：三种RNA前体均需转录后加工前体均需转录后加工 rRNA前体的转录后加工前体的转录后加工tRNA前体的加工前体的加工
13、真核真核mRNA前体的加工前体的加工 1. rRNA前体的转录后加工前体的转录后加工（1） 原核生物原核生物rRNA前体的加工前体的加工 30S16S、23S、5S、 tRNA（2）真核生物）真核生物rRNA前体的加工前体的加工 45S5.8S、18S、28S （5S rRNA由其它途径产生由其它途径产生 ）甲基化修饰：修饰在碱基甲基化修饰：修饰在碱基( (原原) )、核糖、核糖( (真真) )上上剪切作用：需专一核酸酶参与剪切作用：需专一核酸酶参与自我剪接：一种核酶的作用（真）自我剪接：一种核酶的作用（真）加工过程加工过程2. tRNA前体的加工前体的加工 细胞内细胞内tRNA种类多，各种种
14、类多，各种tRNA加工方式不同，加工方式不同，但主要方式有以下几种：但主要方式有以下几种：除去前体除去前体5和和3端多余的核苷酸端多余的核苷酸 （ 有时有时tRNA分子酶解产生分子酶解产生2个或更多的个或更多的tRNA）3末端加上末端加上CCA碱基的修饰碱基的修饰：甲基化、脱氨和还原作用：甲基化、脱氨和还原作用碱基甲基化修饰：甲基供体碱基甲基化修饰：甲基供体是是SAM（ S-腺苷甲硫氨酸腺苷甲硫氨酸）。）。Processing of tRNAs in bacteria and eukaryotesRNase P(5成熟酶）、成熟酶）、RNase D （3成熟酶）均识别成熟酶）均识别tRNA空间
15、结构；空间结构；碱基甲基化修饰：甲基供体碱基甲基化修饰：甲基供体是是SAM（ S-腺苷甲硫氨酸腺苷甲硫氨酸）。）。3.真核真核mRNA前体的加工前体的加工 CP：hnRNA and mature mRNA？1）5 端加帽端加帽2）3端加多聚端加多聚A（polyA）3）剪接剪接（Splicing）：）： 去除内含子，连接外显子去除内含子，连接外显子加工在细胞核中进行加工在细胞核中进行m7Gppp5 端加帽子结构端加帽子结构5,5 三磷酸桥三磷酸桥5 端加帽反应在端加帽反应在RNA合成了合成了30核苷酸后就开始进行。核苷酸后就开始进行。甲基化反应由甲基化反应由SAM （S-腺苷腺苷甲硫氨酸）甲硫氨
16、酸）提供甲基。提供甲基。5端为三磷酸端为三磷酸嘌呤核苷嘌呤核苷3端加端加polyAa. the cleavage signal sequences is bound by an enzyme complex.b. The RNA is cleaved by the endonuclease at a point 10 to 30 nucleotides 3 to (downstream of) the sequence AAUAAA.c. The polyadenylate polymerase (多聚腺苷酸聚合酶多聚腺苷酸聚合酶)synthesizes a poly(A) tail 80 t
17、o 250 nucleotides long, beginning at the cleavage site.RNA Splicing：在在基基因因转转录录过过程程中中，内内含含子子与与外外显显子子同同时时被被转转录录，产产物物为为RNA前前体体，切切除除前前体体中中的的内内含含子子，将将外外显显子连接形成成熟子连接形成成熟RNA的过程。的过程。*RNA剪接与剪接与RNA修饰无关，对不存在修饰无关，对不存在Cap、polyA的的mRNA序列序列同样可以剪接。同样可以剪接。*真核生物细胞核真核生物细胞核mRNA前体的剪接是在形成剪接体（前体的剪接是在形成剪接体（ spliceosome ）后才能
18、进行。剪接体是包括）后才能进行。剪接体是包括mRNA前体在内的多组前体在内的多组分复合物。分复合物。*内含子一般以内含子一般以GU开始到开始到AG结束结束。RNA 剪接剪接4种类型种类型类型类型自我剪接（自我剪接（group self-splicing）类型类型自我剪接（自我剪接（group self-splicing）核核mRNA剪接体的剪接剪接体的剪接（nuclear mRNA splicesomal splicing）核核tRNA的酶促剪接（的酶促剪接（nuclear tRNA enzymatic splicing）RNA Splicing：在在基基因因转转录录过过程程中中，内内含含子子
19、与与外外显显子子同同时时被被转转录录，产产物物为为RNA前前体体，切切除除前前体体中中的的内内含含子子，将将外外显显子子连接形成成熟连接形成成熟RNA的过程。的过程。类型类型自我自我剪接剪接两次转酯反应两次转酯反应亲核试剂来自鸟苷酸亲核试剂来自鸟苷酸真核生物细胞器基因，真核生物细胞器基因，低等真核生物核低等真核生物核rRNA基因，基因，细菌和噬菌体个别基因。细菌和噬菌体个别基因。例：四膜虫例：四膜虫6400nt6400nt pre-pre-rRNArRNA的加工的加工的加工的加工类型类型自我自我剪接剪接两次转酯反应两次转酯反应亲核试剂来自内含子亲核试剂来自内含子真菌线粒体，真菌线粒体，植物叶绿
20、体基因植物叶绿体基因RNA editing：RNA编码序列的改变编码序列的改变。RNA recoding：RNA读码和编码方式的改变。读码和编码方式的改变。原核细胞转录与复制比较：原核细胞转录与复制比较：合成方向均为合成方向均为5 3 比较比较 转录转录复制复制底物底物 NTP(A、G、C、U) dNTP(A、G、C、T)酶酶 RNA聚合酶聚合酶 DNA聚合聚合酶酶 （无核酸外切酶活性）（无核酸外切酶活性）模板模板 模板模板DNA的的1条链条链 模板模板DNA的的2条链条链 引物引物 不需要不需要 需要需要核对作用核对作用 无（碱基错配率较高）无（碱基错配率较高） 有有第第1个产物个产物 AT
21、P或或 GTP RNA引物，引物，NTP 转录产物需加工转录产物需加工 产物无需加产物无需加工工 忠实性忠实性 相对弱相对弱 高保真高保真起始？延伸？终止？起始？延伸？终止？此此RNA聚合酶特点聚合酶特点:模板特异性很高，它只识别病毒自身的模板特异性很高，它只识别病毒自身的RNA。底物为四种底物为四种NTP，不需要引物，需，不需要引物，需Mg2+。催化催化RNA复制的复制的 RNA聚合酶，以聚合酶，以RNA为模板，故该酶又为模板，故该酶又叫叫RNA指导的指导的RNA聚合酶（聚合酶（RNA-dependent RNA Polymerase，RDRP ；RNA replicase）。5 RNA-5
22、 3 3 RNA+释放释放释放释放35 3 3 5 5 RNA+RNA+RNA-vRNA-及及 RNA+的合成方向均为的合成方向均为5 3例例: 噬菌体噬菌体Q二、二、RNA的复制的复制以以RNA携带遗传信息，并能通过携带遗传信息，并能通过RNA复制与自身相同复制与自身相同RNA分子的生物，如分子的生物，如（+）RNA和（和（-）RNA： 通常将具有通常将具有mRNA功能的链称为（功能的链称为（+）RNA， 而它的互补链为（而它的互补链为（-）RNA。带（带（+）RNA的病毒可直接进行与病毒繁殖有关的蛋白质合成。的病毒可直接进行与病毒繁殖有关的蛋白质合成。1.（+）RNA病毒：病毒：不含复制酶
23、，如灰质炎病毒和噬菌体不含复制酶，如灰质炎病毒和噬菌体Q。2.（-）RNA病毒：病毒：含有复制酶，如狂犬病病毒，含有复制酶，如狂犬病病毒， H1N1流感病毒流感病毒。3.（）RNA病毒病毒：含双链：含双链RNA和复制酶，如呼肠孤病毒。和复制酶，如呼肠孤病毒。4. 逆转录病毒逆转录病毒：致癌：致癌RNA病毒，如白血病病毒，病毒，如白血病病毒，AIDS病毒。病毒。RNA复制类型复制类型以病毒以病毒RNA直接作为复制的模板；直接作为复制的模板；以病毒以病毒RNA为模板逆转录出为模板逆转录出cDNA，然后再从，然后再从DNA转录出病毒转录出病毒RNA。特殊的复制方式特殊的复制方式三、逆转录三、逆转录（
24、reverse transcription ） RNA指导的指导的DNA合成合成 1970年年， Temin、Mizufani、Baltimore同同时时分分别别从从致致癌癌RNA病病毒毒中中 发发 现现 RNA指指 导导 的的 DNA聚聚 合合 酶酶 逆逆 转转 录录 酶酶(reversetranscriptase)，有有利利地地证证明明了了Temin 于于1964年年提提出出的的前前病毒学说病毒学说 (previrus theory)。 （1975年获年获Nobel Prize） 前前病病毒毒学学说说：致致癌癌RNA病病毒毒的的复复制制需需经经过过一一个个DNA中中间间体体即即前前病病毒毒
25、，此此中中间间体体可可部部分分或或全全部部整整合合到到细细胞胞DNA中中，并并随随细细胞胞增增殖殖而而传传递至子代细胞，细胞的恶性转化就是由前病毒引起的。递至子代细胞，细胞的恶性转化就是由前病毒引起的。所所有有已已知知的的致致癌癌RNA病病毒毒都都含含有有逆逆转转录录酶酶，因因此此被被称称为为逆逆转转录录病病毒毒（retrovirus），基因组均由两条相同的（），基因组均由两条相同的（+）RNA链所组成。链所组成。逆转录酶是一种多功能酶，兼有逆转录酶是一种多功能酶，兼有3种酶活：种酶活：RNA指导的指导的DNA聚合酶活性聚合酶活性DNA指导的指导的DNA聚合酶活性聚合酶活性核糖核酸酶核糖核酸酶
26、H活性活性n1dATPn2dGTPn3dCTPn4dTTP+ RNA template dAMPn1dGMPn2dCMPn3dTMPn4DNADNA polymerasePrimer, Zn 2+(n1+n2+n3+n4)PPi逆逆转转录录：以以RNA为为模模板板在在逆逆转转录录酶酶的的催催化化下下合合成成与与其其碱碱基基互互补补的的DNA 的的过过程程。合合成成的的DNA称称cDNA (complementary DNA)。逆转录过程逆转录过程需要引物需要引物 (tRNA)两次转换模板两次转换模板Primer binding site, PBS Poly purine tract, PPT1
27、234/5RNA指导的指导的DNA聚合酶活性聚合酶活性核糖核酸酶核糖核酸酶H活性活性No 3 -5 proofreading1 error per 20,000faster rate of viral evolution6789/10Long terminal repeat, LTRDNA指导的指导的DNA聚合酶活性聚合酶活性逆逆转转录录现现象象并并不不仅仅限限于于病病毒毒。如如后后来来发发现现的的逆逆转转座座子子，表表明明逆逆转转录录过过程程在在细细胞胞中中频频繁繁发发生生。但但在在一一般般的的细细胞胞中中并并无无可可觉觉察察的的逆逆转转录录酶酶活活性性。其其实实端端粒粒酶酶就就是是一一种种
28、逆逆转转录录酶酶，其其活活性性只只存存在在于于胚胚胎胎和和肿肿瘤瘤细细胞胞中中，可可能能细细胞胞的的逆逆转转录录酶酶只只在在一一定定条条件件下下才才能能表表达达，这这也也是是细细胞胞染染色色体体遗遗传信息得以保持相对稳定的一个原因。传信息得以保持相对稳定的一个原因。OVER基因重组与基因重组与DNA“克隆克隆”genetic recombination and DNA clone基因重组基因重组(genetic recombination) ：染色体：染色体DNA分子内或分子间发生交换。分子内或分子间发生交换。自然界的基因转移和重组是无目的自然界的基因转移和重组是无目的基因工程有目的基因工程有
29、目的1865年年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验的豌豆杂交试验1944年年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验的肺炎球菌转化实验基因工程大事记基因工程大事记1973 Cohen第一例成功的克隆实验（美第一例成功的克隆实验（美斯坦福大学斯坦福大学）1978 Genentech公司公司 人胰岛素人胰岛素 世界上第一种基因工程蛋白世界上第一种基因工程蛋白药物药物 （美）（美） 1982 第一个基因工程药物第一个基因工程药物-重组人胰岛素在英、美获准使用重组人胰岛素在英、美获准使用 1985 第一批转基因家畜（兔、猪和羊），第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国水生所中国水生所 不育转不育转基因鱼
30、基因鱼1993 保鲜延熟型保鲜延熟型西红柿在美国上市西红柿在美国上市1999.9 中国获准加入人类基因组计划，负责测定人类基因组中国获准加入人类基因组计划，负责测定人类基因组全部序列的全部序列的1%2000.6.26 科学家公布人类基因组工作草图科学家公布人类基因组工作草图2001.2.11 公布人类基因组基本信息公布人类基因组基本信息克隆克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为获取同一拷贝的过程称为克隆化克隆化(cloning)，即无性繁殖。即无性繁殖。DNA克隆克隆DNA克隆克隆应应用用酶酶学学的的方方法法，在在体体外
31、外将将各各种种来来源源的的遗遗传传物物质质（同同源源的的或或异异源源的的、原原核核的的或或真真核核的的、天天然然的的或或人人工工的的DNA）与与载载体体DNA接接合合成成一一具具有有自自我我复复制制能能力力的的DNA分分子子，继继而而通通过过转转化化或或转转染染宿宿主主细细胞胞，筛筛选选出出含含有有目目的的基基因因的的转转化化子子细细胞胞，再再进进行行扩扩增增提提取取获获得得大大量量同同 一一 DNA分分 子子 ， 也也 称称 基基 因因 克克 隆隆 或或 重重 组组 DNA (recombinant DNA) 。 基因工程操作基因工程操作工具酶：工具酶：限制性核酸内切酶、限制性核酸内切酶、
32、DNA聚合酶聚合酶、 Taq DNA聚合聚合酶、逆转录酶、酶、逆转录酶、 T4DNA连接酶、连接酶、 碱性磷酸酶、碱性磷酸酶、 末端转移酶末端转移酶目的基因目的基因基因载体：基因载体：质粒质粒DNA、噬菌体、噬菌体DNA、病毒、病毒DNA受体（宿主）细胞受体（宿主）细胞基本过程：基本过程：目的基因获取、重组、转化（转染）、筛选、表达目的基因获取、重组、转化（转染）、筛选、表达基因克隆四大要素基因克隆四大要素目的基因的获取目的基因的获取1. 化学合成法化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列氨基酸序列 。2.基因组基因组DNA文库文库(
33、genomic DNA library)3. cDNA文库文库(cDNA library)4. 聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) mRNA cDNA 双链双链cDNA 重组重组DNA分子分子 cDNA文库文库 反转录酶反转录酶 载体载体 受体菌受体菌 复制复制* 从从cDNA文库获取目的基因文库获取目的基因 逆转录酶逆转录酶A A A A T T T T AAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T能自我复制能自我复制合适的限制性酶切位点合适的限制性酶切位点合适的筛选标记合适的筛选标记在细胞内拷贝数要多，使外源基在细胞内拷贝数要多，使外源基因得以扩增因得以扩增载体的相对分子质量要小，可容载体的相对分子质量要小，可容纳较大的外源纳较大的外源DNA插入片段。插入片段。在细胞内稳定性要高，保证重组在细胞内稳定性要高，保证重组体稳定传代而不易丢失。体稳定传代而不易丢失。 以以 质质 粒粒 为为 载载 体体 的的DNA 克克 隆隆 过过 程程
