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1、分子生物学实验分子生物学实验基本技术训练基本技术训练PCRPCR技术技术电泳技术电泳技术离心技术离心技术微量移液技术微量移液技术无菌操作技术无菌操作技术实验记录与实验报告的书写实验记录与实验报告的书写PCRPCR技术技术技术技术（多聚酶链式反应）（多聚酶链式反应）（多聚酶链式反应）（多聚酶链式反应） PCR是采用分子技术模拟核酸在是采用分子技术模拟核酸在体内的复体内的复制制，实现，实现DNA体外扩增体外扩增，以获得大量，以获得大量DNA片片段供研究需要。段供研究需要。 v94 4minv94 30S v50 30S 30个循环个循环v72 60S v72 10minv4 保存保存vEnd反应过
2、程：反应过程：型型 号：号：PTC-100PTC-100制造商：制造商：MJ ResearchMJ Research ( (美国美国) )电泳技术电泳技术电泳技术电泳技术（琼脂糖电泳）（琼脂糖电泳）（琼脂糖电泳）（琼脂糖电泳）分类：分类： 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳醋酸纤维膜电泳醋酸纤维膜电泳常用常用琼脂糖凝胶与聚丙烯酰胺凝胶的异同琼脂糖凝胶与聚丙烯酰胺凝胶的异同琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶聚合方式聚合方式物理作用物理作用化学反应化学反应电泳方式电泳方式平板平板垂直板垂直板毒性毒性无毒无毒神经毒性神经毒性适用对象适用对象大分子大分子小分
3、子小分子操作要求操作要求简单简单较难较难孔径孔径与浓度成反比与浓度成反比与浓度成反比与浓度成反比琼脂糖凝胶浓度与线性琼脂糖凝胶浓度与线性DNA的的最佳分辨范围最佳分辨范围琼脂糖浓度琼脂糖浓度线性线性DNA的最佳分辨范围（的最佳分辨范围（bp）0.5%1，00030，0000.7% 80012,0001.0% 50010,0001.2% 4007,0001.5% 2003,0002.0% 502,000 在在DNA双螺旋结构中碱基处于双螺旋结构双螺旋结构中碱基处于双螺旋结构的内部，呈平面结构，垂直于螺旋轴成对排列。的内部，呈平面结构，垂直于螺旋轴成对排列。糖基糖基磷酸脂基构成主链暴露在外表面，并
4、带磷酸脂基构成主链暴露在外表面，并带有磷酸脂基的负电荷。有磷酸脂基的负电荷。 DNA分子电泳时的迁分子电泳时的迁移速度与凝胶孔径和所带电荷量成正比，与分移速度与凝胶孔径和所带电荷量成正比，与分子大小成反比。子大小成反比。 操作过程操作过程v操作前的准备操作前的准备（1 1）标准分子质量标记（）标准分子质量标记（MarkerMarker） MarkerMarker是一组固定的分子量的样品混合物，经电泳后是一组固定的分子量的样品混合物，经电泳后各成分会按照分子量大小进行排列。标准分子质量标各成分会按照分子量大小进行排列。标准分子质量标记作为样品的参照标准应与样品同时电泳。如：记作为样品的参照标准应
5、与样品同时电泳。如：1Kb DNA Marker1Kb DNA Marker：10001000，20002000，30003000，40004000，50005000，60006000，70007000， 8000 8000，1000010000。 v样品缓冲液：样品缓冲液： 盐类（维持样品）、甘油（增加重量从而使样品下沉至盐类（维持样品）、甘油（增加重量从而使样品下沉至点样孔）、以及示踪染料（以便监测电泳进程）。例如点样孔）、以及示踪染料（以便监测电泳进程）。例如 6 6Loading BufferLoading Buffer：30%(v/v)30%(v/v)甘油，甘油，0.25%0.25%
6、（w/v) w/v) 溴溴酚蓝，酚蓝，0.25%0.25%（w/v)w/v)二甲苯腈蓝，蒸馏水配置。二甲苯腈蓝，蒸馏水配置。v电泳缓冲液：电泳缓冲液：凝胶中所加的缓冲液应该与电泳槽中的相一致凝胶中所加的缓冲液应该与电泳槽中的相一致琼脂糖凝胶电泳最常用的缓冲液是琼脂糖凝胶电泳最常用的缓冲液是TAE (Tris-TAE (Tris-醋酸醋酸EDTAEDTA）与）与TBE (Tris-TBE (Tris-硼酸硼酸EDTAEDTA）。）。v电源：稳压、稳流、稳功率。电源：稳压、稳流、稳功率。v样品制备样品制备（1 1）适用于琼脂糖电泳的样品可以是基因组）适用于琼脂糖电泳的样品可以是基因组DNADNA、
7、质粒和质粒和PCRPCR产物等大分子。产物等大分子。（2 2）样品必须与上样缓冲液混合均匀，以保证样品）样品必须与上样缓冲液混合均匀，以保证样品带电荷。带电荷。v琼脂糖凝胶的制备琼脂糖凝胶的制备（1 1）将铺胶槽调成）将铺胶槽调成水平水平。 （2 2）准确称取一定质量的琼脂糖放入锥形瓶中，）准确称取一定质量的琼脂糖放入锥形瓶中，量取量取30ml 30ml 1 1电泳缓冲液电泳缓冲液倒入锥形瓶，瓶口倒扣倒入锥形瓶，瓶口倒扣一个小烧杯。一个小烧杯。（3 3）将锥形放入微波炉中加热煮沸）将锥形放入微波炉中加热煮沸3 3次至琼脂糖全次至琼脂糖全部融化透明，摇匀。加热时避免凝胶溶液爆沸。部融化透明，摇匀
8、。加热时避免凝胶溶液爆沸。（4 4）待凝胶冷却至）待凝胶冷却至50506060时加入染料，混匀时加入染料，混匀后后匀速匀速倒入胶托中。倒胶时避免温度过低防止倒入胶托中。倒胶时避免温度过低防止凝胶凝固结块或出现气泡。若凝胶出现气泡则凝胶凝固结块或出现气泡。若凝胶出现气泡则不允许使用。不允许使用。（5 5）小心将梳子插在胶托中，待凝胶完全凝固）小心将梳子插在胶托中，待凝胶完全凝固后再拔出梳子。后再拔出梳子。（6 6）将凝胶放入电泳槽中，并向电泳槽中倒入）将凝胶放入电泳槽中，并向电泳槽中倒入1 1电泳缓冲液，液面高过胶面电泳缓冲液，液面高过胶面2 25mm5mm。v加样和电泳加样和电泳（）取一只（）
9、取一只PEPE手套，用移液器在上面点上上样手套，用移液器在上面点上上样缓冲液，然后取样品使其与上样缓冲液混合均匀缓冲液，然后取样品使其与上样缓冲液混合均匀点在胶孔中。点在胶孔中。 （）标准分子量标记直接点在胶孔中。（）标准分子量标记直接点在胶孔中。（）盖好电泳槽盖，正确连好导线。（）盖好电泳槽盖，正确连好导线。（4 4）在电泳时，为了获得电泳分离）在电泳时，为了获得电泳分离DNADNA的最大分的最大分辨率，电场强度不应高于辨率，电场强度不应高于5 V/cm5 V/cmv凝胶成像凝胶成像（）待前沿指示剂距凝胶前沿约（）待前沿指示剂距凝胶前沿约1cm1cm是停止电泳。是停止电泳。（）关闭电源，取出
10、凝胶，放入凝胶成像仪观察。（）关闭电源，取出凝胶，放入凝胶成像仪观察。v注意事项：注意事项：（）制胶槽要调成水平（）制胶槽要调成水平（）加样时移液器头不要插破胶孔。（）加样时移液器头不要插破胶孔。（）加样的体积不要大于胶孔的体积。（）加样的体积不要大于胶孔的体积。（）琼脂糖凝胶易于破碎，操作时要轻缓。（）琼脂糖凝胶易于破碎，操作时要轻缓。（）在电泳时，电泳缓冲液应略高于琼脂糖凝胶（）在电泳时，电泳缓冲液应略高于琼脂糖凝胶面，琼脂糖凝胶点样口应放在电泳槽负极一侧。面，琼脂糖凝胶点样口应放在电泳槽负极一侧。（6 6）不要用手直接接触凝胶及凝胶成像仪内部。）不要用手直接接触凝胶及凝胶成像仪内部。型型
11、 号：号：Power Pac Basic TMPower Pac Basic TM制造厂：制造厂：BIO-RADBIO-RAD型型 号：号：cheni geninscheni genins制造商：制造商：SYNGENESYNGENE （英国）（英国）未污染未污染 离心技术离心技术（高速冷冻离心机）（高速冷冻离心机） 离心机工作规则：离心机工作规则：1 1、检查离心管是否完好，不要使用有裂缝的离心管。、检查离心管是否完好，不要使用有裂缝的离心管。即使极小的裂缝也会在离心力作用下破裂。即使极小的裂缝也会在离心力作用下破裂。2 2、每次使用前都要检查转子中是否有别人遗留的离心、每次使用前都要检查转子
12、中是否有别人遗留的离心管。转子中遗留的离心管可能导致离心机不平衡。管。转子中遗留的离心管可能导致离心机不平衡。 3 3、将平衡的离心管对位放置，盖好转子盖。如果离心、将平衡的离心管对位放置，盖好转子盖。如果离心启动后发现转子盖没盖，应停止离心，盖上转子盖后启动后发现转子盖没盖，应停止离心，盖上转子盖后再启动。再启动。 4 4、离心完成后应立即从离心机内取走样品。离心结、离心完成后应立即从离心机内取走样品。离心结束后若样品长时间留在离心机里。会沉淀重新分束后若样品长时间留在离心机里。会沉淀重新分散开。散开。5.5.低温离心机在两次运行之间应关上盖子，以避免冷低温离心机在两次运行之间应关上盖子，以
13、避免冷凝。凝。6.6.每一次使用完离心机后都要将离心机内部清理干净每一次使用完离心机后都要将离心机内部清理干净并填写使用记录。并填写使用记录。型型 号：号：MiniSpinMiniSpin制造商：制造商：EppendorfEppendorf （德国）（德国）型型 号：号：3-18K3-18K制造商：制造商：SIGMASIGMA （德国）（德国）微量移液技术微量移液技术量液操作注意问题： （1 1）不能移取量程以外体积的液体，否则会损坏移液）不能移取量程以外体积的液体，否则会损坏移液器。器。（2 2）吸取液体时，先推至第一档在吸取；释放液体时，）吸取液体时，先推至第一档在吸取；释放液体时，在第一
14、档停顿在第一档停顿1-2s1-2s后推至终点。后推至终点。（3 3）吸取液体时不能太快。如果不小心将液体吸入吸）吸取液体时不能太快。如果不小心将液体吸入吸液杆应报告指导老师，经清洗后方可再用。液杆应报告指导老师，经清洗后方可再用。（4 4）使用完后，一定要将移液量调至最大量程，以免）使用完后，一定要将移液量调至最大量程，以免压缩弹簧导致弹簧不能回复。压缩弹簧导致弹簧不能回复。（5 5）移液器必须卸掉枪头后才能放在移液器架上。）移液器必须卸掉枪头后才能放在移液器架上。 各种酶等溶液的移取问题各种酶等溶液的移取问题 分子生物学中由于移取试剂体积较小可以分子生物学中由于移取试剂体积较小可以使用微量移
15、液器先将试剂（如引物使用微量移液器先将试剂（如引物, ,缓冲液等）缓冲液等）分别加到管壁上，加完之后通过点动离心分别加到管壁上，加完之后通过点动离心, ,使液使液体聚到管底，然后轻弹管底使之充分混匀。体聚到管底，然后轻弹管底使之充分混匀。 分子生物学反应体系中的酶要最后加入到体分子生物学反应体系中的酶要最后加入到体系中系中. .无菌操作技术无菌操作技术器材包扎器材包扎1 1、三角瓶至少留、三角瓶至少留1/31/3空间，先盖透气膜，后盖报空间，先盖透气膜，后盖报纸，线绳缠好。纸，线绳缠好。 培养时不能覆盖报纸，透气膜用完后回收。培养时不能覆盖报纸，透气膜用完后回收。2 2、枪头盒、枪头盒、EPE
16、P管盒、培养皿要用报纸包好。管盒、培养皿要用报纸包好。3 3、离心筒将盖旋紧后回旋半圈，报纸包扎。、离心筒将盖旋紧后回旋半圈，报纸包扎。灭菌灭菌 确认高压灭菌锅在打开前，其中的压力已确认高压灭菌锅在打开前，其中的压力已经回复到和周围环境的压力一致，打开的时候经回复到和周围环境的压力一致，打开的时候要缓慢，避免与溢出的蒸汽接触。要缓慢，避免与溢出的蒸汽接触。包扎物品（每包扎物品（每2人）人）1 1、枪头盒、枪头盒 3 3个个/ /套套2 2、EPEP管盒管盒 1 1个个 装两排装两排EPEP管，管，EPEP管不扣盖管不扣盖3 3、培养皿、培养皿 5 5个个/ /包包4 4、50ml50ml离心筒
17、离心筒 1 1个个两组带一套到无菌室1 1、进入无菌室要带鞋套；、进入无菌室要带鞋套；2 2、进入无菌室后对号入座，每两组共用一、进入无菌室后对号入座，每两组共用一个超净台；个超净台；3 3、所有用到的移液头和试剂瓶都必须是无、所有用到的移液头和试剂瓶都必须是无菌的；菌的； 每两组带一套已灭菌的枪头和每两组带一套已灭菌的枪头和EPEP管放管放到超净台中。到超净台中。4 4、把所有可能用到的东西都准备好、把所有可能用到的东西都准备好；无菌室使用规则无菌室使用规则5 5、微量移液器、离心管不可以在酒精灯上、微量移液器、离心管不可以在酒精灯上灼烧，但可以用酒精擦拭；灼烧，但可以用酒精擦拭；6 6、涂
18、布器要在在火焰上充分灼烧并冷却后、涂布器要在在火焰上充分灼烧并冷却后使用。使用。7 7、废弃物一定要放在废物缸中，火柴扔掉、废弃物一定要放在废物缸中，火柴扔掉之前要确保已经熄灭；之前要确保已经熄灭；8 8、确保整洁的工作环境，做完实验后收拾、确保整洁的工作环境，做完实验后收拾干净实验台，填写使用记录；干净实验台，填写使用记录；型型 号：号：innova4000innova4000制造商：制造商：N.B.SN.B.S（德国）（德国）实验记录与实验报告的实验记录与实验报告的书写书写实验记录的实验记录的 书写书写v如实记录如实记录v简明扼要简明扼要v无涂改无涂改v附在实验报告后附在实验报告后实验报告的实验报告的 书写书写v打印或手写均可打印或手写均可v字体、格式见字体、格式见“要求要求”v装订于实验记录前装订于实验记录前v遵守实验室的规则：遵守实验室的规则： 1. 1.不要在实验室内吃东西、喝水；不要在实验室内吃东西、喝水； 2. 2.实验结束后将实验台和超净台清理干净；实验结束后将实验台和超净台清理干净； 3. 3.核对仪器使用记录；核对仪器使用记录； 4. 4.检查实验用品。检查实验用品。
