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1、 第五章第五章 酶的蛋白质工程酶的蛋白质工程一、概念：一、概念： 蛋白质工程是以蛋白质工程是以创造性能创造性能更适用的蛋白质更适用的蛋白质分子为目的，以结构生物学与生物信息学为基分子为目的，以结构生物学与生物信息学为基础，以基因重组技术为主要手段，对天然蛋白础，以基因重组技术为主要手段，对天然蛋白质分子的设计和改造。质分子的设计和改造。1酶蛋白质工程二、蛋白质的功能基础二、蛋白质的功能基础 蛋白质的功能在很大程度上取决于其空间结构。蛋白质的功能在很大程度上取决于其空间结构。蛋白质结构测定蛋白质结构测定一级结构测定：一级结构测定：直接法：直接测定多肽链的氨基酸顺序。直接法：直接测定多肽链的氨基酸
2、顺序。间接法：从编码蛋白质的基因的核苷酸顺序来推导蛋白质的氨基酸间接法：从编码蛋白质的基因的核苷酸顺序来推导蛋白质的氨基酸顺序。顺序。三级结构测定：三级结构测定：X-X-射线晶体衍射射线晶体衍射研究处在晶体状态下的蛋白质的空间结构研究处在晶体状态下的蛋白质的空间结构核磁共振核磁共振(NMR)(NMR)光谱光谱研究处在溶液状态的蛋白质的结构。研究处在溶液状态的蛋白质的结构。2酶蛋白质工程 X-X-射线衍射技术：射线衍射技术： 用用于于蛋蛋白白质质及及核核酸酸三三维维结结构构的的确确定定，至至今今已已有数百种蛋白质的结构被确定。有数百种蛋白质的结构被确定。3酶蛋白质工程 三、蛋白质工程的主要手段三
3、、蛋白质工程的主要手段 以重组以重组DNADNA技术为核心的基因工程技术改造蛋白质。技术为核心的基因工程技术改造蛋白质。 位点特异性突变位点特异性突变基于结构生物学、信息生物学基于结构生物学、信息生物学 基因突变基因突变 随机突变随机突变基于基于高通量高通量筛选法筛选法 基因内部的剪接基因内部的剪接 基因剪接基因剪接 5 5或或 3 3端的剪接端的剪接4酶蛋白质工程四、蛋白质工程改造的实际应用四、蛋白质工程改造的实际应用 1.1.枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶 1 1）增强抗氧化性）增强抗氧化性 2 2）改变底物特异性）改变底物特异性 2.2.溶菌酶溶菌酶 1) 1)抗菌范围的扩大抗菌范围的扩大
4、 2) 2)热稳定性的提高热稳定性的提高5酶蛋白质工程 五、酶的稳定性五、酶的稳定性 1. 1.酶稳定的分子原因酶稳定的分子原因 1 1）共价键：）共价键： 肽键肽键（peptide bondpeptide bond） 稳定蛋白质和酶主链的核心力量。稳定蛋白质和酶主链的核心力量。 二硫键二硫键（disulfide bonddisulfide bond） 由两个由两个CysCys的侧链的侧链-SH-SH氧化而成，是某些蛋氧化而成，是某些蛋白质维持结构稳定性的主要因素。白质维持结构稳定性的主要因素。6酶蛋白质工程2 2）非共价键：）非共价键：疏水相互作用疏水相互作用（hydrophobic int
5、eractionhydrophobic interaction）: : 是维持蛋白质分子稳定的主要的作用力。是维持蛋白质分子稳定的主要的作用力。氢键氢键（hydrogen bondhydrogen bond）：）： 是稳定蛋白质分子的空间结构，特别是二级结构是稳定蛋白质分子的空间结构，特别是二级结构的重要力量。的重要力量。7酶蛋白质工程静电相互作用静电相互作用（electrostatic interactionelectrostatic interaction）：）： 又称离子键、盐键、盐桥，是正负电荷间的作用又称离子键、盐键、盐桥，是正负电荷间的作用力。对酶分子稳定性有关的盐键大部分形成于分
6、子表力。对酶分子稳定性有关的盐键大部分形成于分子表面上。面上。范德华力：范德华力： 在电中性分子之间的非共价结合。分子间形成的在电中性分子之间的非共价结合。分子间形成的范德华力越大越稳定。范德华力越大越稳定。金属离子：金属离子： Ca Ca2+2+、MgMg2+2+和和ZnZn2+2+等高价阳离子与多肽链不稳定的等高价阳离子与多肽链不稳定的弯曲部分结合，可显著增加酶分子的稳定性。弯曲部分结合，可显著增加酶分子的稳定性。8酶蛋白质工程途径途径方法方法优点优点不足不足酶酶分分子子改改造造核酸水平核酸水平蛋白质工程蛋白质工程从根本上提高酶分从根本上提高酶分子稳定性子稳定性操作复杂，周操作复杂，周期长
7、期长蛋白质水平蛋白质水平化学修饰化学修饰适应所有酶，操作适应所有酶，操作简单经济简单经济修饰过程破坏修饰过程破坏酶分子酶分子剂型剂型固定化固定化适应所有酶，稳定适应所有酶，稳定性高，可重复利用性高，可重复利用和连续生产和连续生产载量较低，易载量较低，易失活失活交联酶晶体交联酶晶体 稳定性好，载量高，稳定性好，载量高，催化效率高催化效率高成本高成本高微环境改良微环境改良稳定剂稳定剂简单、经济简单、经济工作量大工作量大反应介质反应介质适用于特殊反应体适用于特殊反应体系和酶类系和酶类适合的酶类还适合的酶类还不普遍不普遍2. 2. 稳定酶的方法稳定酶的方法9酶蛋白质工程思考题： 什么是酶的蛋白质工程什么是酶的蛋白质工程10酶蛋白质工程
