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1、生物化学实验1生物化学实验内容生物化学实验内容1、 醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白质2、双缩脲测定蛋白质的含量、双缩脲测定蛋白质的含量3、 血液葡萄糖的测定血液葡萄糖的测定4、 牛乳酪蛋白提取与鉴定牛乳酪蛋白提取与鉴定5、 维生素维生素C的提取与含量的测定的提取与含量的测定6、 琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制7、 酶的基本性质酶的基本性质 要求：课前预习，试验中做记录，课后写实验报告。要求：课前预习，试验中做记录，课后写实验报告。 两人一组，离开实验室时签字。两人一组，离开实验室时签字。2实验一实验一 血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳血清蛋白质醋酸纤
2、维薄膜电泳一、目的：一、目的： 了解电泳技术基本原理，掌握醋酸纤维薄膜电泳操作技了解电泳技术基本原理，掌握醋酸纤维薄膜电泳操作技术。术。二、原理：二、原理： 蛋白质是两性电解质，在非等电点状态下在电场中会向蛋白质是两性电解质，在非等电点状态下在电场中会向一定电极移动。在碱性条件下多数蛋白质带负电荷，在电一定电极移动。在碱性条件下多数蛋白质带负电荷，在电场中向正极移动场中向正极移动 ， 不同蛋白质由于大小、所带电荷及形不同蛋白质由于大小、所带电荷及形状不同，在电场中的迁移率不同，经过电泳可将其分开，状不同，在电场中的迁移率不同，经过电泳可将其分开，结果经染色、漂洗，得电泳图谱。结果经染色、漂洗，
3、得电泳图谱。材料材料 ：血清：血清3 pH8.6 巴比妥缓冲液巴比妥缓冲液 滤纸吸去膜上液体滤纸吸去膜上液体醋酸醋酸 浸泡浸泡点样点样纤维薄膜纤维薄膜 10min 沾血清点在无光泽面上沾血清点在无光泽面上2mA/条膜条膜 染色液染色液 漂洗液漂洗液 电泳电泳 染色染色 漂洗漂洗 40min 5min 浸泡漂洗数次浸泡漂洗数次 观察电泳谱带观察电泳谱带电泳槽示意图滤纸桥+点样处+醋酸纤维薄膜电泳图谱薄膜 点样端三、步骤：三、步骤：4电泳装置5点样67891011实验二实验二 双缩脲测定蛋白质含量双缩脲测定蛋白质含量 一、实验目的一、实验目的 掌握双缩脲测定蛋白质的方法和原理掌握双缩脲测定蛋白质的
4、方法和原理 二、实验原理二、实验原理 双缩脲在碱性溶液中与双缩脲在碱性溶液中与CuCu2+2+产生产生紫色的络合物紫色的络合物, ,这这一反应称一反应称“双缩脲反应双缩脲反应”。蛋白质分子中肽键，也。蛋白质分子中肽键，也能与能与CuCu2+2+ 发生双缩脲反应，溶液紫色的深浅与蛋白发生双缩脲反应，溶液紫色的深浅与蛋白质含量在一定范围内成正比，而与蛋白质的氨基酸质含量在一定范围内成正比，而与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关。该紫色的络合物在组成及分子量无关。该紫色的络合物在580nm580nm处有处有最大吸收值。最大吸收值。 12三、实验步骤三、实验步骤1 1、标准曲线制作、标准曲线制作（已制好）
5、（已制好）2 2、样品测定、样品测定编号编号1 12 23 3豆粉（豆粉（g g）0 00.10000.10000.10000.1000碳酸铜（碳酸铜（g g）1.001.001.001.001.001.00无水乙醇（无水乙醇（mlml）202020.0020.0020.0020.0010%KOH10%KOH（mlml）202020.0020.0020.0020.00振荡振荡10min10min，静置片刻，将上清过滤后，静置片刻，将上清过滤后580nm580nm测定吸光值测定吸光值ODOD540540标线上查出的标线上查出的PrPr的量的量133 3、结果计算、结果计算 100100= =豆粉
6、（豆粉（g g）样品蛋白质样品蛋白质含量（含量（% %）标准曲线上查得蛋白质含量（标准曲线上查得蛋白质含量（g）1415161718实验三实验三 血液葡萄糖的测定血液葡萄糖的测定 一、实验目的一、实验目的 学习和掌握学习和掌握Folin-Folin-吴宪法测定血糖的方法吴宪法测定血糖的方法二、实验原理二、实验原理G Cu2+碱性碱性氧化亚铜氧化亚铜 磷钼酸磷钼酸 钼蓝钼蓝 420nm处有大吸收峰处有大吸收峰19三、实验步骤三、实验步骤 血糖血糖试剂（试剂（mlml）空白管空白管低浓度标准管低浓度标准管高浓度标准管高浓度标准管测定管测定管无蛋白血滤液无蛋白血滤液蒸馏水蒸馏水标准葡萄糖应用液标准葡
7、萄糖应用液碱性铜试剂碱性铜试剂2.02.02.02.01.01.01.01.02.02.02.02.02.02.0 1.0 1.0 1.0 1.0 2.0 2.0 混匀，置沸水浴中煮混匀，置沸水浴中煮8 8分钟，取出，用流动的自来水冷却分钟，取出，用流动的自来水冷却3 3分钟分钟 （切勿摇动血糖管）（切勿摇动血糖管）磷钼酸试剂磷钼酸试剂 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.01 1：4 4磷钼酸溶液加磷钼酸溶液加至至2525252525252525ODOD42042020测定管光密度测定管光密度 100 100 0.2 = 0.2 =葡萄糖葡萄糖mg/100ml 标准管
8、光密度标准管光密度 0.1 0.1高标准管：高标准管：低标准管：低标准管： 0.1 = 0.1 =葡萄糖葡萄糖mg/100ml 标准管光密度标准管光密度 0.1 0.1测定管光密度测定管光密度 100 100四、计算四、计算21实验四实验四 牛奶中蛋白质的提取与鉴定牛奶中蛋白质的提取与鉴定 一、实验目的一、实验目的 学习从牛奶中制备酪蛋白的方法并学习从牛奶中制备酪蛋白的方法并进行鉴定试验进行鉴定试验二、实验原理二、实验原理 蛋白质等电点蛋白质等电点 沉淀沉淀三、实验步骤三、实验步骤 1 1、酪蛋白的制备、酪蛋白的制备22鲜牛乳鲜牛乳3Oml3Oml（4040）+3Om+3Om醋酸缓冲液（醋酸缓
9、冲液（4040）边加边摇动边加边摇动离心离心3000r/5min冷却至室温，继续放置冷却至室温，继续放置5分钟分钟清液（乳清）清液（乳清） 沉淀沉淀加热观察现象加热观察现象 醇醇醚混合物洗醚混合物洗2 2次次 沉淀沉淀清液清液晾干，鉴定晾干，鉴定弃掉弃掉232 2、酪蛋白的性质鉴定、酪蛋白的性质鉴定 （1 1）溶解度观察）溶解度观察 溶液溶液H H2 2O O10%NaCl 10%NaCl 0.5%Na0.5%Na2 2COCO3 30.1M NaOH 0.1M NaOH 0.2%HCl0.2%HCl饱和饱和Ca(OH)Ca(OH)2 2试剂量试剂量2ml2ml2ml2ml2ml2ml2ml2
10、ml2ml2ml2ml2ml酪蛋白酪蛋白少许少许少许少许少许少许少许少许少许少许少许少许溶解情况溶解情况24 2.2.米伦反应：米伦反应： 少许酪蛋白少许酪蛋白+lml H2O+lml H2O+米伦试剂米伦试剂1010滴，滴， 振摇，加热振摇，加热 观察其颜色变化观察其颜色变化3.3.含硫含硫 ( (胱氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸胱氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸) )测定测定: :少量酪蛋白少量酪蛋白+lmlO.1M NaOH+ 5%+lmlO.1M NaOH+ 5%醋酸铅醋酸铅1-31-3滴滴 观察现象观察现象煮沸煮沸2526272829实验五实验五 维生素维生素C C的定量测定的定量测定（2 2，6-6
11、-二氯酚靛酚滴定法）二氯酚靛酚滴定法） 一、实验目的一、实验目的 掌握滴定法测定掌握滴定法测定VcVc含量的原理和操作。含量的原理和操作。二、实验原理二、实验原理 30三、实验步骤三、实验步骤1.提取提取: 2.0克松针（克松针（2份）份）+少量少量 2%草酸草酸 匀浆匀浆 过滤后用过滤后用2%草酸定容到草酸定容到50毫升毫升 （也可先定容后过滤或离心）（也可先定容后过滤或离心）312、滴定、滴定（1）标定染料（标准维生素）标定染料（标准维生素C液滴定）：准确吸取标准维液滴定）：准确吸取标准维生素生素C溶液溶液10毫升（含毫升（含1.0毫克维生素毫克维生素C）置）置100毫升锥形瓶毫升锥形瓶中
12、，用微量滴定管以中，用微量滴定管以0.1%2，6一二氯酚靛酚滴至淡红色出一二氯酚靛酚滴至淡红色出现，现，15秒钟不退色即为滴定终点。记录所用染料体积计算秒钟不退色即为滴定终点。记录所用染料体积计算出出1毫升染料相当于多少毫克维生素毫升染料相当于多少毫克维生素C（K值），即值），即1/染料染料ml。(2)样液滴定样液滴定:准确吸取滤液准确吸取滤液10毫升放人毫升放人100毫升锥形瓶内，毫升锥形瓶内，滴定方法同前滴定方法同前(做两次平行试验做两次平行试验)，记录染料体积。，记录染料体积。(3)空白液滴定：准确吸取空白液滴定：准确吸取10毫升毫升2%草酸溶液，放入草酸溶液，放入100毫毫升锥形瓶中，
13、用上述方法滴定至终点，记录所用染料体积。升锥形瓶中，用上述方法滴定至终点，记录所用染料体积。（滴定过程宜迅速，一般不超过（滴定过程宜迅速，一般不超过2分钟）分钟）32X =（V1V2）KV WV3100X ：100克样品所含维生素克样品所含维生素C毫克数毫克数W ：称取样品毫克数：称取样品毫克数V1：滴定样品所用染料毫升数：滴定样品所用染料毫升数V2：滴定空白所用染料毫升数：滴定空白所用染料毫升数V3：样品测定时所用滤液毫升数（即：样品测定时所用滤液毫升数（即10毫升）毫升）V ：样品提取液稀释至总体积（即：样品提取液稀释至总体积（即50毫升）毫升）K ：1毫升染料所能氧化维生素毫升染料所能氧
14、化维生素C之毫克数，可由标定之毫克数，可由标定算出算出3、计算、计算333435实验六实验六 琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制的观察琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制的观察一、实验目的 了解琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制剂对其活性的抑制。二、实验原理甲烯白甲烯白 琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶延胡索酸延胡索酸 琥珀酸琥珀酸甲烯蓝甲烯蓝 NAD+NADH无氧无氧丙二酸丙二酸36三、实验步骤三、实验步骤1 1、酶的制备、酶的制备 猪心猪心1.52g +1/15M磷酸氢二钠溶液磷酸氢二钠溶液34ml 匀浆匀浆 1/15M磷酸氢二钠溶液磷酸氢二钠溶液67ml，放置，放置30min 2000r/min 离心离
15、心10min，取上清备用。，取上清备用。37试管管号号心心脏提取提取液（滴）液（滴）1.5%琥珀酸琥珀酸钠（滴）（滴）1%丙二酸丙二酸钠（滴）（滴）蒸蒸馏水水（滴）（滴）0.02%甲甲烯蓝（滴）（滴）现象象15525225（煮沸）（煮沸）52523555202452552 加好混匀，立即在各管中加入一层（约加好混匀，立即在各管中加入一层（约8滴）液体石蜡油，置滴）液体石蜡油，置37度恒温水浴保温度恒温水浴保温30分，观察各管颜色变化，分析原因。然后用力分，观察各管颜色变化，分析原因。然后用力振摇振摇1号管，观察变化记录并解释。号管，观察变化记录并解释。2、酶促反应、酶促反应38实验一、温度、实
16、验一、温度、pHpH及酶的激活剂、抑制剂对及酶的激活剂、抑制剂对酶活性的影响酶活性的影响一、目的一、目的： 了解酶催化的特异性以及了解酶催化的特异性以及pHpH、温度、抑制剂和激活剂对酶、温度、抑制剂和激活剂对酶活力的影响活力的影响 二、实验原理二、实验原理 以唾液淀粉酶为例，观察温度、以唾液淀粉酶为例，观察温度、pH、激活剂和抑制剂对、激活剂和抑制剂对其活性的影响。唾液淀粉酶可水解淀粉生成糊精、麦芽糖、其活性的影响。唾液淀粉酶可水解淀粉生成糊精、麦芽糖、葡萄糖等物质。淀粉遇碘呈呈蓝色。糊精按分子从大到小的葡萄糖等物质。淀粉遇碘呈呈蓝色。糊精按分子从大到小的顺序，遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色和红
17、色顺序，遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色和红色;最小的糊精和麦最小的糊精和麦芽糖遇碘不呈现颜色反应。芽糖遇碘不呈现颜色反应。 酶具有极高的催化效率，过氧化氢酶比铁粉的催化效率酶具有极高的催化效率，过氧化氢酶比铁粉的催化效率高出许多倍。高出许多倍。39三、操作步骤三、操作步骤（一）温度对酶活性的影响（一）温度对酶活性的影响 （唾液淀粉酶的制备：取漱口水唾液淀粉酶的制备：取漱口水0.5Ml，稀释至稀释至50ml，以下简称酶液），以下简称酶液） 1、 取3支试管，编号后按下表操作 2、在比色板上，置碘液、在比色板上，置碘液2滴于各孔中，每隔滴于各孔中，每隔1分钟，从第二分钟，从第二管中取出反应液管中取出反
18、应液1滴与碘混合，观察颜色变化。滴与碘混合，观察颜色变化。 3、待第二管中反应液遇碘不发生颜色变化时，向各管中加、待第二管中反应液遇碘不发生颜色变化时，向各管中加入碘液入碘液1滴，摇匀，观察并记录各管颜色，做出解释。滴，摇匀，观察并记录各管颜色，做出解释。 试试管号管号0.5%淀粉溶液淀粉溶液稀稀释释酶酶液液温度（温度（10min)现现象象1235ml5ml5ml1ml1ml1ml0水浴水浴37水浴水浴沸水浴沸水浴40管号管号1230.5%淀粉淀粉222 pHpH 5.02pH 6.82pH 8.22稀释唾液（滴）稀释唾液（滴）101010现象现象 二、二、pH对酶活性的影响对酶活性的影响 取
19、试管取试管5支，编号，支，编号， 按下表操作。按下表操作。 摇匀，摇匀，37水浴中保温。每隔水浴中保温。每隔l分钟从分钟从pH 6.8的管中（的管中（2号）号）取出取出1滴于白瓷板上，加碘液滴于白瓷板上，加碘液1滴，观察淀粉水解的程度。待滴，观察淀粉水解的程度。待颜色不变时，向各管中加碘液颜色不变时，向各管中加碘液1-3滴。观察颜色，比较水解程滴。观察颜色，比较水解程度，做出解释。度，做出解释。41三、酶的激活剂、抑制剂对酶活性的影响三、酶的激活剂、抑制剂对酶活性的影响 （氯离子是唾液淀粉酶的激活剂，铜离子是抑制剂）：取小试管3支，按表操作 试管号试管号0.5%淀粉淀粉1%CuSO40.5%N
20、aCl蒸馏水蒸馏水稀释唾液稀释唾液结果结果1232ml2ml2ml1 ml0001ml0001ml1 ml1 ml1 ml 将将3支试管放入支试管放入37水浴中，在比色板上用碘液检查第水浴中，在比色板上用碘液检查第2管，待不变色时向各管中加碘液管，待不变色时向各管中加碘液1滴，记录颜色并解释。滴，记录颜色并解释。42四、酶的高效性四、酶的高效性 酶具有极高的催化效率，比普通催化剂活性高出很多倍。酶具有极高的催化效率，比普通催化剂活性高出很多倍。过氧化氢酶能催化过氧化氢分解为二氧化碳和水，铁粉也过氧化氢酶能催化过氧化氢分解为二氧化碳和水，铁粉也能催化此反应，但二者的催化效率有很大差距。取小试管能
21、催化此反应，但二者的催化效率有很大差距。取小试管4支，编号，按下表操作。支，编号，按下表操作。 试管号试管号12342%H2O2（ml）3333生马铃薯生马铃薯少许少许熟马铃薯熟马铃薯少许少许铁粉铁粉少许少许现象现象解释解释43恒温水浴锅44电磁炉水浴锅45电子天平46需冷藏、冷冻试剂和材料放在冰柜和冰箱47注意 生物材料及试剂在冰箱中，取完放回原处。 请勿将固体物质扔进水槽，台面上有垃圾盆。 水槽上有蒸馏水管，节约使用。 用过器皿立即用水洗净。 做完实验清理台面，将实验用具清洗后放入洗涤柜。48实验报告一、目的二、原理（必须写清楚！）三、实验材料四、实验步骤五、结果与分析标出正负极，说明从正极到负极的条带依次是.。-+49
